鏈格孢菌侵染采后甜瓜果實(shí)組織幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶基因表達(dá)分析

白羽嘉，張培嶺，黃 偉，馮作山，李 夢(mèng)

鏈格孢菌侵染采后甜瓜果實(shí)組織幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶基因表達(dá)分析

白羽嘉，張培嶺，黃 偉，馮作山，李 夢(mèng)

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

以伽師瓜（抗病性強(qiáng)）和86-1甜瓜（抗病性一般）果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，研究鏈格孢菌（Alternaria alternata）侵染后幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHT）和β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）基因表達(dá)規(guī)律。甜瓜果實(shí)接種A. alternata，7 ℃貯藏，測(cè)定病斑大小，熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定CmCht1、CmCht2和CmGlu相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明：伽師瓜和86-1甜瓜接種A. alternata，在侵染9 d時(shí)出現(xiàn)病斑，9～24 d病斑直徑不斷擴(kuò)大，86-1甜瓜病斑直徑大于伽師瓜，侵染24 d時(shí)86-1甜瓜病斑直徑是伽師瓜的1.12 倍，伽師瓜對(duì)A. alternata侵染的抵抗能力要強(qiáng)于86-1甜瓜。在侵染期間，伽師瓜和86-1甜瓜CmCht1、CmCht2和CmGlu相對(duì)表達(dá)量顯著提高，呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，伽師瓜和86-1甜瓜CmCht1、CmCht2和CmGlu相對(duì)表達(dá)量最高峰出現(xiàn)時(shí)間分別相差3、6、3 d，伽師瓜CmCht1、CmCht2相對(duì)表達(dá)量始終高于86-1甜瓜，CmGlu相對(duì)表達(dá)量在侵染12～24 d高于86-1甜瓜。在侵染期間CmCht1、CmCht2和CmGlu表達(dá)規(guī)律存在差異，侵染前期CmCht1、CmCht2相對(duì)表達(dá)量較高，侵染中期和后期CmGlu相對(duì)表達(dá)量較高；A. alternata侵染前期主要誘導(dǎo)了CHT基因的表達(dá)，中期和后期主要誘導(dǎo)了GLU的基因表達(dá)，CHT和GLU的基因協(xié)同表達(dá)，起到抗病性的作用。伽師瓜抗病性強(qiáng)于86-1甜瓜與CHT和GLU的基因的表達(dá)密切相關(guān)。

甜瓜；鏈格孢菌；幾丁質(zhì)酶；β-1,3-葡聚糖酶；基因表達(dá)

新疆是國(guó)內(nèi)優(yōu)質(zhì)甜瓜的原產(chǎn)地和主產(chǎn)區(qū)[1-2]。甜瓜在田間種植、采后貯運(yùn)過(guò)程中始終遭受到病原菌的持續(xù)侵染，采后病害發(fā)生嚴(yán)重[3]。甜瓜采后微生物侵染引起的病害主要有黑斑病、白霉病、軟腐病等[4-5]。由鏈格孢菌（Alternaria alternata）引起的黑斑病是甜瓜貯藏期危害性最大的病害[6-8]。病程相關(guān)蛋白（pathogenesis related proteins，PRs）是果實(shí)受生物或非生物脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生并積累的一類(lèi)蛋白質(zhì)總稱(chēng)，是果實(shí)防御體系的重要組成部分，表現(xiàn)出一定的抗菌作用[9]。PRs在植物體被病菌感染或誘導(dǎo)后迅速產(chǎn)生并積累，但在健康植物中不存在或表現(xiàn)微弱，因此PRs與植物受病原菌感染或抗病誘導(dǎo)密切相關(guān)[10-11]。目前果實(shí)采后PRs的研究主要集中在幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHT）[12-13]和β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）上[14-15]。植物體受病原微生物侵染后，CHT、GLU等PRs被誘導(dǎo)合成，從而起到抗病性的作用[16]。已有相關(guān)研究從PRs基因調(diào)控及其編碼的蛋白生物活性等方面揭示果實(shí)采后抗病性的機(jī)制[17-18]。

目前甜瓜采后主要采用各種保鮮技術(shù)及誘抗處理延長(zhǎng)貯藏期，如氣調(diào)保鮮[19]、水楊酸誘抗[20]、BTH誘抗[21]、殼聚糖處理[22]等，針對(duì)甜瓜貯運(yùn)保鮮所采取的采前、采后等各種處理措施是外部措施，而甜瓜內(nèi)源性抵御病原菌侵染的能力是抗病性的關(guān)鍵。與86-1甜瓜相比，伽師瓜耐貯藏性強(qiáng)，優(yōu)良的抗病性是耐藏性重要支撐，伽師瓜應(yīng)具備更強(qiáng)、有效抵抗病菌侵染的防御體系。

前期研究克隆了甜瓜CmCht1、CmCht2和CmGlu。CmCht1和CmCht2均編碼Ⅱ型CHT；CmGlu編碼GLU。幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的主要組成物質(zhì)，CHT和GLU具有協(xié)同殺菌的作用，當(dāng)二者協(xié)同表達(dá)時(shí)，可以水解病原真菌的細(xì)胞壁以抵御侵害[23]。實(shí)驗(yàn)以伽師瓜和86-1甜瓜為材料，采后接種A. alternata，采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）分析侵染期間果實(shí)CHT和GLU的基因表達(dá)規(guī)律，了解甜瓜采后抵抗病原菌侵染的內(nèi)在機(jī)制，為進(jìn)一步研究甜瓜采后抗病性調(diào)控技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

伽師瓜，全生育期112 d，選擇質(zhì)量（4.0±0.25）kg、可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于14%的果實(shí)采收。采收自新疆喀什地區(qū)伽師縣八鄉(xiāng)，采收3 d內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室處理。

86-1甜瓜，全生育期98 d，選擇質(zhì)量（3.8±0.25）kg、可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于16%的果實(shí)采收。采收自新疆喀什地區(qū)伽師縣八鄉(xiāng)，采收3 d內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室處理。

A. alternata，2013年分離自伽師縣八鄉(xiāng)伽師瓜黑斑病中，保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

植物總RNA提取試劑盒（TransZol Plant，ET121）、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，AT311-03） 北京全式金生物技術(shù)有限公司；定光定量PCR試劑盒（SYBR Select Master Mix，4472920） 美國(guó)ABI公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；Tris-Base、DEPC、4S Red Plus Nucleic Acid Stain（NB6695）、6× RNA Loading Dye（B548323） 生工生物工程（上海）股份有限公司；冰乙酸、EDTA-Na2、95%乙醇、異丙醇、氯仿（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Biofuge Primo R高速冷凍離心機(jī)、Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì) 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；T-100梯度PCR儀、PowerPac Universal電泳儀、Sub Cell GT水平電泳槽 美國(guó)伯樂(lè)公司；Gene Genius Bio Image凝膠成像系統(tǒng) 英國(guó)SynGene公司；Stepone plus型熒光定量PCR儀 美國(guó)ABI公司；LDZX-50KBS高溫滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械公司；JH-SCA凈化工作臺(tái) 上海鴻都電子科技有限公司；GL-88B旋渦混合器 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甜瓜A. alternata侵染

甜瓜果實(shí)用2%的雙氧水表面清洗30 s后用清水沖洗干凈，晾干。用無(wú)菌打孔器在甜瓜果實(shí)中部等距離穿刺打孔6 個(gè)（直徑3.5 mm，深度4.0 mm），每孔接入15 μL A. alternata孢子懸浮液（孢子數(shù)1×106個(gè)/mL，含0.05% Tween-20），對(duì)照接入等量無(wú)菌水。接種后的甜瓜果實(shí)置于（7.0±1.5）℃、相對(duì)濕度80%～85%冷庫(kù)中貯藏。分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24 d取樣，收集甜瓜病斑周?chē)?.50 cm處果肉組織，液氮速凍后，于-80 ℃的冰箱中保存。

1.3.2 甜瓜果實(shí)病斑大小的測(cè)定與計(jì)算

在接種A. alternata部位將甜瓜果實(shí)縱向剖開(kāi)，游標(biāo)卡尺測(cè)定病斑直徑（測(cè)量果肉過(guò)敏反應(yīng)組織），計(jì)算平均值。

1.3.3 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)

CmCht1-F/R參考甜瓜CHT基因序列（KT921405、KU18790），CmCht2-F/R參考甜瓜CHT基因序列（KT921406、KU236388），CmGlu-F/R參考甜瓜GLU基因序列（KT921408、KU356919），內(nèi)參基因CmGAPDH-F/R參考甜瓜甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因序列（XM_008441195.2），具體引物見(jiàn)表1。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

1.3.4 總RNA的提取

取甜瓜果肉液氮研磨，按照植物總RNA提取試劑盒（TransZol Plant，ET121）說(shuō)明書(shū)提取總RNA。1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)完整性。Nanodrop 2000測(cè)定RNA的A260nm/A280nm、A260nm/230nm與濃度。

1.3.5 cDNA的合成

使用TransScript One-Step gDNA Removal And cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。總RNA 50 ng～5 μg、Primer（0.1 μg/μL）1 μL、2×TS Reaction Mix 10 μL、TransScript?RT/RI Enzyme Mix 1 μL、gDNA Remover 1 μL，RNase-free ddH2O補(bǔ)足至20 μL。輕輕混勻后，25 ℃ 10 min；42 ℃ 30 min；85 ℃ 5 s，反應(yīng)結(jié)束后于-20 ℃保存。

1.3.6 熒光定量PCR

熒光定量PCR總體系20 μL，包括：SYBR Select Master Mix 10 μL、primer F 0.4 μL、primer R 0.4 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 8.2 μL，混合均勻。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min（40 個(gè)循環(huán)）。以CmGAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算甜瓜CmCht1、CmCht2和CmGlu的相對(duì)表達(dá)量[24]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，OriginPro 8.5繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 A. alternata侵染甜瓜果實(shí)病斑直徑

圖1 甜瓜果實(shí)接種A. alternata病斑直徑Fig. 1 Lesion diameter of 86-1 muskmelon inoculated with A. alternata

甜瓜果實(shí)接種A. alternata，每3 d測(cè)定甜瓜病斑大小（圖1）。伽師瓜和86-1甜瓜在侵染前6 d沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)，在侵染9 d時(shí)出現(xiàn)病斑，9～24 d病斑直徑不斷擴(kuò)大，且86-1甜瓜的病斑直徑大于伽師瓜，差異顯著（P＜0.05）。侵染24 d時(shí)伽師瓜和86-1甜瓜病斑直徑分別為2.86 cm和3.20 cm，86-1甜瓜病斑直徑是伽師瓜的1.12 倍。伽師瓜對(duì)A. alternata侵染的抵抗能力要大于86-1甜瓜。

2.2 RNA提取結(jié)果

提取甜瓜果肉總RNA，電泳結(jié)果28S和18S rRNA條帶清晰（圖2），RNA完整性較好，RNA樣品A260nm/A280nm比值為1.8～2.0之間。RNA的完整性較好，純度高，可以用來(lái)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

圖2 甜瓜果肉RNA提取結(jié)果Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of RNA isolated from infected muskmelon

2.3 熒光定量PCR引物特異性檢測(cè)結(jié)果

CmCht1-F/R、CmCht2-F/R、CmGlu-F/R和CmGAPDH-F/R的PCR結(jié)果顯示擴(kuò)增片段大小正確，無(wú)引物二聚體產(chǎn)生（圖3）。

圖3 熒光定量PCR引物擴(kuò)增結(jié)果Fig. 3 Real-time quantitative PCR detection

目的基因和內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增熔解曲線(xiàn)見(jiàn)圖4。伽師瓜和86-1甜瓜的CmCht1、CmCht2、CmGlu和CmGAPDH的熒光信號(hào)隨著溫度的逐漸升高而增大，當(dāng)溫度接近退火溫度（Tm）時(shí)，熒光信號(hào)突然變化加大，出現(xiàn)峰值，且只單一的熔點(diǎn)峰，無(wú)引物二聚體的形成，熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物專(zhuān)一，引物的特異性較強(qiáng)。

圖4 CmCht1（A）、CmCht2（B）、CmGlu（C）和CmGAPDH（D）熔解曲線(xiàn)Fig. 4 Melting curves for CmCht1, CmCht2, CmGlu, and CmGAPDH

2.4 A. alternata侵染甜瓜果實(shí)CHT和GLU的基因表達(dá)量的變化

2.4.1 A. alternata侵染甜瓜果實(shí)CmCht1基因表達(dá)變化

圖5 A. alternata侵染甜瓜果實(shí)CmCht1基因表達(dá)量變化Fig. 5 Change in CmCht1 expression in infected muskmelon during storage

如圖5所示，與對(duì)照相比，伽師瓜接種A. alternata在侵染期間CmCht1基因相對(duì)表達(dá)量明顯提高，呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，差異顯著（P＜0.05）。伽師瓜在侵染1～12 d CmCht1基因表達(dá)水平逐漸提高，侵染12 d時(shí)CmCht1基因相對(duì)表達(dá)量最高，為0 d的3.03 倍；侵染15～24 d CmCht1基因相對(duì)表達(dá)水平逐漸降低，侵染24 d時(shí)CmCht1基因相對(duì)表達(dá)量為0 d的1.52 倍。

與對(duì)照相比，86-1甜瓜接種A. alternata在侵染期間CmCht1基因相對(duì)表達(dá)量明顯提高，呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，差異顯著（P＜0.05）。86-1在侵染1～15 d CmCht1基因表達(dá)水平逐漸提高，侵染15 d時(shí)CmCht1基因相對(duì)表達(dá)量最高，為0 d的2.54 倍；侵染18～24 d CmCht1基因表達(dá)水平逐漸降低，侵染24 d時(shí)基因相對(duì)表達(dá)量為0 d的1.22 倍。

A. alternata侵染甜瓜果實(shí)，伽師瓜和86-1甜瓜CmCht1基因表達(dá)最高峰出現(xiàn)的時(shí)間相差3 d，但伽師瓜中CmCht1基因相對(duì)表達(dá)量始終高于86-1甜瓜果實(shí)，且差異顯著。

2.4.2 A. alternata侵染甜瓜果實(shí)CmCht2基因表達(dá)變化

圖6 A. alternata侵染甜瓜果實(shí)CmCht2基因表達(dá)量變化Fig. 6 Change in CmCht2 expression in infected muskmelon during storage

如圖6所示，與對(duì)照相比，伽師瓜接種A. alternata在侵染期間CmCht2基因相對(duì)表達(dá)量明顯提高，呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，差異顯著（P＜0.05）。伽師瓜在侵染1～12 d CmCht2基因表達(dá)水平逐漸提高，12 d時(shí)CmCht2基因相對(duì)表達(dá)量最高，為0 d的3.54 倍；侵染15～24 d CmCht2基因表達(dá)水平逐漸降低，侵染24 d時(shí)基因相對(duì)表達(dá)量為0 d的1.24 倍。

與對(duì)照相比，86-1甜瓜接種A. alternata在侵染期間CmCht2基因相對(duì)表達(dá)量明顯提高，呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，差異顯著（P＜0.05）。86-1甜瓜在侵染1～6 d CmCht2基因表達(dá)水平逐漸提高，6 d時(shí)CmCht2基因相對(duì)表達(dá)量最高，為0 d的1.91 倍；侵染9～24 d CmCht2基因相對(duì)表達(dá)水平逐漸降低，且18～24 d 基因相對(duì)表達(dá)量變化不顯著（P＞0.05），分別為0 d的1.43、1.22 倍和1.13 倍。

A. alternata侵染甜瓜果實(shí)后，伽師瓜CmCht2基因表達(dá)最高峰出現(xiàn)的時(shí)間比86-1甜瓜推遲6 d。伽師瓜CmCht2基因相對(duì)表達(dá)量始終高于86-1甜瓜，且在3～21 d相對(duì)表達(dá)量差異顯著。

2.4.3 A. alternata侵染甜瓜果實(shí)CmGlu基因表達(dá)變化

圖7 A. alternata侵染甜瓜果實(shí)CmGlu基因表達(dá)量變化Fig. 7 Change in CmGlu expression in infected muskmelon during storage

如圖7所示，與對(duì)照相比，伽師瓜接種A. alternata在侵染期間CmGlu基因相對(duì)表達(dá)量明顯提高，呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，差異顯著（P＜0.05）。伽師瓜在侵染1～15 d CmGlu基因表達(dá)水平逐漸提高，15 d時(shí)CmGlu基因相對(duì)表達(dá)量最高，為0 d的4.33 倍；侵染18～24 d CmGlu基因表達(dá)水平逐漸降低，但其相對(duì)表達(dá)量仍維持在較高水平，分別為0 d的4.26、4.18 倍和3.57 倍。

與對(duì)照相比，86-1甜瓜接種A. alternata在侵染期間CmGlu基因相對(duì)表達(dá)量明顯提高，呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，差異顯著（P＜0.05）。86-1甜瓜在侵染1～12 d CmGlu基因表達(dá)水平逐漸提高，12 d時(shí)CmGlu基因相對(duì)表達(dá)量最高，為0 d的3.35倍；侵染15～24 d CmGlu基因表達(dá)水平逐漸降低，侵染24 d時(shí)基因相對(duì)表達(dá)量為0 d的1.97 倍。

A. alternata侵染甜瓜果實(shí)，0～9 d伽師瓜CmGlu基因相對(duì)表達(dá)量低于86-1甜瓜，12～24 d CmGlu基因相對(duì)表達(dá)量高于86-1甜瓜，差異顯著。伽師瓜比86-1甜瓜CmGlu基因表達(dá)最高峰出現(xiàn)的時(shí)間推遲3 d。

2.4.4 A. alternata侵染伽師瓜果實(shí)CHT和GLU的基因表達(dá)規(guī)律

圖8 A. alternata侵染伽師瓜CmCht1、CmCht2和CmGlu基因表達(dá)量變化Fig. 8 Changes in CmCht1, CmCht2, and CmGlu expression in infected Jiashi muskmelon during storage

伽師瓜接種A. alternata，在侵染期間CmCht1、CmCht2和CmGlu相對(duì)表達(dá)量變化差異顯著（P＜0.05），均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)（圖8）。CmCht1和CmCht2在侵染0～12 d相對(duì)表達(dá)量升高，侵染15～24 d相對(duì)表達(dá)量降低；CmCht2在侵染3～15 d相對(duì)表達(dá)量高于CmCht1，18 d后CmCht1相對(duì)表達(dá)量高于CmCht2。CmGlu在侵染0～15 d相對(duì)表達(dá)量顯著提高，18 d后出現(xiàn)降低趨勢(shì)。CmGlu在侵染0～9 d相對(duì)表達(dá)量低于CmCht1與CmCht2，但在12 d后CmGlu相對(duì)表達(dá)量高于CmCht1與CmCht2。

A. alternata侵染伽師瓜后CmCht1、CmCht2和CmGlu表達(dá)模式不同，侵染前期CHT的基因大量表達(dá)，CHT起到主要的抗病性作用；而在侵染的中后期則是GLU的基因表達(dá)量較高，GLU起主要的抗病性作用。

2.4.5 A. alternata侵染86-1甜瓜果實(shí)CHT和GLU的基因表達(dá)規(guī)律

86-1甜瓜接種A. alternata，在侵染期間CmCht1、CmCht2和CmGlu相對(duì)表達(dá)量變化差異顯著（P＜0.05），均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)（圖9）。CmCht1在侵染0～15 d相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，侵染18 d后相對(duì)表達(dá)量逐漸降低；CmCht2在侵染0～6 d相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，侵染6 d后相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，在整個(gè)侵染過(guò)程中CmCht1的相對(duì)表達(dá)量始終高于CmCht2。CmGlu在侵染0～12 d顯著提高，15 d后出現(xiàn)降低趨勢(shì)。CmGlu在侵染0～6 d相對(duì)表達(dá)量低于CmCht1與CmCht2，但在9 d后CmGlu相對(duì)表達(dá)量高于CmCht1與CmCht2。

圖9 A. alternata侵染86-1甜瓜CmCht1、CmCht2和CmGlu基因表達(dá)量變化Fig. 9 Changes in CmCht1, CmCht2, and CmGlu expression in infected 86-1 muskmelon during storage

A. alternata侵染86-1甜瓜后CmCht1、CmCht2和CmGlu表達(dá)模式不同，侵染前期CHT的基因大量表達(dá)，CHT起到主要的抗病性作用；而在侵染中期和后期則是GLU的基因相對(duì)表達(dá)量較高，GLU起主要的抗病性作用。

3 結(jié)論與討論

伽師瓜和86-1甜瓜均在侵染9 d時(shí)出現(xiàn)病斑，9～24 d病斑直徑不斷擴(kuò)大，且86-1甜瓜病斑直徑大于伽師瓜。侵染24 d時(shí)86-1甜瓜病斑直徑是伽師瓜的1.12 倍。因此，伽師瓜對(duì)A. alternata侵染的抵抗能力要大于86-1甜瓜。

伽師瓜和86-1甜瓜A. alternata侵染期間，CmCht1、CmCht2和CmGlu相對(duì)表達(dá)量明顯提高，均表現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)，伽師瓜CmCht1、CmCht2相對(duì)表達(dá)量始終高于86-1甜瓜，CmGlu在侵染后12 d開(kāi)始相對(duì)表達(dá)量高于86-1甜瓜。伽師瓜和86-1甜瓜CmCht1、CmCht2和CmGlu表達(dá)最高峰出現(xiàn)的時(shí)間分別相差3、6、3 d。

伽師瓜和86-1甜瓜A. alternata侵染期間，CmCht1、CmCht2和CmGlu表達(dá)模式不同，貯藏前期CmCht1、CmCht2相對(duì)表達(dá)量較高，病原菌主要誘導(dǎo)了CHT基因的表達(dá)；貯藏中期和后期CmGlu相對(duì)表達(dá)量較高，此時(shí)病原菌主要誘導(dǎo)了GLU基因的表達(dá)。

與對(duì)照處理相比較（接入等量無(wú)菌水），A. alternata侵染處理CmCht1、CmCht2和CmGlu相對(duì)表達(dá)量顯著提高。CHT和GLU是重要的PRs，與植物受病原菌侵染或抗病誘導(dǎo)密切相關(guān)，PRs在植物體被病菌侵染后迅速誘導(dǎo)表達(dá)，而在健康植物中不存在或表達(dá)微弱[10-11]，甜瓜果實(shí)在A. alternata侵染期間CHT和GLU基因相對(duì)表達(dá)量顯著提高，表明甜瓜組織對(duì)病原菌的侵染產(chǎn)生了響應(yīng)，病原菌誘導(dǎo)了甜瓜抗病相關(guān)蛋白基因的表達(dá)，以抵御病原菌的侵染。

A. alternata侵染伽師瓜和86-1甜瓜后，CmCht1、CmCht2和CmGlu表達(dá)規(guī)律不同，前期CHT的基因相對(duì)表達(dá)量較高，推測(cè)CHT起主要的抗病性作用；中期和后期GLU基因的相對(duì)表達(dá)量較高，推測(cè)GLU起重要的抗病性作用。CHT和GLU基因協(xié)調(diào)表達(dá)、共同作用于真菌細(xì)胞壁中的多糖成分，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，起到抗病性的作用。

伽師瓜和86-1甜瓜接種A. alternata，86-1甜瓜病斑直徑始終大于伽師瓜，這表明伽師瓜對(duì)A. alternata侵染的抵抗能力要強(qiáng)于86-1甜瓜。伽師瓜CmCht1、CmCht2相對(duì)表達(dá)量始終高于86-1甜瓜，CmGlu相對(duì)表達(dá)量在侵染后12 d開(kāi)始顯著高于86-1甜瓜，CHT和GLU基因的大量表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)CHT和GLU的積累，因此伽師瓜果實(shí)就具有更強(qiáng)的抗病性。

抗病性與耐藏性密切相關(guān)，甜瓜是否耐藏關(guān)鍵取決于甜瓜抵御病原菌侵染能力。伽師瓜每年7—8月收獲，土法窖藏可以貯藏到第2年的3—4月，貯藏期最長(zhǎng)可達(dá)5～6 個(gè)月，是新疆最耐貯藏的甜瓜品種；而86-1甜瓜在常溫條件下，甜瓜采后不到1 周就開(kāi)始陸續(xù)發(fā)生病害，腐爛率隨后迅速上升，即使在冷藏條件下，1 個(gè)月開(kāi)始發(fā)病腐爛，2 個(gè)月全部失去商品價(jià)值。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，利用物理處理[25-26]、化學(xué)藥劑[27-30]和生物藥劑[31-33]處理甜瓜，能顯著提高果實(shí)組織CHT和GLU活力，增強(qiáng)甜瓜的抗病性，延長(zhǎng)果實(shí)貯藏期。伽師瓜抗病性、耐藏性強(qiáng)與CHT和GLU基因的表達(dá)密切相關(guān)。

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Analysis of Expression Prof i les of Chitinase and β-1,3-Glucanase Genes in Muskmelon Fruit Tissue Inoculated with Alternaria alternata

BAI Yujia, ZHANG Peiling, HUANG Wei, FENG Zuoshan, LI Meng
(College of Food Science and Pharmacy, Xinjiang Agricultural University, ürümqi 830052, China)

Two different disease resistance muskmelon cultivars (Jiashi and 86-1) were analyzed for the expression prof i les of chitinase (CHT) and β-1,3-glucanase (GLU) genes in fruit tissues inoculated with Alternaria alternata. Lesion size was measured and the expression levels of CmCht1, CmCht2 and CmGlu genes were investigated by fl uorescent quantitative PCR after subsequent storage at 7 ℃. The results revealed that lesion appeared on the 9thd after infection and expanded until the 24thday. Lesion size in 86-1 muskmelon was 1.12 times greater than in Jiashi muskmelon on the 24thday, illustrating that the latter was more resistant to infection with A. alternate than the former. During the storage period, the relative expression levels of CmCht1, CmCht2, and CmGlu genes were signif i cantly increased, initially rising and then declining.The peak expression levels of CmCht1, CmCht2, and CmGlu genes in the cultivars appeared at intervals of 3, 6 and 3 days,respectively. Moreover, the relative expression levels of CmCht1 and CmCht2 were higher in Jiashi muskmelon than in 86-1 muskmelon during the whole storage period, while the relative expression level of CmGlu was higher in Jiashi muskmelon than in 86-1 muskmelon during 12–24 days of storage. The expression prof i les of these three genes were different during the storage period. The relative expression levels of CmCht1 and CmCht2 were high during the early period suggesting that A. alternata induced CHT gene expression, whereas that of CmGlu gene was high during the middle and late period suggesting that A. alternata induced GLU gene expression. Disease resistance in muskmelon was due to the coordination of CHT and GLU expression. Therefore, Jiashi muskmelon revealed stronger disease resistance than 86-1 muskmelon, which was closely related to the expression of CHT and GLU.

muskmelon; Alternaria alternata; chitinase; β-1,3-glucanase; gene expression

2016-11-30

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)校前期資助課題（XJAU201421）

白羽嘉（1984—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工、食品生物技術(shù)。E-mail：saintbyj@126.com

10.7506/spkx1002-6630-201802029

S652.1

A

1002-6630（2018）02-0185-07

白羽嘉, 張培嶺, 黃偉, 等. 鏈格孢菌侵染采后甜瓜果實(shí)組織幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶基因表達(dá)分析[J]. 食品科學(xué),2018, 39(2): 185-191.

10.7506/spkx1002-6630-201802029. http://www.spkx.net.cn

BAI Yujia, ZHANG Peiling, HUANG Wei, et al. Analysis of expression prof i les of chitinase and β-1,3-glucanase genes in muskmelon fruit tissue inoculated with Alternaria alternata[J]. Food Science, 2018, 39(2): 185-191. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802029. http://www.spkx.net.cn