右美托咪定緩解大鼠周圍神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制*

史艷燕， 王 勇， 舒 英， 余 聰， 彭曉紅， 羅高平

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院麻醉科，武漢 430033

右美托咪定緩解大鼠周圍神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制*

史艷燕， 王 勇， 舒 英， 余 聰， 彭曉紅， 羅高平△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院麻醉科，武漢 430033

目的研究神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和核因子-κB(NF-κB)的表達(dá)變化，探討右美托咪定(Dex)緩解大鼠周圍神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制。方法雌性SD大鼠24只，隨機(jī)分為4組(n=6)：Sham+NS、Sham+Dex組、SNI+NS組和SNI+Dex組。Sham組實施假手術(shù)，SNI組建立坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷模型，隨后分別鞘內(nèi)注射等量的生理鹽水(NS)和Dex(1 μg/kg)。每組于術(shù)前1 d、術(shù)后1、3、7、14 d測定機(jī)械性痛閾(MWT)。免疫組織化學(xué)法檢測脊髓BDNF和NF-κB的表達(dá)，Western blot法檢測Dex處理后BDNF和NF-κB蛋白表達(dá)變化。結(jié)果從術(shù)后第3天起，SNI+NS組所有大鼠均出現(xiàn)了持續(xù)的機(jī)械性痛覺異常。免疫組化檢測結(jié)果顯示：BDNF和NF-κB散在表達(dá)于脊髓，BDNF主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，而NF-κB主要表達(dá)在細(xì)胞核，以脊髓背角Ⅰ～Ⅳ層和背角深層Ⅴ～Ⅵ層表達(dá)較多，手術(shù)側(cè)多于非手術(shù)側(cè)。Western blot檢測結(jié)果顯示：在SNI+NS組中BDNF和NF-κB蛋白的表達(dá)水平分別為(1.11±0.56)、(2.31±0.46)，明顯高于Sham+NS組的(0.72±0.26)和(0.01±0.06)，分別增加53%和206%；SNI+Dex組中BDNF和NF-κB蛋白的表達(dá)分別為(0.66±0.36)、(0.02±0.08)，與SNI+NS組相比明顯降低(均P<0.05)。結(jié)論Dex通過降低BDNF和NF-κB表達(dá)緩解神經(jīng)病理性疼痛。

神經(jīng)病理性疼痛； 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子； 核因子-κB； 右美托咪定

神經(jīng)病理性疼痛已成為一種難以處理的健康威脅，它對人們的生活質(zhì)量有著深遠(yuǎn)的影響。神經(jīng)病理性疼痛是一種常見的綜合征，它可因許多疾病所誘發(fā)，如糖尿病性神經(jīng)痛、神經(jīng)根背痛、皰疹后神經(jīng)痛、中風(fēng)和脊髓損傷[1]，其特點表現(xiàn)為痛覺過敏、觸誘發(fā)痛和自發(fā)疼痛[2-3]。外周性疼痛不僅可啟動而且還可維持和調(diào)節(jié)神經(jīng)病理性疼痛。目前由于神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制尚不完全明確，因此治療方面仍然面臨困難[4]。

右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)是一種新型高選擇性α2腎上腺素受體激動劑，可對神經(jīng)性疼痛發(fā)揮顯著的鎮(zhèn)痛作用[5]。吳婧如等[6]研究發(fā)現(xiàn)大鼠坐骨神經(jīng)局部鞘內(nèi)注射Dex可通過激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、抑制神經(jīng)生長因子的過度表達(dá)和調(diào)節(jié)交感神經(jīng)生長來緩解由慢性收縮損傷(chronic constrictive injury，CCI)引起的熱過敏癥。最新研究表明，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)可調(diào)節(jié)急性炎癥性疼痛，在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用[7]。然而，在神經(jīng)病理性疼痛中神經(jīng)損傷是否會導(dǎo)致BDNF的表達(dá)上調(diào)以及Dex是否通過調(diào)節(jié)BDNF介導(dǎo)的信號通路發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用尚不清楚。本研究建立大鼠坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷模型(SNI)并鞘內(nèi)注射Dex，應(yīng)用免疫組織化學(xué)和Western blot方法研究神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中BDNF與核因子-κB(NF-κB)蛋白的表達(dá)變化，探討Dex緩解大鼠周圍神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 鞘內(nèi)注射

在有意識的大鼠L5和L6椎骨之間插入一個25 μL微型注射器的不銹鋼針頭，大鼠尾巴突然輕微的抖動表明針進(jìn)入了蛛網(wǎng)膜下腔。間隔20 s以上注射Dex溶液或生理鹽水，藥物注射完10 s后移除針頭，以確保藥物保留時間[6]。

1.2 分組和模型制備

雌性SD大鼠24只，體重150～200 g，2月齡，購自華中科技大學(xué)實驗動物中心。隨機(jī)分為4組(n=6)，即Sham+NS組、Sham+Dex組、SNI+NS組和SNI+Dex組。Sham組：僅暴露大鼠左后腿坐骨神經(jīng)即縫合切口；SNI組：于大鼠左腿后外側(cè)暴露坐骨神經(jīng)及其3個分支，保留腓腸神經(jīng)，結(jié)扎和切斷脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)后縫合切口，建立坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷模型[8-9]。兩組隨后行鞘內(nèi)注射10 μL生理鹽水和Dex(1 μg/kg體重)溶液，每天注射1次，共14 d。

1.3 機(jī)械性痛閾測定

使用動態(tài)足底觸覺測量儀(Ugobasile公司，意大利)采取up-and-down的方法測定機(jī)械性痛閾值(MWT，指引起大鼠左后爪快速縮腿的最小力度，12 g和2 g力度的接觸刺激分別代表痛覺異常和痛覺過敏)[10]。每隔5 min測定1次，重復(fù)3次，引起可靠縮腿反應(yīng)的平均力度作為痛覺閾值。對刺激產(chǎn)生快速縮腿反應(yīng)作為陽性反應(yīng)。分別于術(shù)前1 d、術(shù)后1、3、7、14 d測定并計算MWT。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測脊髓中BDNF和NF-κB的表達(dá)

術(shù)后14 d測痛后，4組各取大鼠3只，10%水合氯醛600 mg/kg麻醉后，4%多聚甲醛灌注大鼠，分離脊髓，截取L4～L6脊髓，經(jīng)多聚甲醛后固定，蔗糖脫水后，冰凍冠狀切片(30 μm)，切片置于0.01 mmol/L的PBS中，應(yīng)用SP法進(jìn)行免疫組化實驗，分別檢測BDNF和NF-κB的表達(dá)，實驗操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 Western blot法檢測脊髓BDNF和NF-κB的表達(dá)

術(shù)后14 d測痛后，4組各取大鼠3只，斷頭處死，迅速分離L4～L6脊髓，按1∶2(V/V)比例加入預(yù)冷的組織蛋白裂解液(50 mmol/L Tris·Cl，pH 7.5，250 mmol/L蔗糖，2 mmol/L EDTA，2 mmol/L EGTA，1 mmol/L PMSF，2.35 μg/μL Aprotinin，1 mmol/L DTT)于玻璃勻漿器內(nèi)冰上勻漿，徹底勻漿至無明顯組織塊。然后將勻漿液置于4℃離心機(jī)12 500 g離心60 min，取上清。取等量的蛋白經(jīng)過10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上，TBS洗膜、封閉，加入合適稀釋度的抗BDNF、抗NF-κB以及β-actin一抗，室溫孵育1～2 h或4℃過夜，加入合適稀釋度的辣根過氧化物酶(HR)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。將曝光后的印跡結(jié)果掃描入計算機(jī)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。以目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶的吸光度比值反映目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般行為學(xué)觀察

實驗期間，實驗動物健康狀態(tài)良好，無體重減輕、傷口或傷疤。SNI+NS組和Sham+NS組大鼠的總體健康狀況沒有區(qū)別。SNI+NS組大鼠在手術(shù)后都有不同程度的步態(tài)和姿勢的變化，包括避免患爪負(fù)重和足外翻改變立姿。SNI+Dex組這些不正常的行為有所減少。

2.2 Dex對機(jī)械性痛覺超敏的影響

與Sham組相比，在SNI+NS組和SNI+Dex組中SNI操作引發(fā)了一種快速啟動且持久的機(jī)械性痛覺超敏，MWT從術(shù)后1 d到14 d均明顯下降。與SNI+NS組相比，DEX在術(shù)后1 d快速逆轉(zhuǎn)SNI誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺超敏，術(shù)后3 d到14 d更明顯(表1)。

表1 Dex對神經(jīng)病理性疼痛大鼠機(jī)械性痛閾值的影響Table 1 The effect of Dex on mechanical allodynia in rats with neuropathic pain(g,±s，n=6)

與Sham+NS組比較，**P<0.01；與SNI+NS組比較，#P<0.05；與術(shù)前比較，△P<0.05

2.3 免疫組化法檢測大鼠脊髓中BDNF和NF-κB蛋白的表達(dá)

采用免疫組化法檢測SNI組同一只大鼠手術(shù)側(cè)(左側(cè))和非手術(shù)側(cè)(右側(cè))脊髓BDNF和NF-κB表達(dá)變化(圖1)。BDNF和NF-κB的表達(dá)均在脊髓中散在分布，以脊髓背角Ⅰ～Ⅳ層和背角深層Ⅴ～Ⅵ層表達(dá)較多；手術(shù)側(cè)多于非手術(shù)側(cè)；在高倍顯微鏡下可見BDNF主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，而NF-κB主要表達(dá)在細(xì)胞核。結(jié)果表明，SNI誘導(dǎo)了大鼠手術(shù)側(cè)脊髓BDNF和NF-κB蛋白的表達(dá)。

A：脊髓背角非手術(shù)側(cè)(×100)；B：脊髓背角手術(shù)側(cè)(×100)；C：脊髓背角手術(shù)側(cè)(×400)圖1 SNI對脊髓中BDNF和NF-κB蛋白表達(dá)的影響Fig.1 The effect of SNI on BDNF and NF-κB protein expression in the spinal cord

2.4 Western blot法檢測大鼠脊髓中BDNF和NF-κB蛋白的表達(dá)

Western blot法檢測結(jié)果(圖2)顯示：SNI+NS組中BDNF和NF-κB蛋白的表達(dá)分別為(1.11±0.56)和(2.31±0.46)，明顯高于Sham+NS組的(0.72±0.26)和(0.01±0.06)(均P<0.05)，升高比例為53%和206%。SNI+Dex組中BDNF和NF-κB蛋白的表達(dá)分別為(0.66±0.36)、(0.02±0.08)，與SNI+NS組相比明顯降低(均P<0.05)。Sham+NS和Sham+Dex組中BDNF和NF-κB蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明，SNI誘導(dǎo)了BDNF和NF-κB蛋白表達(dá)，而Dex鞘內(nèi)注射治療明顯降低BDNF和NF-κB蛋白的表達(dá)。

3 討論

慢性神經(jīng)損傷模型為更好地理解和認(rèn)識慢性疼痛的機(jī)制和病因提供可能，是研究神經(jīng)病理性疼痛機(jī)制最常用的動物模型[11]。在本研究中，我們采用操作簡單、產(chǎn)生疼痛個體差異性小、時間快的SNI模型[12]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNI產(chǎn)生了明顯的機(jī)械性痛覺超敏，表明該模型制備成功。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，在14 d的治療時間里，Dex鞘內(nèi)注射減少了機(jī)械性痛覺超敏，表明了Dex的治療功效，但是Dex緩解大鼠病理性疼痛的機(jī)制仍不清楚。

圖2 Dex對手術(shù)側(cè)脊髓中BDNF和NF-κB蛋白表達(dá)的影響Fig.2 The effect of Dex on BDNF and NF-κB protein expression in the spinal cord of the operation side

BDNF被證明是一種強(qiáng)大的脊髓感覺神經(jīng)傳導(dǎo)的調(diào)制器，并且在中央敏化發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)BDNF可以直接將神經(jīng)信號傳遞給脊髓背角神經(jīng)元，并進(jìn)一步誘發(fā)動物的機(jī)械性異常反應(yīng)。相反，在脊髓背角中減少BDNF的表達(dá)可能是導(dǎo)致機(jī)械性痛覺超敏衰減的一個因素[13]。有研究表明神經(jīng)病理性疼痛時，星形膠質(zhì)細(xì)胞CREB轉(zhuǎn)錄因子活性增強(qiáng)，增加了BDNF的表達(dá)，星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的BDNF可以增加神經(jīng)元對鈣離子的通透性，增加神經(jīng)元的興奮性，加強(qiáng)神經(jīng)元對疼痛刺激的敏感性[14]。另有研究也表明神經(jīng)元中NF-κB轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)后，可以增加nNOS和COX-2等基因的表達(dá)，而正是這些基因的表達(dá)增加了神經(jīng)元的興奮性，導(dǎo)致了疼痛的產(chǎn)生[15-16]。由此可以認(rèn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放BDNF的增加和神經(jīng)元NF-κB的活性增加是導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛的重要機(jī)制。我們的研究結(jié)果顯示，SNI動物模型中神經(jīng)損傷誘導(dǎo)了BDNF和NF-κB蛋白表達(dá)，參與了其神經(jīng)病理性疼痛的致痛機(jī)制。

神經(jīng)損傷后脊髓α2腎上腺素受體對膽堿能介導(dǎo)鎮(zhèn)痛的依賴性增加在一定程度上反映了脊髓膽堿能神經(jīng)元從直接抑制到直接激活的變化，這種轉(zhuǎn)變依賴于Gs蛋白和BDNF的相互作用。BDNF/Trk-B介導(dǎo)脊髓信號通路通過激活背角NMDA-2B受體參與了神經(jīng)損傷性神經(jīng)性疼痛的發(fā)展[17-18]。在本研究SNI+Dex組中，Dex治療明顯降低了BDNF和NF-κB蛋白的表達(dá)，提示針對BDNF和NF-κB的表達(dá)進(jìn)行靶向治療，如Dex坐骨神經(jīng)鞘內(nèi)注射，可以抑制神經(jīng)損傷誘發(fā)的神經(jīng)性疼痛。

綜上所述，Dex通過降低星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF和神經(jīng)元NF-κB途徑的活性緩解神經(jīng)病理性疼痛，闡明了Dex參與神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制，為神經(jīng)病理性疼痛提供了有效的治療手段。

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TheMechanismofDexmedetomidineRelievingNeuropathicPainofPeripheralNerveintheRats

Shi Yanyan，Wang Yong，Shu Yingetal

DepartmentofAnesthesiology，WuhanPu’aiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430033，China

ObjectiveTo investigate the mechanism of dexmedetomidine(Dex) relieving neurologic pain by studying the changes of brain-derived neurotrophic factor(BDNF) and NF-κB in the spinal cord of the neurologic pain rats.MethodsTotally，24 female SD rats were randomly divided into four groups，including Sham+NS group，Sham+Dex group，SNI+NS group，and SNI+Dex group(n=6 each group).Sham group suffered from no nerve damage.In SNI groups，surgery was performed for SNI neuropathic pain model.Mechanical withdrawal threshold was measured by an automated dynamic plantar aesthesiometer.The expression levels of BDNF and NF-κB in the spinal cord of rats were detected by immunohistochemistry.The effect of Dex treatment on protein expression of BDNF and NF-κB was analyzed by Western blotting.ResultsSince the day 3 after operation，all rats in group SNI+NS developed a relative unchangeable mechanical allodynia.Immunohistochemistry results showed that the expression of BDNF was located mainly in cytoplasm in astrocyte and NF-κB in neuron according to morphologic observation.The expression levels of BDNF and NF-κB in the operation side were higher than those in the non-operation side.Western blot analysis indicated that the expression levels of BDNF(1.11±0.56)and NF-κB(2.31±0.46)in SNI+NS group were increased significantly as compared with Sham+NS group(0.72±0.26)and(0.01±0.06)by the ratio of 53% and 206% and then the expression levels of BDNF(0.66±0.36)and NF-κB(0.02±0.08)in SNI+Dex group were decreased significantly as compared with SNI+NS group(1.11±0.56)and(2.31±0.46)(P<0.05).ConclusionDex attenuates neuropathic pain in SNI model by suppressing BDNF expression in astrocytes and NF-κB activity in neurons.

neuropathic pain； brain-derived neurotrophic factor； NF-κB； dexmedetomidine

*湖北省衛(wèi)生計生委科研基金資助項目(No.WJ2015MB153)；武漢市衛(wèi)生計生委科研基金資助項目(No.WX15C25)

史艷燕，女，1974年生，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師，E-mail：395200954@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：gaopingl@gmail.com

R745

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.010

(2017-06-13 收稿)