MMP-9和COX-2基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病的相關(guān)性研究

門翔，尚喜雨

（1.河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，河南 南陽(yáng) 473000；2.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 南陽(yáng) 473000）

MMP-9和COX-2基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病的相關(guān)性研究

門翔1，尚喜雨2

（1.河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，河南 南陽(yáng) 473000；2.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 南陽(yáng) 473000）

目的探討MMP-9和COX-2基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病的關(guān)系。方法選取71例慢性阻塞性肺疾病患者（COPD組）和同期63例急性呼吸道感染和健康體檢者（NC組）作為研究對(duì)象，PCRRFLP法測(cè)定MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）多態(tài)性，分析不同基因型與COPD的關(guān)系。結(jié)果NC組與COPD組MMP-9（R279Q）基因、COX-2（1195G＞A）的GG、AA基因型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.010和0.021），G、A等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。MMP基因R279Q位點(diǎn)的G等位基因頻率基因 1195G＞A 位點(diǎn)的 A 等位基因頻率為COPD的危險(xiǎn)因素。MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因多態(tài)性與FEV1%pred、FEV1/FVC、MMP-9及COX-2具有相關(guān)性（P=0.015、0.018、0.009、0.009，0.021、0.017、0.015和0.000）。結(jié)論MMP-9基因R279Q位點(diǎn)、COX-2基因1195G＞A位點(diǎn)多態(tài)性為COPD的危險(xiǎn)因素，與FEV1%pred、FEV1/FVC下降及MMP-9、COX-2升高相關(guān)。

慢性阻塞性肺疾?。换|(zhì)金屬蛋白酶9；環(huán)氧化酶2；基因多態(tài)性

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是以持續(xù)氣道阻塞為臨床表現(xiàn)的一種慢性進(jìn)展性疾病，氣道和肺內(nèi)對(duì)有害物質(zhì)有慢性炎癥反應(yīng)增強(qiáng)的表現(xiàn)[1]。目前，COPD死亡率居全球第4位，世界疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)指數(shù)居全球第5位，該病嚴(yán)重危害人民的健康。COPD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，環(huán)境和遺傳因素日益受到重視。研究發(fā)現(xiàn)[2]，炎癥反應(yīng)貫穿COPD的發(fā)生發(fā)展過程。有報(bào)道指出，基質(zhì)金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）、環(huán)氧化酶2（Cyclooxygenase 2，COX-2）與COPD的發(fā)生密切相關(guān)[3-4]，但目前對(duì)于MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）與COPD的關(guān)系研究報(bào)道較少。本研究旨在探討上述2種基因多態(tài)性與COPD的關(guān)系，從而為臨床基因靶向治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2015年1月-2016年4月在南陽(yáng)市中心醫(yī)院呼吸科住院診治的COPD患者71例（COPD組），其中，男性49例，女性22例，年齡45～76歲，平均（64.22±7.08）歲，通過體格檢查、詢問病史、胸部CT或X射線胸片同時(shí)結(jié)合肺功能、心電圖等證實(shí)為COPD，所有患者均符合2007年版《慢性阻塞性肺疾病診治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)；另選取同一時(shí)期在本院呼吸科門診就診的急性呼吸道感染和健康體檢者63例（NC組），其中，男性40例，女性23例，年齡42～71歲，平均（62.41±6.89）歲，均未出現(xiàn)慢性咳嗽、咳痰、氣短史等，經(jīng)胸部CT或X射線胸片和肺功能（FEV1/FVC＞70%）檢查排除COPD。

1.2 一般臨床資料及生化指標(biāo)檢測(cè)

詢問并記錄所有受試對(duì)象年齡、性別、吸煙史、吸煙指數(shù)，記錄肺功能指標(biāo)：第1秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比（percentage of forced expiratory volume in 1 second，F(xiàn)EV1%pred），F(xiàn)EV1/FVC（受試對(duì)象吸入支氣管擴(kuò)張劑沙丁胺醇15 min后檢測(cè)）。抽取患者外周靜脈血5 ml，置于含有乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的真空管中，離心后獲得血漿，采用ELISA檢測(cè)血漿中MMP-9。

1.3 外周血標(biāo)本及DNA提取

采集受試對(duì)象外周靜脈血5 ml，置于含有EDTA的真空管中，-80℃冰箱中保存。取血樣標(biāo)本2 ml，采用基因組DNA快速提純?cè)噭┖校≒romega生物試劑公司，美國(guó)）提取DNA，保存于-40℃冰箱中備用。

1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性應(yīng)用

1.4.1 引物合成 按照相關(guān)文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)引物，由上海英駿生物科技工程有限公司合成。采用Light Scanner Primer Design軟件設(shè)計(jì)MMP-9和COX-2基因相應(yīng)位點(diǎn)引物，均采用小片段擴(kuò)增引物。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物：其中MMP-9（R279Q）（G）正向：5'-CATCGCTACTATTCTGGCCTTAAAGCGCATA-3'，反向：5'-GGCCTATAAGGGCCGAGCGGGTCGTAGGCC ATC-3'，PCR產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度在237 bp；COX-2（1195G＞A）（G）正向：5'-CCGGTACATGGCCTATTAAC GTGCATACGG-3'，反向：5'-CGTTGCGCAATGCTGAC CGATCA-3'，PCR產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度在124 bp。

1.4.2 目的基因擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系為25 ml，其中含有5 ml PCR 混合物，正反向引物各0.5 ml，1 ml LC Green和1 ml DNA模板，剩余加入雙蒸水。MMP-9（R279Q）的擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，945℃變性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸 45 s，94℃變性30 s，30℃退火30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)，完成后采用73℃延伸5 min，限制性內(nèi)切酶為MspⅠ；COX-2（1195G＞A）的擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，93℃變性30 s，55℃退火30 s，73℃延伸45 s，93℃變性45 s，45℃退火30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)，完成后采用72℃延伸5 min，限制性內(nèi)切酶為RsaⅠ。取PCR產(chǎn)物10μl，在含有2%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，紫外線透射儀觀察PCR擴(kuò)增是否成功，鑒定其特異性。全部測(cè)序均由ABI3100測(cè)序分析儀（美國(guó)ABI公司）完成。為準(zhǔn)確測(cè)定基因分型結(jié)果，隨機(jī)選取10%的樣本采用直接測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗(yàn)。群體基因型采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)?；蚨鄳B(tài)性與COPD的遺傳效應(yīng)之間的相關(guān)性采用非條件的Logistic回歸分析，并經(jīng)多重檢驗(yàn)P值的Bonferroni進(jìn)行校正。ROC曲線分析MMP-9、COX-2對(duì)COPD的預(yù)測(cè)價(jià)值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料及生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

兩組FEV1%pred、FEV1/FVC比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），COPD組低于NC組，兩組MMP-9及COX-2比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），COPD組高于NC組。見表1。

2.2 MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因型及擴(kuò)增結(jié)果

MMP-9（R279Q）位點(diǎn)酶切中呈現(xiàn)1條亮的且長(zhǎng)度為124 bp的條帶為AA型，出現(xiàn)58、66和124 bp 3條亮帶的為GA型，出現(xiàn)在58和66 bp 2條帶為GG型；COX-2（1195G＞A）位點(diǎn)酶切中呈現(xiàn)1條亮的且長(zhǎng)度為237 bp的條帶為AA型，出現(xiàn)53、220和237 bp 3條亮帶的為GA型，出現(xiàn)在53和220 bp 2條帶為GG型。隨機(jī)選取MMP-9（R279Q）基因型、COX-2（1195G＞A）的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行基因測(cè)序，結(jié)果顯示堿基的改變與酶切結(jié)果一致。見圖1。

2.3 MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因型分布比較

NC 組 與 COPD 組MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）位點(diǎn)G、A等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，說明符合群體代表性。NC組與COPD組MMP-9（R279Q）基因GG、AA基因型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.010），G、A等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；NC組與COPD組COX-2（1195G＞A）基因GG、AA基因型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021），G、A等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。見表2。

表1 兩組一般臨床資料及生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

圖1 MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因擴(kuò)增電泳圖

2.4 COPD危險(xiǎn)因素的多變量回歸分析

將臨床資料與生化檢測(cè)指標(biāo)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素行多變量的Logistic回歸分析，以子COPD為因變量，以FEV1%pred、FEV1/FVC、MMP-9和R279Q基因的G等位基因頻率、COX-2和1195G＞A的A等位基因頻率為自變量。結(jié)果顯示，F(xiàn)EV1%predR279Q基因的G等位基因頻率1195G＞A基因的A等位基因頻率為COPD的危險(xiǎn)因素。

2.5 MMP-9、COX-2對(duì)COPD的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC曲線分析顯示，Youden指數(shù)在最大時(shí)，MMP-9、COX-2臨界值分別為 53.26μg/L、75.15 ng/ml，曲線AUC顯示，MMP-9、COX-2的AUC分別為0.754、0.779（P=0.017和0.012）。見圖2、表3。

2.6 MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）與COPD影響因素的關(guān)系

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因多態(tài)性與FEV1%pred、FEV1/FVC、MMP-9及COX-2具有相關(guān)性（P=0.015、0.018，0.009、0.009，0.021、0.017、0.015 和 0.000）。見表 4。

表2 兩組MMP-9（R279Q）、COX-2（1 195G＞A）基因型分布比較

表3 MMP-9、COX-2診斷效能分析

表4 MMP-9（R279Q）、COX-2（1 195G＞A）與COPD影響因素的關(guān)系 例（%）

圖2 MMP-9、COX-2 的ROC曲線

3 討論

COPD是一種臨床表現(xiàn)為不完全可逆、呈進(jìn)行性發(fā)展的氣流阻塞為特征的疾病，該病主要是由長(zhǎng)期氣道阻塞導(dǎo)致患者肺泡缺氧以及二氧化碳潴留，引起肺血管收縮、肺血管重構(gòu)，從而導(dǎo)致肺動(dòng)脈高血壓、易出現(xiàn)COPD患者出現(xiàn)右心衰竭和死亡[6]。肺血管重塑是導(dǎo)致COPD進(jìn)一步發(fā)生惡化的關(guān)鍵原因，導(dǎo)致肺血管重塑的原因有慢性炎癥、低氧或者缺氧等。低氧導(dǎo)致肺內(nèi)高血壓，從而促進(jìn)肺動(dòng)脈纖維母細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的促有絲分裂因子、生長(zhǎng)因子的釋放，而這些因子的釋放進(jìn)一步促進(jìn)平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的增殖并進(jìn)一步刺激細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，導(dǎo)致肺動(dòng)脈血管壁增厚，加重氣道阻塞[7]。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，環(huán)境和基因因素在COPD的發(fā)生、發(fā)展過程中存在著相互影響，關(guān)系很復(fù)雜。研究COPD的易感基因其相關(guān)因素對(duì)于防治COPD具有重要意義：①通過研究COPD的易感基因可以確定COPD發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因，從而尋找基因治療的靶點(diǎn)；②對(duì)易感基因人群進(jìn)行早期篩查和診斷，有助于早期應(yīng)用藥物進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)根據(jù)不同個(gè)體制定個(gè)體化COPD治療方案。

COPD的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是蛋白酶/抗蛋白酶系統(tǒng)中的重要成員，與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。?、高血壓、2型糖尿病、肺癌、COPD以及腫瘤轉(zhuǎn)移等有一定的關(guān)系[8]，MMPs成員中MMP-1、9和12均與COPD、肺氣腫的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中MMP-9是位于染色體20q11和2q13.1，具有13個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子[9]。目前有研究報(bào)道[10]，MMP-9基因C-1 562T位可能存在C突變成T，而這種突變將影響到MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄從而引發(fā)疾病，也有研究證實(shí)了MMP-9基因R279Q位點(diǎn)多態(tài)性可能為COPD易感性的危險(xiǎn)因素。本研究在以往研究的基礎(chǔ)上，證實(shí)了MMP-9基因R279Q位點(diǎn)多態(tài)性與COPD相關(guān)，值得提出的是本研究進(jìn)一步探討了MMP-9基因R279Q位點(diǎn)A突變成G基因與FEV1%pred、FEV1/FVC降低以及MMP-9、COX-2升高相關(guān)，說明MMP-9基因R279Q位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)COPD患者肺功能、炎癥反應(yīng)有明顯的刺激作用，導(dǎo)致COPD的發(fā)生發(fā)展。

COX-2是由花生四烯酸代謝過程中的重要限速酶，在前炎癥因子的刺激下，機(jī)體處于驗(yàn)證狀態(tài)后其呈高表達(dá)[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道指出，COX-2與多種炎性介質(zhì)相互參與了COPD患者氣道炎癥反應(yīng)過程，如IL-1、MMP-2、MMP-9等[12]，這也是本研究選擇COX-2、MMP-9作為研究對(duì)象的原因，旨在探討二者相互作用促進(jìn)COPD的發(fā)生發(fā)展。COX-2基因的表達(dá)及其穩(wěn)定性受到啟動(dòng)子區(qū)和3’端非編碼區(qū)的多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的影響，因此其調(diào)控區(qū)域可能存在多態(tài)性改變從而影響基因表達(dá)，進(jìn)而改變機(jī)體對(duì)疾病的易感性。目前有研究報(bào)道指出[13]，COX-2基因765G＞C位點(diǎn)基因多態(tài)性可能為COPD的易感基因位點(diǎn)。目前對(duì)于COX-2基因1195G/A基因位點(diǎn)與與膀胱癌、老年人阿司匹林抵抗有關(guān)[14]，而與COPD的關(guān)系研究報(bào)道較少。通過本研究發(fā)現(xiàn)，COX-2基因1195G＞A的A等位基因頻率為COPD的危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步研究證實(shí)發(fā)現(xiàn)，COX-2（1195G＞A）基因多態(tài)性 與 FEV1%pred、FEV1/FVC、MMP-9及COX-2具有相關(guān)性，說明MMP-9基因R279Q位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)COPD患者肺功能、炎癥反應(yīng)有明顯的刺激作用，導(dǎo)致COPD的發(fā)生發(fā)展。

需要指出的是，本研究采用ROC曲線分析MMP-9、COX-2對(duì)COPD的預(yù)測(cè)價(jià)值，主要有2個(gè)方面的原因：①M(fèi)MP-9、COX-2均已證實(shí)通過參與炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致COPD的發(fā)生發(fā)展，通過繪制ROC曲線分析2者在COPD中的預(yù)測(cè)價(jià)值，為臨床診斷COPD進(jìn)程提供依據(jù)；②繪制ROC曲線，分析獲得MMP-9、COX-2的最佳臨界值，從而有利于臨床COPD的發(fā)生，也便于MMP-9基因R279Q位點(diǎn)、COX-2基因1195G＞A位點(diǎn)與MMP-9、COX-2的關(guān)系研究。

綜上所述，MMP-9基因R279Q位點(diǎn)、COX-2基因1195G＞A位點(diǎn)多態(tài)性為COPD的危險(xiǎn)因素，與FEV1%pred、FEV1/FVC下 降 及MMP-9、COX-2升高相關(guān)。

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Association ofMMP9andCOX2gene polymorphisms with chronic obstructive pulmonary disease

Xiang Men1, Xi-yu Shang2(1. Department of Respiratory Medicine, Nanyang City Center Hospital, Nanyang, Henan 473000, China;2. Nanyang Medical College, Nanyang, Henan 473000, China)

ObjectiveTo investigate the relationship betweenMMP9andCOX2gene polymorphisms and chronic obstructive pulmonary disease.MethodsA total of 71 patients with chronic obstructive pulmonary disease(COPD group) and 63 cases of acute respiratory infection and healthy persons as the objects of study. PCR-RFLP method was used to determine the polymorphisms ofMMP9(R279Q) andCOX2(1195G＞A). The relationships between different genotypes and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) were analyzed.ResultsDifferences inMMP9gene R279Q and GG and AA genotypes ofCOX2(1195G＞A) between the NC group and the COPD group had statistical significance (P= 0.010 and 0.021), the differences in the frequency of G and A alleles had statistical significance (P= 0.000). The G allele frequency atMMP9R279Q locusand the A allele frequency ofCOX2gene 1195G＞A locuswere the risk factors for COPD.MMP9R279Q andCOX21195G＞A polymorphisms had correlations with FEV1%pred, FEV1/FVC, MMP-9 and COX-2 (P= 0.015, 0.018, 0.009, 0.009, 0.021, 0.017, 0.015 and 0.000 respectively).ConclusionsMMP9gene R279Q andCOX2gene 1195G＞A polymorphisms are the independent risk factors for COPD, and correlated with decrease of FEV1%pred and FEV1/FVC and increase of MMP-9 and COX-2.

chronic obstructive pulmonary disease; matrix metalloproteinase 9; cyclooxygenase 2; gene polymorphism

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.010

1005-8982（2018）01-0050-06

2017-02-16

尚喜雨，E-mail：shangxiyu163@163.com；Tel：13525660096

R563.9

A

（張西倩 編輯）