肥胖對(duì)胰島β細(xì)胞凋亡的影響*

胡 軍， 白秋方， 楊少娟， 朱 琳， 彭旖旎， 周 軍

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430077 2武漢市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢 430033

肥胖對(duì)胰島β細(xì)胞凋亡的影響*

胡 軍1， 白秋方1， 楊少娟1， 朱 琳1， 彭旖旎1， 周 軍2△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 4300772武漢市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢 430033

目的探討肥胖對(duì)胰島β細(xì)胞凋亡的影響及其可能的機(jī)制。方法取雄性SD大鼠，采用高脂飲食喂養(yǎng)的方法建立大鼠肥胖模型。取肥胖模型組(obese model group，OM組)和正常對(duì)照組(normal control group，NC組)大鼠各10只檢測。測定空腹血糖(FBG)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、游離脂肪酸(FFA)及血清胰島素(FIns)的水平，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。蘇木精-伊紅染色觀察胰腺組織病理變化；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測β細(xì)胞凋亡水平；Western blot檢測細(xì)胞色素C(Cyt C)在線粒體、細(xì)胞質(zhì)中的分布情況及活化的胱天蛋白酶-3(Caspase-3)的表達(dá)水平。結(jié)果與NC組比較，OM組大鼠FBG、TC、TG、FFA、FIns、HOMA-IR、凋亡指數(shù)、胞質(zhì)Cyt C水平及活化的Caspase-3表達(dá)水平均明顯升高；線粒體Cyt C水平明顯降低(均P<0.05)；胰腺組織出現(xiàn)結(jié)構(gòu)破壞、脂質(zhì)變性等改變。結(jié)論肥胖通過線粒體途徑增加胰島β細(xì)胞的凋亡水平。

肥胖； 凋亡； 胰島素抵抗； 細(xì)胞色素C； 胱天蛋白酶-3

肥胖癥是一種以體內(nèi)脂肪堆積過多為主要特點(diǎn)的慢性代謝性疾病。脂肪組織是一種兼具能量貯存和內(nèi)分泌雙重功能的器官，其分泌的多種脂肪因子如游離脂肪酸、瘦素、脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子α等對(duì)胰島β細(xì)胞功能具有重要調(diào)節(jié)作用[1]。β細(xì)胞凋亡是肥胖發(fā)展為2型糖尿病的重要環(huán)節(jié)，而線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的重要途徑，因此猜測，肥胖可能通過影響線粒體凋亡途徑來調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞的凋亡。為驗(yàn)證上述猜測，我們采用高脂飼料飼喂大鼠建立肥胖模型的方法，探討肥胖對(duì)胰島β細(xì)胞凋亡的影響及線粒體凋亡途徑在其中扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

6周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠30只，150～180 g，購自華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)SYXK(鄂)2010-0057，合格證號(hào)No.42009800001565。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號(hào)11684817910)購自Roche Applied Science公司；組織線粒體分離試劑盒(貨號(hào)C3606)購自碧云天公司；大鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(貨號(hào)E-EL-R2466c)購自伊萊瑞特生物科技有限公司；總膽固醇(TC)測定試劑盒(貨號(hào)A111-1)、三酰甘油(TG)測定試劑盒(貨號(hào)A110-1)、游離脂肪酸(FFA)測定試劑盒(貨號(hào)A042)、葡萄糖測試盒(貨號(hào)F006)均購自南京建成生物工程研究所；鼠抗細(xì)胞色素C(Cyt C，貨號(hào)12963)與兔抗Caspase-3抗體(貨號(hào)9664)均購自CST公司；蘇木精(貨號(hào)H9627)購自Sigma公司；伊紅Y(貨號(hào)71014544)購自國藥集團(tuán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組，正常對(duì)照組10只，給予普通飼料，高脂組20只，給予高脂飼料。第14周，選取高脂組體重較對(duì)照組平均體重增加大于20%的大鼠作為肥胖模型組，空腹16 h后，烏拉坦麻醉，心臟取血，分離血清檢測空腹血糖(FBG)、TC、TG、FFA及空腹胰島素(FIns)，打開腹腔，分離胰腺，切取部分胰尾組織放入4%多聚甲醛溶液中以待包埋，另取適量胰尾組織放入凍存管并置于-80℃冰箱，剩余胰尾組織置于冰上的離心管中備用。

1.2.2 大鼠血生化檢測 采用氧化酶法檢測FBG、TC、TG；比色法檢測FFA；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測FIns。采用穩(wěn)態(tài)模型計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，即HOMA-IR=FBG(mmol/L)×FIns(mU/L)/22.5。胰島素單位換算：1 μg/L×172.2=1 pmol/L，1 pmol/L=1 mU/L×6.965。

1.2.3 胰腺組織蘇木精-伊紅染色 胰腺組織經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片和烤片、脫蠟后，依次浸入蘇木精染液染色5 min、1%的鹽酸乙醇分化5 s、1%水溶性伊紅染液染色2 min后，經(jīng)無水乙醇脫水、二甲苯透明、風(fēng)干后中性樹膠封片、最后鏡檢。

1.2.4 TUNEL技術(shù)測定β細(xì)胞凋亡水平 組織經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、切片、烤片后脫蠟滴加蛋白酶K工作液，PBS洗滌3次。滴加TUNEL反應(yīng)混合液于樣本上，避光孵育60 min，洗滌后加converter-POD于標(biāo)本上，避光孵育30 min，洗滌后滴加DAB顯色液，室溫顯色5 min后終止顯色，再依次經(jīng)過Harris蘇木精復(fù)染和脫水透明，晾干的切片在顯微鏡下觀察并采集圖像。凋亡胰島細(xì)胞細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮深染，呈棕黃色。每組分別取5只大鼠進(jìn)行檢測，每個(gè)切片計(jì)數(shù)3個(gè)胰島中凋亡細(xì)胞數(shù)目，并計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)/胰島細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5 Western blot測定胰腺組織Cyt C及活化的Caspase-3的表達(dá)水平 按線粒體分離試劑盒說明書操作分離線粒體蛋白和胞質(zhì)蛋白成分，同時(shí)提取胰腺組織總蛋白，測定蛋白濃度后，沸水使蛋白變性，上樣，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST浸泡PVDF膜，依次加一抗、二抗、顯色曝光，晾干膠片，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。計(jì)算Cyt C/β-actin、活化Caspase-3/β-actin等值，比值越大，說明蛋白的表達(dá)越多。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠血生化檢測指標(biāo)結(jié)果比較

與NC組比較，OM組大鼠空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油、游離脂肪酸、胰島素、胰島素抵抗水平均明顯升高(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組大鼠FBG、TC、TG、FFA、FIns及HOMA-IR水平的比較Table 1 Comparison of the levels of FBG,TC,TG,FFA,FIns and HOMA-IR in the two groups(±s，n=10)

與NC組比較，*P<0.05

2.2 大鼠胰腺組織病理變化的比較

OM組大鼠胰島細(xì)胞腫脹，體積增大，腺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，并伴有明顯的脂肪塊狀沉積；NC組胰腺組織結(jié)構(gòu)完好，脂肪塊狀沉積不明顯。見圖1。

2.3 大鼠胰島細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較

NC組和OM組大鼠胰島細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(5.08±2.38)%、(21.16±3.33)%，OM組胰島細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加(P<0.05)。見圖2。

2.4 大鼠胰腺組織Cyt C及活化的Caspase-3的表達(dá)水平比較

與NC組比較，OM組大鼠胞質(zhì)Cyt C水平及活化的Caspase-3的表達(dá)水平顯著升高，線粒體Cyt C水平則明顯降低(均P<0.05)，見圖3、圖4。

A：NC組；B：OM組；箭頭所示為脂肪塊狀沉積圖1 大鼠胰腺組織病理學(xué)觀察(蘇木精-伊紅染色，×200)Fig.1 Pathological examination of the pancreatic tissues(HE staining，×200)

A：NC組；B：OM組；箭頭所示為凋亡的胰島細(xì)胞圖2 兩組大鼠胰島細(xì)胞凋亡水平檢測(TUNEL，×400)Fig.2 Detection of apoptotic levels of islet cells in the two groups(TUNEL，×400)

圖3 Western blot檢測胰腺組織Cyt C的分布及活化的Caspase-3蛋白表達(dá)Fig.3 Distribution of Cyt C and protein expression of cleaved Caspase-3 in pancreatic tissues

與NC組比較，*P<0.05圖4 大鼠胰腺組織Cyt C的分布及活化的Caspase-3蛋白的表達(dá)水平Fig.4 Analysis of distribution of Cyt C and protein expression level of cleaved Caspase-3 in pancreatic tissues

3 討論

近些年隨著人們生活水平的提高及膳食結(jié)構(gòu)的改變，全球范圍內(nèi)超重和肥胖癥的患病率普遍升高。肥胖作為2型糖尿病獨(dú)立的高危因素，已受到廣泛關(guān)注。β細(xì)胞功能受損和胰島素抵抗是目前比較公認(rèn)的2型糖尿病發(fā)病機(jī)制，其中β細(xì)胞功能受損是2型糖尿病發(fā)病的決定因素。多項(xiàng)研究表明β細(xì)胞功能受損與β細(xì)胞凋亡增加密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞程序性死亡，線粒體途徑被公認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究表明，肥胖可通過脂肪組織分泌的脂肪因子對(duì)胰島β細(xì)胞數(shù)量及胰島素分泌功能產(chǎn)生重要影響。因此，探討肥胖與β細(xì)胞凋亡的關(guān)系對(duì)2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的研究具有重要意義。

血糖和FFA是生物體內(nèi)參與能量代謝的主要營養(yǎng)物質(zhì)，在維持β細(xì)胞數(shù)量和功能穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)慢性高血糖及血脂異常所致的糖毒性與脂毒性干擾葡萄糖及脂質(zhì)代謝，并導(dǎo)致β細(xì)胞損傷[2]。體內(nèi)增多的FFA導(dǎo)致TG生成速率增加，過多的TG沉積在胰腺組織，導(dǎo)致胰腺組織結(jié)構(gòu)破壞、β細(xì)胞功能受損、數(shù)量減少及凋亡增加。Shimabukuro等[3]通過曲格列酮(TG抑制劑)孵化胰島細(xì)胞改善胰島素分泌證明TG對(duì)β細(xì)胞具有抑制效應(yīng)。Tuo等[4]發(fā)現(xiàn)β細(xì)胞長期暴露于亞麻酸會(huì)導(dǎo)致其功能失調(diào)甚至凋亡，線粒體信號(hào)通路可能參與其中，同時(shí)發(fā)現(xiàn)增加糖的水平可加重β細(xì)胞損傷。近年來有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺(FFA代謝中間產(chǎn)物)被激活后可使線粒體釋放活性氧及Cyt C，使β細(xì)胞凋亡[5]。Piro等[6]發(fā)現(xiàn)慢性暴露于高糖將增加大鼠胰島細(xì)胞的凋亡，并提出氧化應(yīng)激可能參與其中，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該組Bax水平升高，Bcl-2水平降低及Caspase-3水平輕度升高。該研究表明線粒體凋亡途徑在高糖引起的胰島β細(xì)胞凋亡中同樣發(fā)揮著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)OM組大鼠FBG、FFA、TG、TC及β細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于NC組，表明高血糖、高血脂協(xié)同作用加重胰島β細(xì)胞凋亡。

Cyt C和Caspase-3是參與線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。Cyt C位于線粒體膜間腔，是氧化呼吸鏈上在復(fù)合體Ⅲ和復(fù)合體Ⅳ之間傳遞電子的水溶性球狀蛋白。Caspase-3位于胞質(zhì)，是Caspase家族中凋亡的執(zhí)行者，具有滅活凋亡抑制性蛋白、水解細(xì)胞蛋白結(jié)構(gòu)及參與Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞損傷的作用。多種刺激均可引起線粒體內(nèi)膜的變化，導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，線粒體跨膜電位消失，促凋亡蛋白Cyt C及凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)從線粒體膜間隙釋放，激活Caspase-3依賴的線粒體凋亡途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7-8]。Mehmeti等[9]研究中采用Western blot分析Cyt C在線粒體及胞質(zhì)重新分布的情況，為我們分析線粒體凋亡途徑提供方法參照。本研究發(fā)現(xiàn)OM組胞質(zhì)中Cyt C水平及活化的Caspase-3表達(dá)明顯增加，線粒體中Cyt C水平明顯減少，說明線粒體凋亡途徑在β細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。

FFA影響β細(xì)胞胰島素分泌，干擾糖代謝，抑制胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)FFA通過上調(diào)β細(xì)胞解偶聯(lián)蛋白2(uncouping protein-2，UCP-2)的表達(dá)抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)[1]。近些年有研究表明FFA通過激活絲氨酸/蘇氨酸激酶減少胰島素受體底物1或2(insulin receptor substrates 1 or 2，IRS-1或IRS-2)及IRS的酪氨酸磷酸化而阻斷胰島素信號(hào)通路[10-11]。β細(xì)胞凋亡使其胰島素分泌功能下降，尚有代償能力的β細(xì)胞分泌胰島素增加，使胰島素整體水平偏高；胰島素抵抗時(shí)，外周組織對(duì)胰島素作用的敏感性降低，表現(xiàn)為高胰島素血癥；當(dāng)β細(xì)胞胰島素分泌功能失代償時(shí)，出現(xiàn)血糖水平的異常增高[12]。本研究發(fā)現(xiàn)OM組大鼠β細(xì)胞分泌胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)均明顯升高，提示肥胖模型鼠存在胰島素抵抗。

蘇木精-伊紅染色顯示OM組大鼠胰島細(xì)胞腫脹，體積增大，腺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，并伴有明顯的脂肪塊狀沉積；NC組胰腺組織結(jié)構(gòu)完好，脂肪變性不明顯。

綜上所述，我們推測肥胖通過線粒體途徑增加胰島β細(xì)胞的凋亡水平。本研究為通過減輕體重降低胰島β細(xì)胞凋亡水平及預(yù)防2型糖尿病的發(fā)生提供一定的理論依據(jù)。

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EffectsofObesityonIsletβ-CellApoptosis

Hu Jun，Bai Qiufang，Yang Shaojuanetal

DepartmentofEndocrinology，LiyuanHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430077，China

ObjectiveTo investigate the effects of obesity on islet β-cell apoptosis and the possible mechanisms.MethodsObese models were established in male SD rats by high fat diet.The rats in the obese model group(n=10)and the normal control group(n=10)were selected for detecting fasting blood glucose(FBG)，total cholesterol(TC)，triglyceride(TG)，free fatty acids(FFA)，fasting insulin(FIns)and calculating insulin resistance index(HOMA-IR).The pathological changes of the pancreatic tissues were observed by hematoxylin-eosin(HE)staining and the apoptotic islet β cells were measured by TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling(TUNEL)method.Cytochrome C(Cyt C)in mitochondria，cytoplasm and cleaved cysteine aspartate-specific protease-3(Caspase-3)in islet β cells were determined by Western blotting.ResultsThe levels of FBG，TC，TG，F(xiàn)FA，F(xiàn)Ins，HOMA-IR，apoptotic index and Cyt C in cytoplasm and cleaved Caspase-3 were significantly increased and the level of Cyt C in mitochondria was profoundly decreased in the obese model group as compared with the normal control group(allP<0.05).In the rats of the obese model group，the structure of pancreatic tissues was damaged，and there was obvious steatosis.ConclusionObesity can increase the apoptotic level of islet β cells by activation of mitochondrial apoptotic pathway.

obesity； apoptosis； insulin resistance； Cytochrome C； Caspase-3

*湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2014CFB446)

胡 軍，女，1964年生，主任醫(yī)師，E-mail：hujun1108@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：18971296188@189.com

R587

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.007

(2017-06-13 收稿)