CYP2C18基因多態(tài)性對瓣膜置換術(shù)后服用華法林劑量的影響研究*

劉寅強，歐陽培剛，羅 康，張學(xué)玉，張桂敏

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟大血管外科 650032)

論著·臨床研究

CYP2C18基因多態(tài)性對瓣膜置換術(shù)后服用華法林劑量的影響研究*

劉寅強，歐陽培剛，羅 康，張學(xué)玉，張桂敏

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟大血管外科 650032)

目的探討云貴高原漢族人群細胞色素P450(CYP)2C18、維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位1(VKORC1)、CYP2C9的基因型分布情況及其基因多態(tài)性與華法林穩(wěn)定劑量的相關(guān)性。方法以2011年1月至2014年1月在該院行瓣膜置換術(shù)后持續(xù)服用華法林抗凝治療的云貴高原漢族患者176例為研究對象，采集靜脈血檢測各位點基因型，分析基因型及等位基因頻率分布，以及基因多態(tài)性與華法林穩(wěn)定劑量的相關(guān)性。結(jié)果各位點基因型及等位基因頻率分布均符合Hardy-Winberg遺傳平衡(P>0.05)；CYP2C18(rs7896133)、VKORC1(rs9923231)、CYP2C9(rs1057910)、CYP2C9(rs4086116)基因位點的基因多態(tài)性與華法林穩(wěn)定劑量相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論云貴高原漢族患者CYP2C18(rs7896133)、VKORC1(rs9923231)、CYP2C9(rs1057910)、CYP2C9(rs4086116)基因多態(tài)性可能是華法林穩(wěn)定劑量個體差異的影響因素。

多態(tài)性，單核苷酸；華法林；瓣膜置換術(shù)；CYP2C18

華法林是治療許多心血管疾病的一線抗凝藥物，特別對于瓣膜置換患者而言,目前仍然是首選的瓣膜術(shù)后長期口服抗凝藥物。但華法林的藥效存在明顯的個體差異，服藥中會出現(xiàn)抗凝過量出血或抗凝不足致血栓形成等嚴重并發(fā)癥[1-2]。近年的研究認為，某些相關(guān)基因的多態(tài)性是決定其藥效個體差異的主要原因[3-4]。國內(nèi)外研究表明，維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位1(VKORC1)、細胞色素P450(CYP)2C9基因多態(tài)性與華法林用藥劑量的個體差異密切相關(guān)[5-8]，但對于云貴高原地區(qū)的漢族人群，CYP2C18基因多態(tài)性的相關(guān)研究則較少。為了解CYP2C18等位基因及基因型在高原漢族人群中的分布頻率，以及其基因多態(tài)性對華法林穩(wěn)定劑量的影響，筆者對中國云貴高原漢族人群上述各位點基因多態(tài)性進行分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 以176例云貴高原地區(qū)漢族患者為研究對象，患者均于2011年1月至2014年1月在本院心臟大血管外科行瓣膜置換術(shù)，其中雙瓣置換術(shù)60例、主動脈瓣置換術(shù)52例、二尖瓣置換術(shù)64例，術(shù)后均以華法林作為口服抗凝藥持續(xù)治療3個月以上?；颊咂骄砀?1.64±0.71)m，平均年齡(44.44±12.33)歲，平均體質(zhì)量(59.19±11.03)kg，其中男82例、女94例。以國際標(biāo)準比值(INR)1.5～2.5作為抗凝強度標(biāo)準，所有患者隨訪3～24個月；兩次復(fù)查INR值達到預(yù)定抗凝標(biāo)準，記錄華法林日維持劑量、凝血酶原時間(PT)、INR值等指標(biāo)。入選患者均未服用影響華法林療效指標(biāo)的藥物，肝腎功能指標(biāo)均無異常[2，4]。本研究通過昆明醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審核，并取得患者知情同意。

1.2方法

1.2.1樣品采集與DNA提取 采集患者靜脈血3 mL，置于枸櫞酸鈉抗凝管中，全血3 000 r/min離心10 min，棄上層血漿，沉淀細胞，分裝，基因組試劑盒提取DNA，-20 ℃保存。

1.2.2Snapshot技術(shù)基因測序 明確基因位點，設(shè)計引物擴增位點片段，引物由上海捷瑞公司合成。PCR儀型號為：東勝·龍(EDC-810)；taq酶、DNTP為Fermentas公司產(chǎn)品。多重PCR反應(yīng)體系含1 μL模板DNA，1.5 μL 25 mmol/L氯化鎂(MgCl2)，1.5 μL 10×緩沖液，0.3 μL DNTP，0.3 μL Taq聚合酶，0.15 μL引物混合，補水至15 μL。擴增條件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s ，-0.5 ℃，11個循環(huán)；72 ℃ 30 s，94 ℃ 15 s，54 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，24個循環(huán)，擴增后取3 μL PCR產(chǎn)物用ExoI和Sap純化，主要去除反應(yīng)產(chǎn)物中的引物及DNTP。37 ℃ 45 min，80 ℃ 15 min，純化后進行延伸反應(yīng)，預(yù)先混入延伸引物。延伸反應(yīng)體系：Snapshot Mix試劑1 μL，PCR產(chǎn)物2 μL，延伸引物混合2 μL，補水至6 μL，96 ℃ 1 min，96 ℃ 10 s，52 ℃ 5 s，30個循環(huán)。取1 μL延伸產(chǎn)物，加8 μL上樣，95 ℃變性3 min，立即冰水浴[2，4]。研究隨機抽取10%樣品進行重復(fù)檢驗。測序儀型號為ABI 3730XL。

2 結(jié) 果

2.1等位基因和基因型分布頻率 患者等位基因頻率和基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，見表1。

表1 瓣膜置換術(shù)患者基因型與等位基因頻率 [n=176,n(%)]

2.2基因多態(tài)性與華法林穩(wěn)定劑量的相關(guān)性 VKORC1(rs9923231)、CYP2C9(rs1057910)、CYP2C9(rs4086116)、CYP2C18(rs7896133)相同基因位點不同基因型華法林穩(wěn)定劑量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。華法林穩(wěn)定劑量與VKORC1(rs9923231)、CYP2C9(rs1057910)、CYP2C9(rs4086116)、CYP2C18(rs7896133)基因位點相關(guān)(P<0.05)，見表3。

基因型n華法林穩(wěn)定劑量(mg/d)PVKORC1(rs9923231)0.000 AA1382.90±0.84 AG363.69±1.12 GG24.00±0.00CYP2C9(rs1057910)0.002 AA1583.12±0.96 AC182.36±0.95CYP2C9(rs4086116)0.044 CC1383.14±0.93 CT342.74±1.13 TT42.19±0.36CYP2C18(rs1998591)0.155 CC602.90±0.98 CT903.08±0.86 TT263.21±1.36CYP2C18(rs7896133)0.043 GG1403.13±0.94 AG322.78±1.15 AA42.18±0.36

表3 基因多態(tài)性與華法林穩(wěn)定劑量的單因素相關(guān)性分析

3 討 論

機械瓣膜置換患者術(shù)后需要終生口服華法林進行抗凝治療，但華法林治療窗窄，個體用藥差異大，容易導(dǎo)致出血栓塞等嚴重并發(fā)癥。近年來國內(nèi)外研究表明，基因多態(tài)性與華法林劑量有重要的相關(guān)性[3-4]。目前，國內(nèi)研究主要集中在VKORC1和CYP2C9兩個基因位點，對云貴高原漢族人群CYP2C18的相關(guān)研究較少。

本研究對云貴高原漢族人群CYP2C18(rs7896133)、CYP2C18(rs1998591)、VKORC1(rs9923231)、CYP2C9(rs4086116)、CYP2C9(rs1057910)各基因位點的多態(tài)性，及其與華法林穩(wěn)定劑量的相關(guān)性進行分析。結(jié)果顯示，等位基因頻率和基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。其中VKORC1、CYP2C9基因型及其分布頻率國內(nèi)外已有大量研究，亞裔人群中其基因型及基因分布頻率與本次研究結(jié)果基本一致[9-11]，證實云貴高原漢族人群上述基因位點基因多態(tài)性無特殊變異。其中CYP2C18(rs7896133) AA、AG、GG各基因型頻率分別為2.3%、18.2%、79.5%，G和A等位基因頻率分別為88.6%、11.4%，A為次要等位基因，其次要等位基因頻率高于文獻[12]報道的歐美人群CYP2C18(rs7896133)次要等位基因頻率(5.6%)，以及文獻[13]報道的中國臺灣地區(qū)人群該基因位點次要等位基因頻率(7.1%)。其中，云貴高原地區(qū)漢族人群與歐美人群基因變異的差異性大于與中國臺灣地區(qū)人群比較，表明高原地區(qū)漢族人群的基因變異可能既與種族差異有關(guān)，也與海拔高度、環(huán)境因素及生活方式等因素相關(guān)，影響因素越多，其差異性可能越大。本研究結(jié)果還顯示，CYP2C18(rs1998591) TT、CT、CC基因型分布頻率分別為14.8%、51.1%、34.1%，C和T等位基因頻率分別為59.7%、40.3%，T為次要等位基因。目前，對CYP2C18(rs1998591)基因多態(tài)性的研究國內(nèi)外均較少，本研究以云貴高原漢族人群為研究對象探討該基因位點多態(tài)性，補充了該基因位點多態(tài)性研究在云貴高原漢族人群的資料。

VKORC1、CYP2C9等基因國內(nèi)外已經(jīng)有大量研究，其基因多態(tài)性與華法林日維持劑量相關(guān)[9-11]，與本研究結(jié)果基本一致。經(jīng)過基因測序發(fā)現(xiàn)，CYP2C18(rs1998591)的基因多態(tài)性與華法林穩(wěn)定劑量無明顯相關(guān)性(P>0.05)。而CYP2C18(rs7896133)基因位點GG、AG、AA基因型華法林穩(wěn)定劑量分別為(3.13±0.94)、(2.78±1.15)、(2.18±0.36)mg/d，其中AA基因型華法林日穩(wěn)定劑量低于AG及GG基因型，GG基因型華法林日穩(wěn)定劑量最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，CYP2C18(rs7896133)基因多態(tài)性與華法林日穩(wěn)定劑量相關(guān)(P<0.05)，該位點可以解釋3.6%的華法林劑量差異，G基因突變與華法林高劑量相關(guān)，A基因突變與華法林低劑量相關(guān)。Wadelius等[12]報道，單因素分析顯示在歐美人群中該位點可解釋7.4%的華法林劑量差異(P<0.01)，可以看出歐美人群CYP2C18(rs7896133)位點對華法林穩(wěn)定劑量可能有更大的影響，這可能與種族差異相關(guān)。Lee等[13]對中國臺灣人群研究顯示，A基因型突變與華法林低劑量相關(guān)，而G基因型突變與華法林高劑量相關(guān)，與本研究云貴高原地區(qū)漢族人群具有一致性，亦表明CYP2C18(rs7896133)基因多態(tài)性是導(dǎo)致華法林穩(wěn)定劑量差異的影響因素，并且在平原與高原地區(qū)亞裔人群均存在。對CYP2C18(rs1998591)基因測序發(fā)現(xiàn)，云貴高原漢族人群該位點基因多態(tài)性對華法林穩(wěn)定劑量無明顯影響。

CYP2C18源自于CYP2家族，CYP2參與華法林的體內(nèi)代謝活動，其活性降低可以減緩華法林的體內(nèi)代謝，導(dǎo)致華法林在體內(nèi)的有效血藥濃度升高，從而增強其抗凝效果[5-6，14]。本研究初步得出云貴高原漢族人群CYP2C18(rs7896133)、VKORC1(rs9923231)、CYP2C9(rs4086116)、CYP2C9(rs1057910)基因多態(tài)性與華法林穩(wěn)定劑量的差異相關(guān)，可能是導(dǎo)致個體間華法林穩(wěn)定劑量差異的重要因素。但由于本研究觀察時間有限且樣本量較小，還需要擴大樣本量并延長觀察時間，以進一步明確研究結(jié)果。

[1]Holbrook A，Schulman S，Witt DM，et al．Evidence-based management of anticoagulant therapy:antithrombotic therapy and prevention of thrombosis,9th ed:American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines[J]．Chest，2012，141(2 Suppl)：S152-184.

[2]劉寅強，楊百暉，夏建明，等．GGCX(rs6738645)基因多態(tài)性與華法林穩(wěn)定劑量的關(guān)系[J]．重慶醫(yī)學(xué)，2014，43(10)：1184-1186．

[3]Danese E，Montagnana M，Johnson JA，et al．Impact of the CYP4F2 p.V433M polymorphism on coumarin dose requirement:systematic review and meta-analysis[J]．Clin Pharmacol Ther，2012，92(6)：746-756.

[4]劉寅強，楊百暉，夏建明，等．鈣腔蛋白(rs2290228)基因多態(tài)性與華法林穩(wěn)定劑量的關(guān)系[J]．天津醫(yī)藥，2013，41(4)：304-306．

[5]Qiu JX，Zhou ZW，He ZX，et al．Estimation of the binding modes with important human cytochrome P450 enzymes,drug interaction potential,pharmacokinetics,and hepatotoxicity of ginger components using molecular docking,computational,and pharmacokinetic modeling studies[J]．Drug Des Devel Ther，2015，9：841-866．

[6]Yang Y，Peter I，Scott SA．Pharmacogenetics in Jewish populations[J]．Drug Metabol Drug Interact，2014，29(4)：221-233.

[7]Lund K，Gaffney D，Spooner R，et al．Polymorphisms in VKORC1 have more impact than CYP2C9 polymorphisms on early warfarin International Normalized Ratio control and bleeding rates[J]．Br J Haematol，2012，158(2)：256-261.

[8]Huang SW，Xiang DK，Huang L，et al．Influence of GGCX genotype on warfarin dose requirements in Chinese patients[J]．Thromb Res，2011，127(2)：131-134.

[9]劉建興，李文慧，陳智豫，等．云南漢族人群VKORCI 3730A/G基因多態(tài)性與華法林抗凝治療維持劑量的相關(guān)性[J]．廣東醫(yī)學(xué)，2012，33(20)：3073-3076．

[10]胡靜，朱君榮，于鋒．華法林抗凝個體化治療研究進展[J]．中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2014，19(3)：591-595．

[11]孟彥宏，賈政，趙磊．VKORCI基因多態(tài)性的檢測及其與華法林穩(wěn)定劑量的相關(guān)性[J]．陜西醫(yī)學(xué)雜志，2014，43(12)：1576-1578．

[12]Wadelius M，Chen LY，Eriksson N，et al．Association of warfarin dose with genes involved in its action and metabolism[J]．Hum Genet，2007，121(1)：23-34.

[13]Lee MT，Chen CH，Chou CH，et al．Genetic determinants of warfarin dosing in the Han-Chinese population[J]．Pharmacogenomics，2009，10(12)：1905-1913.

[14]Kim SY，Kang JY，Hartman JH，et al．Metabolism of R- and S-warfarin by CYP2C19 into four hydroxywarfarins[J]．Drug Metab Lett，2012，6(3)：157-164.

ResearchoninfluencingofCYP2C18genepolymorphismonwarfarindoseaftervalvereplacementsurgery*

LiuYinqiang，OuyangPeigang，LuoKang，ZhangXueyu，ZhangGuimin

(DepartmentofCardiacVascularSurgery,FirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China)

ObjectiveTo investigate the CYP2C18,VKORC1 and CYP2C9 genotype distribution situation and the correlation between their polymorphism with warfarin stable dose.MethodsA total of 176 Yungui plateau Han patients with continuously warfarin anticoagulation therapy after valve replacement in this hospital from January 2011 to January 2014 served as the research subjects.The venous blood was collected for detecting genotypes at various loci.The genotype and allele frequency distribution were analyzed,and the correlation between the gene polymorphism with warfarin stable dose was analyzed.ResultsThe genotypes and allele frequencies at various loci conformed to the Hardy-Winberg genetic balance (P>0.05).The polymorphisms of CYP2C18(rs7896133),VKORC1 (rs9923231),CYP2C9(rs1057910) and CYP2C9(rs4086116) gene loci were correlated with warfarin stable dose (P>0.05).ConclusionThe gene polymorphism of CYP2C18(rs7896133),VKORC1 (rs9923231),CYP2C9(rs1057910) and CYP2C9(rs4086116) in Yungui plateau Han patients may be the influence factors which contribute to warfarin stable dose personalized difference.

polymorphism,single nucleotide；warfarin；valve replacement surgery；CYP2C18

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.35.024

云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項資金項目(201501UH00141)。

劉寅強(1980-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事胸心外科疾病抗凝研究。

R654.2

A

1671-8348(2017)35-4974-03

2017-06-18

2017-09-11)