玉米中伏馬毒素產(chǎn)生菌的分離鑒定及其產(chǎn)毒條件的研究

郭文博，沈源源，楊俊花，范 楷，趙志輝，韓 錚

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全評(píng)價(jià)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，上海 201403）

玉米中伏馬毒素產(chǎn)生菌的分離鑒定及其產(chǎn)毒條件的研究

郭文博，沈源源，楊俊花，范 楷，趙志輝，韓 錚*

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全評(píng)價(jià)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，上海 201403）

從發(fā)霉的玉米中分離鑒定產(chǎn)生伏馬毒素B1（Fumonisin B1，F(xiàn)B1）和伏馬毒素B2（Fumonisin B2，F(xiàn)B2）的真菌菌株并對(duì)其產(chǎn)毒條件（培養(yǎng)基、溫度、時(shí)間、水分含量）進(jìn)行考察，揭示伏馬毒素的發(fā)生規(guī)律。將發(fā)霉玉米的提取液接種至PDA培養(yǎng)基，利用平板劃線法分離獲得產(chǎn)毒菌株，通過形態(tài)學(xué)觀察和rDNA-ITS序列分析分別進(jìn)行真菌形態(tài)學(xué)和種屬鑒定；將產(chǎn)毒菌株接種在不同培養(yǎng)基上并選擇不同條件（溫度、時(shí)間、水分含量）培養(yǎng)，利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）對(duì)不同培養(yǎng)條件下各種培養(yǎng)基中FB1、FB2進(jìn)行定量檢測(cè)。BLAST結(jié)果表明，分離得到的菌株DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄號(hào)為KC709665.1、KR020684.1和KR052812.1的擬輪生鐮孢菌（Fusarium verticillioides）序列同源性均為100%，證明分離得到的產(chǎn)毒菌株為F.verticillioides。接種試驗(yàn)表明，F(xiàn).verticillioides的最佳產(chǎn)毒條件為玉米培養(yǎng)基，40%水分含量，28℃黑暗條件下培養(yǎng)28 d，F(xiàn)B1、FB2產(chǎn)量分別達(dá)到821.08 mg/kg、339.50 mg/kg。本研究玉米中伏馬毒素產(chǎn)毒菌株主要為F.verticillioides，且伏馬毒素的產(chǎn)生與培養(yǎng)基、溫度、時(shí)間和水分含量等環(huán)境因素密切相關(guān)。

伏馬毒素；擬輪生鐮孢菌；分離；產(chǎn)毒條件；玉米

伏馬毒素主要是由擬輪生鐮孢菌（Fusarium verticillioides）、層生鐮孢菌（F.proliferatum）和硫色鐮孢菌（F.sulphureum）在一定溫度和濕度條件下產(chǎn)生的一組水溶性次級(jí)代謝產(chǎn)物［1-2］，主要污染玉米及其制品，在世界范圍內(nèi)特別是玉米產(chǎn)區(qū)廣泛分布［3］。常見的伏馬毒素主要為伏馬毒素B1（Fumonisin B1，F(xiàn)B1）和伏馬毒素B2（Fumonisin B2，F(xiàn)B2），是一類由不同的多氫醇和丙三羧酸組成的結(jié)構(gòu)類似的雙酯化合物，其結(jié)構(gòu)與人和動(dòng)物體內(nèi)的神經(jīng)鞘氨醇極為相似，在神經(jīng)鞘脂代謝過程中可競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合神經(jīng)鞘氨醇N-2?；D(zhuǎn)移酶，從而抑制神經(jīng)鞘氨醇的生物合成、阻礙鞘脂類代謝，引發(fā)各種疾?。?］，如馬的大腦白質(zhì)軟化癥（Equine leucoencephalomalacia，ELEM）［5］、豬肺水腫綜合征（Porcine pulmonary edema，PPE）［6］、嚙齒類動(dòng)物的肝臟和腎臟損傷等［7］。此外，伏馬毒素還具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性［8］和免疫毒性［9］，與人類食道癌的發(fā)生密切相關(guān)［10-12］。

伏馬毒素的產(chǎn)生與鐮刀菌種屬及其生長(zhǎng)的環(huán)境條件密切相關(guān)，不同種屬的鐮刀菌在不同的條件下產(chǎn)生伏馬毒素的種類和能力均存在差異［13-14］。其中，溫度、水分含量、培養(yǎng)時(shí)間、基質(zhì)等是影響伏馬毒素產(chǎn)量的主要因素。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)伏馬毒素發(fā)生規(guī)律的報(bào)道主要集中在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PD）、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PS）、察氏培養(yǎng)基（Czapek）和理查德培養(yǎng)基（Richard）等常規(guī)培養(yǎng)基。研究結(jié)果表明，在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中F.verticillioides的最佳產(chǎn)毒條件為pH 9、12 h光暗交替、25℃、培養(yǎng)10 d［15］；在Richard培養(yǎng)基的最佳產(chǎn)毒條件為25℃、pH 5、培養(yǎng)10 d［16］。但對(duì)玉米、大米等實(shí)際高產(chǎn)毒培養(yǎng)基的產(chǎn)毒條件如溫度、水分含量等影響因素缺乏系統(tǒng)的考察，限制了伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品的研制及動(dòng)物毒理學(xué)的研究和發(fā)展。

本研究首先從發(fā)霉的玉米中分離鑒定獲得伏馬毒素的主要產(chǎn)毒菌株，將其分別接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PD）、玉米和大米四種培養(yǎng)基質(zhì)上，采用LC-MS/MS技術(shù)分析不同培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和水分含量下伏馬毒素的產(chǎn)生量，構(gòu)建不同培養(yǎng)基中伏馬毒素的產(chǎn)生量與溫度、時(shí)間和水分含量的非線性回歸模型，旨在揭示伏馬毒素的發(fā)生規(guī)律，對(duì)防控伏馬毒素污染、保證農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與培養(yǎng)基

優(yōu)質(zhì)玉米、大米、土豆，均購自上海某超市，發(fā)霉玉米（10份）收集于上海某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PD）［17］。大米培養(yǎng)基：稱取50 g優(yōu)質(zhì)大米至250mL三角瓶，加入20 mL蒸餾水混勻，用透氣封口膜密封瓶口，浸泡過夜，121℃滅菌30min，冷卻后將大米搖散待用。玉米培養(yǎng)基：稱取50 g優(yōu)質(zhì)玉米至250 mL三角瓶，加入20 mL蒸餾水混勻，用透氣封口膜密封瓶口，浸泡過夜，121℃滅菌30 min，冷卻后將玉米搖散待用。

1.2 試劑與儀器

FB1、FB2標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)Sigma公司）；葡萄糖、瓊脂（上海源葉生物科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Merck公司）；甲酸（色譜純，中國(guó)Aladdin公司）。真菌基因組DNA小量制備試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒（美國(guó)AXYGEN公司）；Taq DNA聚合酶（上海桑尼生物科技有限公司）；DNA marker［Takara，寶生物工程（大連）有限公司］。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜：TSQ Quant配 Surveyor液相操作系統(tǒng)（美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司）；Eppendorf 5804R離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；Applied Biosystems 2720 PCR儀、Applied Biosystems 3730-XL測(cè)序儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Thermo Scientific Heraguard ECO超凈臺(tái)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；霉菌培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SX-500高壓滅菌鍋（日本TOMY公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離方法

稱取10 g伏馬毒素含量超標(biāo)的發(fā)霉玉米，加入100 mL無菌水震蕩提取30 min，分別取10-1、10-2、10-3的稀釋液200μL涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)，48 h后利用平板劃線法逐步分離得到單菌落，將分離得到的單一菌落接種于PDA培養(yǎng)基上28℃黑暗培養(yǎng)7 d，備用。

1.3.2 產(chǎn)毒菌株的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)于大多數(shù)真核生物來說，核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析被廣泛應(yīng)用于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。本試驗(yàn)利用特異性的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定產(chǎn)毒菌的種類。引物由上海派森諾生物科技股份有限公司合成，序列如下：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGC，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：DNA（20 ng/μL）1.0μL，10×Buffer（含2.5×10-3mol/LMg2+）5μL，Taq聚合酶（5 U/μL）1.0μL，dNTP（1×10-5mol/L）1.0μL，ITS1引物（1×10-5mol/L）1.5μL，ITS4引物（1×10-5mol/L）1.5μL，ddH2O 39.0μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。反應(yīng)完成后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后用ABI3730-XL測(cè)序儀進(jìn)行堿基序列測(cè)定，將拼接后的序列與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，得到待測(cè)菌株的菌種信息。

1.3.3 培養(yǎng)條件與方法

將分離獲得的產(chǎn)毒菌株接種于PDA培養(yǎng)基，28℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d后，備用。用無菌打孔器從PDA培養(yǎng)基上取直徑為0.5 cm的菌絲塊，分別將菌絲塊接種至PDA、PD、玉米、大米培養(yǎng)基中，每份接種3塊菌絲塊，用無菌透氣封口膜密封，搖勻，28℃黑暗條件下培養(yǎng)4周。接種第1周，每天振蕩三角瓶1次，使菌絲與培養(yǎng)基充分接觸，避免玉米、大米培養(yǎng)基凝結(jié)成塊，培養(yǎng)結(jié)束后，40℃烘干，待用。

1.3.4 產(chǎn)毒條件優(yōu)化

①不同培養(yǎng)基：將分離獲得的產(chǎn)毒菌株分別接種于PDA、PD、玉米、大米培養(yǎng)基，28℃、40%水分含量條件下培養(yǎng)28 d，每7 d重復(fù)取樣3份；②培養(yǎng)時(shí)間：將分離獲得的產(chǎn)毒菌株接種于玉米培養(yǎng)基，28℃、40%水分含量條件下培養(yǎng)35 d，每7 d重復(fù)取樣3份；③培養(yǎng)溫度：將分離獲得的產(chǎn)毒菌株接種于玉米培養(yǎng)基，20℃、25℃、28℃、30℃、35℃，40%水分含量培養(yǎng)28 d，每7 d重復(fù)取樣3份；④水分含量：在250 mL的三角瓶中裝入50 g玉米，然后分別加入10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL水，即調(diào)節(jié)水分含量為20%、30%、40%、50%、60%，接種分離得到的產(chǎn)毒菌株，28℃培養(yǎng)28 d，每7 d重復(fù)取樣3份。

1.3.5 樣品處理

液體培養(yǎng)基：PD培養(yǎng)液渦旋振蕩5 min，取2 mL于10 mL離心管中加入2.0 mL乙腈，渦旋混合1 min，超聲1 h，4 000 r/min離心10min，取上清液過0.22μm濾膜后用乙腈-水（50∶50，v/v）稀釋100倍后上機(jī)測(cè)定。

固體培養(yǎng)基：將3種固體培養(yǎng)基粉碎混勻后準(zhǔn)確稱?。?.00±0.01）g樣品于10 mL離心管中，加入5.0 mL乙腈-水（50∶50，v/v）提取，渦旋混合1min，超聲1 h，4 000 r/min離心10min，取上清液過0.22μm濾膜后用乙腈-水（50∶50，v/v）稀釋104倍后上機(jī)測(cè)定。

1.3.6 LC-MS/MS檢測(cè)條件

Thermo C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，5μm）；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1%甲酸水；線性梯度洗脫程序：0 mim（40%A），1 min（60%A），7 min（100%A），8 min（100%A），8.2 min（40%A），9.0 min（40%A）；流速為300μL/min；進(jìn)樣量5μL；柱溫30℃。

采用正離子模式的電噴霧（ESI+）離子源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）采集；FB1和FB2的母離子、子離子、碰撞能量等參數(shù)見表1；噴霧電壓為3.5 kV；碎裂電壓為1.5 V；毛細(xì)管溫度為350℃；霧化氣壓力3 500 Pa；輔助氣壓 15 Pa；鞘氣壓 45 Pa。

表1 伏馬毒素B1、B2質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 M ass spectrometry parameters for FB1 and FB2

2 結(jié)果與分析

2.1 伏馬毒素含量測(cè)定

本試驗(yàn)利用HPLC-MS/MS技術(shù)，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），建立測(cè)定玉米培養(yǎng)基中FB1和FB2含量的分析方法。試驗(yàn)結(jié)果表明：玉米培養(yǎng)基樣品中FB1和FB2在1—200μg/kg之間線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999，定量限為0.3μg/kg，檢出限為0.1μg/kg；采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方法，考察方法的回收率和精密度，得到低、中、高濃度加標(biāo)回收率為88.6%—95.3%，精密度（RSD%）范圍是2.9%—6.8%。通過方法學(xué)考察，表明采用的方法靈敏、準(zhǔn)確、可靠，滿足本試驗(yàn)中對(duì)PDA、PD、玉米和大米中FB1和FB2的準(zhǔn)確定量。標(biāo)準(zhǔn)溶液和玉米產(chǎn)毒培養(yǎng)基中FB1、FB2色譜圖如圖1。

圖1 伏馬毒素B1、B2色譜圖Fig.1 Chromatograms of FB1 and FB2 in standard solution（A）and maizemedium（B）

2.2 伏馬毒素產(chǎn)生菌的鑒定

利用微生物稀釋分離法和平板劃線法，將分離得到的產(chǎn)伏馬毒素的菌株接種于PDA培養(yǎng)基，28℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，由圖2可見：菌落為棉絮狀平鋪PDA培養(yǎng)基中，氣生菌絲為白色，基內(nèi)菌絲為淺粉色，培養(yǎng)基反面呈淡黃色；在顯微鏡下觀察到大型分生孢子呈鐮刀形，數(shù)量較少，而小型分生孢子呈橢圓形，數(shù)量較多且多為棒形、無分隔。根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》《常見鐮孢霉鑒定手冊(cè)》《中國(guó)真菌志》等工具書，初步鑒定為鐮刀菌［18-20］。

提取菌株DNA后，用IST1和IST4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到550 bp左右的目的條帶（圖2），對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定后，與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知菌株信息比對(duì)，結(jié)果表明：試驗(yàn)菌株與數(shù)據(jù)庫中登錄號(hào)為KC709665.1、KR020684.1和KR052812.1的F.verticillioides序列同源性均為100%。最終，本試驗(yàn)經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定和rDNA-ITS序列分析，共獲得8株產(chǎn)伏馬毒素的F.verticillioides，并利用Fum-1進(jìn)行最佳產(chǎn)毒條件的優(yōu)化。

圖2 分離菌株的形態(tài)特征及PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Morphological characteristics and PCR identification of isolates

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F.verticillioides產(chǎn)毒量的影響

由圖3可見，F(xiàn).verticillioides在不同培養(yǎng)基上產(chǎn)毒量隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈動(dòng)態(tài)變化，本試驗(yàn)將PDA、PD、玉米和大米培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)間設(shè)為35 d。在0—7 d，PDA和PD培養(yǎng)基中FB1、FB2含量逐漸升高，在第14天達(dá)到最大；在0—28 d，玉米和大米培養(yǎng)基中FB1、FB2含量逐漸增加，在第28天達(dá)到最大。當(dāng)培養(yǎng)基中伏馬毒素含量達(dá)到最大后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的繼續(xù)增加，4種培養(yǎng)基中FB1、FB2含量均略微下降。

不同研究表明，F(xiàn).verticillioides的產(chǎn)毒能力與培養(yǎng)基密切相關(guān)［15-16，21］。本試驗(yàn)中4種培養(yǎng)基均能產(chǎn)生伏馬毒素，但產(chǎn)毒量存在明顯差異。PDA與PD培養(yǎng)基中FB1、FB2含量極低，大米培養(yǎng)基中FB1、FB2含量分別為598.03 mg/kg、284.01mg/kg，玉米培養(yǎng)基中FB1、FB2含量分別為821.08mg/kg、339.50mg/kg，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PDA與PD。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)擬輪生鐮孢菌產(chǎn)毒的影響Fig.3 Effect of incubation time on toxin-producing ability of F.verticillioides

2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)F.verticillioides產(chǎn)毒量的影響

將接種F.verticillioides的玉米培養(yǎng)基分別在20℃、25℃、28℃、30℃、35℃，40%水分含量條件下培養(yǎng)28 d，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明：當(dāng)培養(yǎng)溫度低于28℃時(shí)，伏馬毒素產(chǎn)量隨溫度的增加而增加；當(dāng)培養(yǎng)溫度高于28℃時(shí)，伏馬毒素產(chǎn)量隨溫度的增加而降低。本試驗(yàn)中28℃條件下玉米中FB1和FB2含量最高，分別達(dá)到817.08 mg/kg、329.01 mg/kg。因此，本試驗(yàn)最終選擇28℃作為最佳培養(yǎng)溫度。

2.5 水分含量對(duì)F.verticillioides產(chǎn)毒量的影響

將F.verticillioides分別接種在水分含量在20%、30%、40%、50%、60%的玉米培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)28 d，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明：水分含量從20%到40%，F(xiàn)B1和FB2產(chǎn)量不斷增加，水分含量為40%時(shí)，伏馬毒素含量達(dá)到最大，分別為808.21 mg/kg、321.15 mg/kg，當(dāng)水分含量超過40%時(shí)，伏馬毒素含量逐漸下降。因此，最終將培養(yǎng)基水分含量定為40%。

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)擬輪生鐮孢菌產(chǎn)毒的影響Fig.4 Effect of incubation tem perature on toxin-producing ability of F.verticillioides

圖5 水分含量對(duì)擬輪生鐮孢菌產(chǎn)毒的影響Fig.5 Effect of water content on toxin-producing ability of F.verticillioides

3 討論

F.verticillioides是一類世界性分布的真菌，它不僅可以存在于土壤及動(dòng)植物體內(nèi)，還可侵染多種重要經(jīng)濟(jì)作物，引起苗枯、根腐、莖腐和穗腐等病害［22］，其生長(zhǎng)產(chǎn)毒與地域環(huán)境、耕作制度、氣候條件等有關(guān)，不同國(guó)家和地區(qū)分布存在明顯差異。關(guān)于玉米致病菌群的研究表明，北美洲以F.verticillioides和禾谷鐮孢菌（F.graminearum）為優(yōu)勢(shì)菌株［23］，南美洲則以 F.proliferatum為優(yōu)勢(shì)菌菌［24］；我國(guó)北方玉米中，F(xiàn).graminearum為主要致病菌，F(xiàn).verticillioides較少［25］。本研究從發(fā)霉玉米中共分離得到14株鐮孢菌，經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，伏馬毒素產(chǎn)生菌主要為F.verticillioides，占54%，與其他關(guān)于玉米中真菌污染的調(diào)查分析結(jié)果一致［22，26-27］，均表明F.verticillioides能夠引起玉米霉變并產(chǎn)生伏馬毒素的污染。

F.verticillioides產(chǎn)毒量與培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、水分含量等因素密切相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明F.verticillioides的最佳產(chǎn)毒條件為玉米培養(yǎng)基，40%水分含量，28℃黑暗條件下培養(yǎng)28 d。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，四種培養(yǎng)基中伏馬毒素產(chǎn)量均呈先增加后下降趨勢(shì)，此結(jié)果與李俊霞等［16］研究結(jié)果一致，由此表明F.verticillioides產(chǎn)毒量與菌絲的旺盛生長(zhǎng)期相關(guān)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌絲逐漸老化，溶氧量降低，同時(shí)其他抑制性作用代謝產(chǎn)物增加，造成毒素總量下降。另外，伏馬毒素降解及本身作為碳源被F.verticillioides利用也可能是伏馬毒素含量下降的原因［28］。當(dāng)培養(yǎng)溫度為20—28℃時(shí)，F(xiàn).verticillioides生長(zhǎng)迅速，伏馬毒素產(chǎn)量逐漸增加；當(dāng)培養(yǎng)溫度高于30℃時(shí)，F(xiàn).verticillioides生長(zhǎng)變緩慢，產(chǎn)毒量逐漸降低，說明較高的培養(yǎng)溫度能夠抑制F.verticillioides產(chǎn)毒，與師雯等［29］研究結(jié)果一致。水分含量也是影響微生物生長(zhǎng)的重要因素，當(dāng)水分含量為20%時(shí)，由于培養(yǎng)基表面干化，F(xiàn).verticillioides生長(zhǎng)緩慢，造成培養(yǎng)基利用率不高，伏馬毒素產(chǎn)量較低；當(dāng)培養(yǎng)基水分含量為40%，玉米培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)迅速，伏馬毒素產(chǎn)量最高；而當(dāng)水分含量大于40%時(shí)，培養(yǎng)基結(jié)塊成團(tuán)，使培養(yǎng)基溶氧量不足，從而造成菌絲生長(zhǎng)不良，不利于F.verticillioides產(chǎn)毒，伏馬毒素的產(chǎn)生量降低。

4 結(jié)論

伏馬毒素在世界范圍內(nèi)廣泛分布，不僅嚴(yán)重影響農(nóng)作物品質(zhì)，還對(duì)人和動(dòng)物健康造成潛在的危害。本研究在已有報(bào)道的基礎(chǔ)上［30-31］，從發(fā)霉玉米中分離鑒定產(chǎn)伏馬毒素的F.verticillioides，系統(tǒng)地研究了其在不同培養(yǎng)基、溫度、時(shí)間、水分含量條件下產(chǎn)生伏馬毒素的量，揭示了伏馬毒素的產(chǎn)生規(guī)律，對(duì)F.verticillioides和伏馬毒素污染防控具有重要意義。

［1］FREUDENSCHUSSM，JAUNECKER G，KRSKA R.Fumonisin B1-isolation and analytical characterisation for the application as reference material［J］.Mycotoxin Research，2003，19（2）：194-197.

［2］VISENTIN I，TAMIETTIG，VALENTINO D，et al.The ITS region as a taxonomic discriminator between Fusarium verticillioides and Fusarium proliferatum［J］.Mycological Research，2009，113（10）：1137-1145.

［3］郭聰聰，朱維芳，付萌，等.甘肅省玉米籽粒中鐮孢菌分離頻率及伏馬毒素含量監(jiān)測(cè)［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2015，42（6）：942-948.

［4］GELINEAU-VANW J，STARR L，MADDOX J，et al.Maternal fumonisin exposure and risk for neural tube defects：mechanisms in an in vivo mousemodel［J］.Birth Defects Research Part A：Clinical and Molecular Teratology，2005，73（7）：487-497.

［5］GIANNITTIF，DIAB SS，PACIN A M，et al.Equine leukoencephalomalacia（ELEM）due to fumonisins B1 and B2 in Argentina［J］.Pesquisa Veterinária Brasileira，2011，31（5）：407-412.

［6］HASCHEKW M，GUMPRECHT L A，SMITH G，et al.Fumonisin toxicosis in swine：an overview of porcine pulmonary edema and current perspectives［J］.Environmental Health Perspectives，2001，109（Suppl2）：251-257.

［7］MATHUR S，CONSTABLE P D，EPPLEY R M，et al.Fumonisin B1 is hepatotoxic and nephrotoxic in milk-fed calves［J］.Toxicological Sciences，2001，60（2）：385-396.

［8］GARCIAJC D R，RAMOSM C，PINTON P，et al.Evaluation of the cytotoxicity of aflatoxin and fumonisin in swine intestinal cells［J］.Revista Iberoamericana de Micologia，2007，24（2）：136-141.

［9］FERNANDES F T，INGBERMANM，CARON L F.Naturally contaminated feed with low levels of fumonisinswith anti-mycotoxin additive and its impact in the immune cells and blood variables in broiler chickens［J］.Journal of Toxicology and Environmental Health Sciences，2014，6（10）：203-211.

［10］邱茂鋒，劉秀梅.某食管癌高發(fā)區(qū)人群伏刀菌素?cái)z入量及尿二氫神經(jīng)鞘氨醇/神經(jīng)鞘氨醇比值的調(diào)查［J］.衛(wèi)生研究，2001，30（6）：365-367.

［11］鄒小農(nóng)，魯鳳珠，張思維，等.中國(guó)1990年—1992年食管癌死亡分布特征分析［J］.中國(guó)腫瘤，2002，11（8）：446-449.

［12］曾甜甜，盧小東，陳路芳，等.伏馬霉素通過上調(diào) TGFβ信號(hào)通路促進(jìn) HepG2細(xì)胞增殖［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2014，24（2）：115-121.

［13］RAHAYU D，RAHAYUW P，LIOE H N，et al.The effect of temperature and humidity on the growth of Fusarium verticillioides BIO 957 and fumonisin B1 productions［J］.Agritech，2015，35（2）：156-163.

［14］SEWRAM V，MSHICILELIN，SHEPHARD G S，et al.Production of fumonisin B and C analogues by several Fusarium species［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53（12）：4861-4866.

［15］田雪亮，陳錫嶺，王洪亮.串珠鐮刀菌產(chǎn)生毒素條件研究［J］.微生物學(xué)雜志，2007，26（6）：45-47.

［16］李俊霞，廖大國(guó).四川玉米串珠鐮刀菌產(chǎn)毒素條件的研究［J］.糧食儲(chǔ)藏，2011，40（2）：44-46.

［17］曲遠(yuǎn)航，王琦，姚彥坡，等.馬鈴薯晚疫病生防木霉菌的篩選及鑒定［J］.菌物學(xué)報(bào)，2014，33（6）：1231-1241.

［18］魏景超.真菌鑒定手冊(cè)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

［19］BOOTH C.The genus fusarium［M］.UK：Commonwealth Mycological Institute，1971.

［20］裴冬麗，劉春元，吳建宇，等.河南省玉米穗粒腐病病原串珠鐮刀菌鑒定［J］.玉米科學(xué)，2011，19（1）：136-138.

［21］BAILLY JD，QUERIN D，TARDIEU D，etal.Production and purification of fumonisins from a highly toxigenic Fusarium verticilloides strain［J］.Revue De Medecine Veterinaire，2005，156（11）：547-554.

［22］史曉榕，白麗.不同類型玉米群體穗粒腐病病原菌的調(diào)查研究［J］.植物保護(hù)，1992，18（5）：28-29.

［23］WHITE D G.Compendium of corn diseases［M］.USA：American Phytopathological Society，1999.

［24］CHULZE SN，RAMIREZM L，TORRESA，et al.Geneticvariation in Fusarium section Liseola from no-tillmaize in Argentina［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000，66（12）：5312-5315.

［25］白金鎧，尹志，胡吉成.東北玉米莖腐病病原的研究［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1988，15（2）：93-98.

［26］張超沖，賢振華，韋繼光，等.玉米青枯病菌的侵染及發(fā)病規(guī)律研究［J］.廣西農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1983（1）：53-62.

［27］黃思良，盧維宏，陶愛麗，等.南陽市玉米穗腐病致病鐮刀菌種群結(jié)構(gòu)分析［J］.南陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2012（3）：54-57.

［28］代喆，王雅玲，孫力軍，等.利用 Fusarium poae制備 T-2毒素的培養(yǎng)條件和提取方法［J］.微生物學(xué)雜志，2012，31（5）：40-44.

［29］師雯，韓錚，武愛波，等.溫度和 pH對(duì)不同鐮刀菌生長(zhǎng)及產(chǎn)毒的影響［J］.食品工業(yè)科技，2015，36（18）：117-122.

［30］PRADEEP F，BEGAM M，PALANISWAMY M，et al.Influence of culture media on growth and pigment production by Fusarium moniliforme KUMBF1201 isolated from paddy field soil［J］.World Applied Sciences Journal，2013，22（1）：70-77.

［31］劉秀梅，王曉英，邱茂鋒，等.串珠鐮刀菌伏馬菌素產(chǎn)毒基因及毒力的測(cè)定［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2005，39（4）：249-252.

Isolation and identification of fumonisin-producing strains from maize and research on their toxin-producing conditions

GUOWen-bo，SHEN Yuan-yuan，YANG Jun-hua，F(xiàn)AN Kai，ZHAO Zhi-hui，HAN Zheng*
（Institute of Agro-Food Quality Standards and Testing Technology，Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology，Shanghai Service Platform of Agro-Products Quality and Safety Evaluation Technology，Shanghai Engineering Research Center of Agro-Products Quality and Safety，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai201403，China）

To isolate and identify the fungi producing fumonisins B1 and B2（FB1 and FB1）from moldy maize and investigate the conditions（medium，temperature，incubation time and water content）for the fungi to produce fumonisins，the extract ofmoldy maize were inoculated on PDA medium，and the toxigenic strains were isolated by plate streak approach.The species of the strains were identified respectively by morphologic observation and rDNA-ITS analysis，then the strains were inoculated on different media and cultured under different temperatures，incubation times and water contents，and finally the FB1 and FB2 were quantitatively determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）.The BLAST showed that the isolated strains and the Fusarium verticillioides KC709665.1，KR020684.1 and KR052812.1 in the NCBIwere 100%in DNA sequence homology，demonstrating the isolated strain to be F.verticillioides.The inoculation experiment showed that the optimal conditions for fumonisins production were 40%water content and maizemedium at28℃ in dark for 4 weeks，and the FB1 and FB2 yields could be up to 821.08 mg/kg and 339.50 mg/kg respectively.The fumonisin-producing strains in the testedmaizeweremainly F.verticillioides，and the fumonisins production was closely related to such environmental factors as culturemedium，temperature，time and water content.

Fumonisin；Fusarium verticillioides；Isolation；Toxin-producing conditions；Maize

Q93-331

A

1000-3924（2017）06-078-07

2016-09-08

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目［滬農(nóng)科攻字（2015）第6-3-2號(hào)］

郭文博（1988—），男，碩士，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：guo1103bo＠126.com，Tel：021-67131637

*通信作者：韓錚（1983—），男，博士，研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：hanzheng_ok＠163.com，Tel：021-37196975

程智強(qiáng)）