甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對西瓜枯萎病菌拮抗作用的研究

殷曉敏++吳瓊+金志強

摘 要 在西瓜枯萎病重病園區(qū)，從生長正常西瓜根際分離獲得一株細菌XG-1。經(jīng)對峙培養(yǎng)和孢子萌發(fā)抑制測定，XG-1對西瓜枯萎病菌菌絲生長、孢子萌發(fā)具有良好抑制效果。XG-1明顯抑制西瓜枯萎病菌菌絲向四周均勻擴展，抑菌帶寬度平均為0.6 cm。XG-1培養(yǎng)液處理病原菌菌絲體和分生孢子培養(yǎng)液后，可使尖孢鐮刀菌小型分生孢子由橢圓形致畸膨大數(shù)倍后成球形，使病原菌大型分生孢子由鐮刀形畸變成葫蘆串形，使菌絲體致畸膨大成串珠狀，同時使分生孢子在合適的條件下不能萌發(fā)或萌發(fā)后生長緩慢，產(chǎn)生很短的芽管，而失去侵染力。田間小區(qū)試驗表明，生防菌灌根處理西瓜苗死亡率為10%，相比對照處理的24.44%，能顯著降低植株發(fā)病率。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA序列分析將XG-1鑒定菌株為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

關(guān)鍵詞 甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌 ；西瓜 ；尖孢鐮刀菌 ；拮抗

中圖分類號 S436.5 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.11.011

Study on rhizospheric microflora of Bacillus methylotrophicus Strain

Antagonistic against Watermelon Fusarium Wilt Disease

YIN Xiaomin1，2） Wu Qiong1，2） JIN Zhiqiang1，2）

（1 Haikou Experimental Station， CATAS， Haikou 570102；

2 Hainan Key Laboratory of Watermelon Genetic Improvement， CATAS， Haikou 570102）

Abstract A biocontrol strain XG-1 was obtained from the soil rhizospheric microflora of healthy watermelon in the field heavily infected with Fusarium oxysporum f. sp. niveum （FON）. XG-1 effectively inhibited mycelium growth and conidia germination via dual-culture amd inhibition test. The dual culture FON with XG-1 resulted in good inhibitive zones of 0.6 cm. Culture supernatant of XG-1 deformed some cells of hyphae and spore to be strings of beads or abnormally spherical spore of pathogens of watermelon. Efficacy of strain XG-1 to control the wilt disease was 10% in pot trials，and significantly reduced the incidence of watermelon seedlings. Strain XG-1 was identified as Bacillus methylotrophicus according to its characteristics in morphology and molecular biology analysis according to morphological， physio-biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis.

Keywords Bacillus Methylotrophicus ； Watermelon ； Fusarium oxysporum f. sp. niveum ； Antagonism

西瓜枯萎病俗稱“死秧病”，由西瓜枯萎尖孢鐮刀菌西瓜?；停‵usarium oxysporum f. sp. niveum，F(xiàn)ON）侵染引起，是一種頑固性土傳病害，病原菌在土壤中可以存活數(shù)十年之久[1]。目前尚無有效的防治措施[2]，科研人員正尋求有效的防治途徑，其中以微生物為代表的生物防治西瓜枯萎病病害，可以回避化學(xué)防治的農(nóng)藥殘留污染問題，且病原菌不易產(chǎn)生抗性，已成為土傳病害防治中重要且有效防治措施[3]。

已報道的細菌類生防菌有熒光假單胞桿菌、惡臭假單胞桿菌和芽孢桿菌屬[3-4]，其抑菌機制主要有營養(yǎng)競爭、生態(tài)排斥和對峙拮抗等。這些菌株或直接使用，或分離其有效成分后使用，在生產(chǎn)上均已表現(xiàn)出較好的防效。筆者從西瓜根際分離、篩選到一株對FON有明顯拮抗作用的菌株XG-1，該菌株培養(yǎng)發(fā)酵液能導(dǎo)致西瓜尖孢鐮刀菌分生孢子不能正常萌發(fā)，失去致病力，病菌菌絲體畸形膨大從而不能侵染寄主植株。經(jīng)過分子生物學(xué)鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌在防治番茄早疫病和稻白葉枯病的研究已有報道[5-7]，而其對西瓜枯萎病菌的生防作用未見報道?，F(xiàn)將本研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

XG-1菌株分離于海南省三亞市崖州區(qū)發(fā)病西瓜地的健康植株根際土壤中；西瓜枯萎病尖孢鐮刀菌為本課題組所保存，簡寫為FON。

1.2 方法

1.2.1 XG-1對FON的平板抑菌帶檢測

平板對峙測定室內(nèi)離體條件下拮抗菌株對西瓜尖孢鐮刀菌菌絲體生長的抑制[8]。endprint

1.2.2 XG-1發(fā)酵液對FON的抑制作用

制備拮抗菌株培養(yǎng)液濾液[9]，將拮抗菌株經(jīng)斜面活化后，接種一環(huán)于內(nèi)裝50 mL NB的500 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，8 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)直徑0.22 μm微孔濾膜過濾即為拮抗細菌培養(yǎng)液濾液。

采用懸滴法[9]測定發(fā)酵液對FON的抑制作用，稀釋病原菌孢子液濃度為1×106 CFU/mL，調(diào)整拮抗菌株發(fā)酵液OD600為2.0[8]， 分別取50 uL病原菌孢子懸浮液與50 uL不同稀釋倍數(shù)的XG-1發(fā)酵液混合共培養(yǎng)，使XG-1發(fā)酵液的最終濃度為50%、25%、10%、5%、3%、0.5%。每處理設(shè)3個重復(fù)，以無菌水與病原菌孢子懸浮液混合為對照。在28℃下培養(yǎng)，12 h后顯微觀察病原菌孢子萌發(fā)情況，計算孢子萌發(fā)率、抑制率，得出其EC50值[9]。

1.2.3 XG-1發(fā)酵液對FON的拮抗遺傳穩(wěn)定性測定

將活化后XG-1劃線接種于NA固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)，每隔24 h轉(zhuǎn)接一次，共轉(zhuǎn)40次。用懸滴法測定轉(zhuǎn)管第1代、10代、20代、30代、35代和40代XG-1發(fā)酵液對西瓜尖孢鐮刀菌的抑菌作用[10]。以菌液濃度做對數(shù)變換，抑制率做概率變換，以濃度對數(shù)值Log（C）為自變量，概率單位為變量的回歸直線散點圖，概率對數(shù)變換后進行的毒力回歸計算[11]。計算轉(zhuǎn)管40代后，經(jīng)XG-1培養(yǎng)液濾液處理12 h后西瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)率以及由此得出的毒力曲線和EC50。

1.2.4 XG-1對FON的小區(qū)防治試驗

對西瓜苗小區(qū)防治試驗設(shè)3個處理：（A）XG-1發(fā)酵液稀釋50倍灌根；（B）15%惡霉靈水劑600倍液灌根；（C）10%噻唑膦微乳劑1 000倍液；（D）清水對照。每處理及對照設(shè)3個重復(fù)，每重復(fù)為一個小區(qū)，30株西瓜苗，4～5片真葉。移栽前及移栽后7 d，對西瓜苗進行灌根處理，移栽后60 d，計算小區(qū)西瓜植株的發(fā)病死亡率。從各小區(qū)發(fā)病的西瓜植株根際和長勢旺盛的健康植株根際取土樣，分析土壤微生物群落數(shù)量[12-13]。

1.2.5 XG-1的常規(guī)鑒定

參照文獻[14]進行亞甲蘭染色、革蘭氏染色、芽孢染色和其他生理生化指標的測定。根據(jù)文獻[15-16]進行分類檢索表鑒定。

1.2.6 XG-1的分子生物學(xué)鑒定

制備拮抗細菌基因組DNA[17]，進行細菌16S rDNA序列比對分析。根據(jù)原核微生物16S rDNA保守序列設(shè)計引物27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）。引物委托上海英俊生物公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，引物 27f和1492r（25 pmol）各1 μL，dNTP Mix（2.5 μmol/L）0.5μl，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.5 μL，ddH2O 17.5 μL，DNA模板30～50 ng。PCR擴增反應(yīng)條件：95℃ 1 min，55℃ 40 s，72℃ 2 min，共30循環(huán)，然后72℃保持7 min。PCR產(chǎn)物委托生物公司直接進行雙向引物測序。利用BLAST軟件將獲得的基因序列進行序列分析，并于GenBank中已知的16S rDNA序列進行同源性比較。采用DNA Star中的Phylogenetic Tree建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 XG-1對FON的拮抗作用測定

平板對峙培養(yǎng)7 d后，XG-1明顯抑制西瓜枯萎病菌菌絲向四周均勻擴展，抑菌帶寬度平均為0.6 cm（圖1-b）。對照病原真菌菌落鋪展平板呈圓形擴展，氣生菌絲體為白色至淡紫色棉絮狀，稀疏（圖1-a）。

XG-1菌株發(fā)酵液對病菌孢子萌發(fā)的抑制作用測定表明，經(jīng)濃度為50%的XG-1發(fā)酵液處理12 h，對孢子萌發(fā)的抑制率可以達到99.8%，25%和10%的XG-1發(fā)酵液對孢子萌發(fā)抑制率分別為97.6%和70.3%以上。結(jié)合顯微觀察，可以看到使尖孢鐮刀菌小型分生孢子由橢圓形致畸膨大數(shù)倍后成球形（圖2），使病原菌大型分生孢子由鐮刀形畸變成葫蘆串形（圖3），使菌絲體致畸膨大成串珠狀（圖4），同時使分生孢子在合適的條件下不能萌發(fā)或萌發(fā)后生長緩慢產(chǎn)生很短的芽管，而失去侵染力。對照小型分生孢子長橢圓形（圖5），有0～1隔，大型分生孢子鐮刀形或紡錘形，有3～5隔，可以正常萌發(fā)形成芽管（圖6）。

2.2 XG-1對FON拮抗作用的遺傳穩(wěn)定性測定

菌株XG-1從第1代轉(zhuǎn)管到第40代，測定轉(zhuǎn)管后的1代、10代、20代、30代、35代、40代菌株培養(yǎng)濾液對西瓜枯萎病菌拮抗作用的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，菌株XG-1轉(zhuǎn)管40代培養(yǎng)液濾液抑制FON的EC50均在4.15%以下，XG-1-1的EC50 2.03%相比XG-1-40下降了2.12%，差異不顯著（表1）。

2.3 XG-1處理西瓜植株發(fā)病死亡率統(tǒng)計

用生防菌、惡霉靈和噻唑膦三種藥劑灌根處理4～5片葉的西瓜苗，60 d后，單株出現(xiàn)了較多的死秧（圖7），縱切西瓜莖部維管束變褐色（圖8），而健康植株維管束無褐變（圖9），以西瓜植株莖葉干枯，且沒有果實或果實太小無商品價值，即按西瓜植株死亡計算。調(diào)查西瓜發(fā)病死亡率，統(tǒng)計結(jié)果表明，3種藥劑處理后死亡率分別為10%、16.67%和17.78%，相比對照的24.44%低，其中生防菌處理組西瓜苗死亡率與惡霉靈和噻唑膦及對照組西瓜苗死亡率差異顯著（表2）。

西瓜定植后60 d，檢測發(fā)病植株根際和健康植株根際微生物種類和數(shù)量，分離結(jié)果表明，A、B、C、D 4種處理中只要發(fā)病死亡西瓜苗根際土壤中，均可以檢測到較高濃度的西瓜枯萎病菌數(shù)量（表3），其中以D-對照的為最高，其次為處理C-噻唑膦，達到9.49×102和5.52×102 CFU/g，處理A-健康西瓜苗根系土壤中，尖孢鐮刀菌含量也達到2.86×102 CFU/g，與A-生防菌-病株根際土壤中尖孢鐮刀菌含量基本相同。各處理植株根際放線菌數(shù)量和種類，A-健康植株與其他各處理病株根際放線菌含量差異顯著，比A-生防菌-病株的6.61×103 CFU/g高出11倍，比B-惡霉靈-病株的5.29×102 CFU/g高出141.18倍。病株苗根際土壤其他真菌和細菌種類和數(shù)量與健康苗相比，差別不明顯（表4）。endprint

2.4 XG-1的形態(tài)、生理生化鑒定

菌株XG-1在牛肉膏蛋白胨（NB）培養(yǎng)基上形成的菌落為圓形，四周光滑，乳白色，表面有光澤，質(zhì)地干燥；細胞形狀為桿狀（圖10）；厭氧生長；革蘭氏染色呈陽性（圖11），具有芽孢（圖12）。接觸霉測定、脂肪酶反應(yīng)為陽性；酪蛋白、絡(luò)氨酸反應(yīng)為陽性；V-P試驗和硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性；能利用D-葡萄糖，D-木糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，不能利用檸檬酸鹽；能水解淀粉和明膠；菌株接入到2%NaCl的NB培養(yǎng)液中發(fā)酵24 h后渾濁。

根據(jù)上述菌株XG-1的生物學(xué)形態(tài)和生理生化特征，結(jié)合文獻[15-16]進行分類檢索表比對，發(fā)現(xiàn)該菌株符合芽孢桿菌屬的特征范圍，將其初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）。

2.5 XG-1的16S rDNA序列分析

用引物27f和1492r對XG-1基因組DNA的PCR擴增結(jié)果得到約1.5 kb的PCR產(chǎn)物。測定結(jié)果表明，該序列長度為1 457 bp。由16S rDNA序列結(jié)果算出其XG-1 DNA中（G+C）%=55.39%。將該序列進行BLAST和利 Phylogenetic Tree分析軟件與下載的同源序列進行比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明：XG-1與枯草芽孢桿菌（HQ662590.1、KT247504.1、KT600022.1、KP184712.1、JF899281.1、KM201258.1）聚為同一個族群，同源性高達99%（圖13）。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示與Bacillus methylotrophicus strain Mo-Bm-5（HQ662590.1）處在同一個分支，由此可以推斷XG-1為芽孢桿菌屬。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，將XG-1鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus Methylotrophicu）。

3 討論與結(jié)論

在生防菌株直接控制植物的病原菌及其所致病害中，拮抗菌防治植物土傳病害應(yīng)用比較成功，主要源于土傳病害病原菌與土壤因子的關(guān)系更為密切。利用生防因子在防治西瓜枯萎病上，已有報道。如鏈霉菌產(chǎn)生的中生霉素能明顯引起菌絲細胞內(nèi)原生質(zhì)凝集，適合濃度的中生霉素抑制孢子萌發(fā)率在100%[18]。農(nóng)抗120能夠提高西瓜幼苗抗枯萎病病原菌毒素致萎的能力，而對病原菌孢子的萌發(fā)和菌絲的形態(tài)無明顯影響[19]。本研究報道的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，顯微明顯觀察到可使尖孢鐮刀菌分生孢子由鐮刀形畸變膨大數(shù)倍后成球形，使菌絲體致畸膨大成串珠狀，這一致畸現(xiàn)象與枯草芽孢桿菌抑制香蕉果實炭疽病分生孢子時，其頂端或中間會產(chǎn)生1個圓球狀泡有些相似之處[20]。且本研究報道的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌在轉(zhuǎn)管40代后，培養(yǎng)液濾液抑制FON孢子懸浮液的EC50值沒有明顯提高，表現(xiàn)出良好的生防菌株遺傳穩(wěn)定性，表明該菌株具有很大的開發(fā)利用價值。

在體外顯微觀察到生防菌株可以直接作用于病原菌本身使其致畸形外，田間試驗結(jié)果顯示，應(yīng)用生防菌株XG-1可以改善植株根際土壤微生態(tài)，以保證植株其按遺傳因子所決定的發(fā)育程序健康生長，降低西瓜植株死亡率。鑒于西瓜枯萎病菌可以直接從植株傷口侵入，針對西瓜田土壤線蟲比較嚴重地塊，選用殺線蟲劑噻唑膦，可以減少線蟲危害根系造成傷口數(shù)量，在試驗設(shè)計時，通過噻唑膦減少線蟲危害，從而減少枯萎病菌通過傷口侵入根系的機會。結(jié)果表明，在各個處理病株和健康植株根際土壤中都分離出大量的枯萎病菌，結(jié)合田間發(fā)病情況，參考去年該田塊發(fā)病也比較嚴重，說明該田塊枯萎病菌含量較大，適宜做藥劑篩選處理區(qū)。關(guān)于西瓜苗是否發(fā)病，發(fā)病植株和健康植株根際土壤的尖孢鐮刀菌含量基本相同，為2.86×102和 2.77×102 CFU/g，推測認為，XG-1菌株施入土壤后發(fā)揮拮抗作用，推測其可能對土壤生態(tài)系統(tǒng)的改善和提高植株本身對病原菌的抵抗力密切相關(guān)。結(jié)合試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)健康植株根際土壤的放線菌數(shù)量相比病株根際放線菌數(shù)量差異顯著，據(jù)報道多數(shù)根際放線菌可以分泌抗生素，或可抑制植物病原微生物的繁殖，基于植株根際土壤微生物能快速對環(huán)境變化做出反應(yīng)，推測植株根際土壤中放線菌數(shù)量多少是否與枯萎病的發(fā)病有密切關(guān)系。

參考文獻

[1] Larkin R P， Hopkins D L， Martin F N.Ecology of Fusarium oxysporum f.sp. niveum in soils suppressive and conducive to Fusarium wilt of watermelon[J]. Phytopathology， 1993 ， 83 （10）： 1 097-1 105.

[2] 殷曉敏，陳 弟，鄭服叢. 一株對新月彎孢霉等香蕉病原真菌具有良好拮抗作用的菊歐氏桿菌[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，28（3）：38-40.

[3] Kathryne L， Everts， Jennifer C. Himmelstein.Fusarium wilt of watermelon： Towards sustainable management of a re-emerging plant disease[J]. Crop Protection， 2015， 73： 93-99.

[4] HS Wu，XN Yang，JQ Fan.Suppression of Fusarium wilt of watermelon by a bio-organic fertilizer containing combinations of antagonistic microorganisms[J]. BioControl ， 2009， 54（2）： 287-300.

[5] M Madhaiyan， S Poonguzhali， K Soonwo， et al. Bacillus methylotrophicus sp. nov. a novel species of methanol utilizing， plant-growth promoting bacterium isolated from rice[J]. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology. 2010， 60（10）： 2 490-2 495.endprint

[6] 劉利強，楊士玲，陳 強，等. 30億個/g甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌可濕性粉劑防治黃瓜灰霉病田間藥效試驗[J]?，F(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014（9）：130-130.

[7] 呂 倩，胡江春，王 楠，等. 南海深海甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SHB114抗真菌脂肽活性產(chǎn)物的研究[J]。 中國生物防治學(xué)報，2014， 30（1）：113-120.

[8] 殷曉敏，陳 弟，吳紅萍，等. 一株對香蕉枯萎病菌具有良好拮抗作用的菊歐氏桿菌[J]. 中國生物防治， 2009，29（1）：104-109.

[9] 殷曉敏. 兩株香蕉內(nèi)生細菌的分離鑒定及其對香蕉枯萎病的生防效果評價[C]. 海南大學(xué)，碩士論文，2008.

[10] 殷曉敏，陳 弟，吳紅萍，等. 香蕉內(nèi)在拮抗細菌研究Ⅰ——菌株B215的分離及分子鑒定[J]. 熱帶作物學(xué)報，2008，29（5）：636-640.

[11] 裘炯良，顏 艷，鄭劍寧. 基于SAS的殺蟲劑毒力篩選計算機實現(xiàn)[J]. 中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2010，21（5）：478-481.

[12] 饒正華. 飼料中細菌CFU統(tǒng)計方法[J]. 飼料博覽， 2002（10）：28-29.

[13] 徐 林，黃啟星，左 嬌，等. 南繁條件下轉(zhuǎn)基因水稻對根際土壤微生物的影響[J]. 生物安全學(xué)報，2012， 21（1）：61-66.

[14] 方中達. 植病研究方法[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 1998.

[15] 東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[16] 王金生. 植物病原細菌學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999.

[17] Ausubel F M， Brent R. 精編分子生物學(xué)試驗指南[M]. 顏子穎等譯. 北京：科學(xué)出版社，1998.

[18] 孟祥波，彭殿林. 瓜類枯萎病防治研究進展[J]. 上海蔬菜，2009（6）：10-12.

[19] 劉 波，朱育菁，周涵韜. 農(nóng)作物枯萎病的研究進展[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報（自然版），2004， 43（s1）：47-58.

[20] 譚志瓊，淦國英，張榮意. 枯草芽孢桿菌B68對香蕉果實潛伏炭疽菌的抑制作用[J]. 農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用，2006（5）：1-4.endprint