半同步和同步糖化發(fā)酵稻草轉化乙醇的研究

黃書鑫,呂繼良,徐永波,蔡毅敏,周 波,張麗娟,王 振

(湖北理工學院 環(huán)境科學與工程學院，湖北 黃石 435003)

半同步和同步糖化發(fā)酵稻草轉化乙醇的研究

黃書鑫,呂繼良*,徐永波,蔡毅敏,周 波,張麗娟,王 振

(湖北理工學院 環(huán)境科學與工程學院，湖北 黃石 435003)

利用釀酒酵母或釀酒酵母和樹干畢赤酵母，半同步和同步糖化發(fā)酵稻草轉化乙醇。以稻草作為底物，外加污泥或污泥預處理液來調節(jié)發(fā)酵過程中的碳氮比(C/N)，探討了不同工藝、不同酵母和不同外加營養(yǎng)物質(污泥或污泥預處理液)對稻草糖化發(fā)酵轉化乙醇過程的影響。在pH值為6、發(fā)酵溫度為37 ℃、5 mL釀酒酵母、20 FPU纖維素酶的條件下，利用1 g預處理稻草和60 mL污泥預處理液進行半同步糖化發(fā)酵36 h，得到的最高乙醇得率為0.40 g/g。

稻草；半同步和同步糖化發(fā)酵；污泥；污泥預處理液；乙醇

我國農業(yè)廢棄物資源儲量十分豐富，尤其是各類農作物秸稈，其中，稻草約2×109t，玉米秸稈2×109t，小麥秸稈1×109t，豆類和雜糧作物秸稈與花生、薯類和甜菜等秸稈藤蔓1×109t[1-2]。農作物秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質素組成。農作物秸稈中纖維素或(和)半纖維素轉化的乙醇是一種高效、清潔、可再生的能源，可成為化石燃料最理想的替代品。農作物秸稈轉化乙醇技術路線主要由預處理脫除木質素、酶水解纖維素或(和)半纖維素糖化為還原糖和微生物發(fā)酵還原糖生成乙醇這3步組成。目前，在糖化發(fā)酵耦合工藝方面，已經開發(fā)出包括分步糖化發(fā)酵(SHF)、同步糖化發(fā)酵(SSF)、聯(lián)合生物加工(CBP)以及固態(tài)發(fā)酵等技術工藝[3]。

隨著我國污水處理能力及處理率的快速提高，剩余污泥大量產生，其處置成為了我國一個突出的實際環(huán)境問題。污泥中含有大量病原菌、重金屬和有機物質，以及豐富的氮、磷和多種微量元素等營養(yǎng)物質[4-6]。因此，污泥資源化是目前的最佳處置方法。為了提高污泥中有機質的溶出率，必須對其進行預處理，目的是破壞污泥的結構及細胞物質，使其成為易降解的物質。這樣可將胞內釋放出的有機物作為微生物生長所需的營養(yǎng)物質加以利用[7]。

微生物生長需要碳源和氮源，厭氧發(fā)酵合適的碳氮比(C/N)為(10～20)∶1[5]。C/N過高或過低都不利于微生物的生長，農作物秸稈的C/N一般為50∶1，無法滿足厭氧發(fā)酵所需，污泥的C/N約為4.3∶1[8]，因此可向稻草中加入污泥來滿足厭氧發(fā)酵對 C/N的要求。本研究利用釀酒酵母或釀酒酵母和樹干畢赤酵母，半同步和同步糖化發(fā)酵稻草轉化乙醇。以稻草作為底物，采用纖維素酶將稻草中的纖維素或(和)半纖維素糖化為還原糖，利用酵母將還原糖發(fā)酵為乙醇，并加入污泥或污泥預處理液來調節(jié)發(fā)酵過程中的C/N。探討了不同工藝、不同酵母和不同外加營養(yǎng)物質(污泥或污泥預處理液)對稻草糖化發(fā)酵轉化乙醇過程的影響，以期為稻草轉化乙醇的工業(yè)化生產提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1)稻草：取自湖北省浠水縣附近的村莊。將取來的稻草去除根部和穗部，風干后，用微型粉碎機粉碎至能夠通過40目篩但不能通過60目篩的粉末，貯于廣口瓶中備用。

2)污泥：取自湖北省黃石市青山湖污水處理廠脫水后的干污泥，并將其放置于陰暗處備用。

1.2 菌種

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)：購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，可分別將葡萄糖和木糖發(fā)酵為乙醇。

1.3 培養(yǎng)基

1) 保藏培養(yǎng)基：麥芽浸粉20 g/L，瓊脂15 g/L，自然pH，121 ℃滅菌30 min。

2) 種子培養(yǎng)基：將保藏培養(yǎng)基去除瓊脂，121 ℃滅菌30 min。

1.4 纖維素酶

纖維素酶：購于國藥化學試劑有限公司，濾紙酶活力為2 800 FPU/g。

1.5 菌種的活化及種子培養(yǎng)基的制備

1) 菌種的活化：從保存斜面中挑取適量的釀酒酵母和樹干畢赤酵母，在保藏培養(yǎng)基的斜面上劃線接種；然后置于25 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，釀酒酵母和樹干畢赤酵母均培養(yǎng)5 d后轉接下一代，重復傳代3次保證充分活化。

2)種子培養(yǎng)基的制備：從釀酒酵母和樹干畢赤酵母的保藏培養(yǎng)基上各取一環(huán)，分別接入2個100 mL種子培養(yǎng)基中，置于25 ℃、150 r/min的氣浴恒溫振蕩器內培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后的液體種子培養(yǎng)基用于乙醇轉化實驗。

1.6 稻草的堿預處理

稱取20 g稻草粉末置于500 mL的燒杯中，按照固液比1∶20(g:mL)加入3.5% NaOH溶液400 mL，在100 ℃下水浴加熱35 min；然后用濾紙過濾，并用蒸餾水將濾餅洗滌至中性，將濾餅放在65 ℃下烘干后，用于乙醇轉化實驗。

1.7 污泥的堿預處理

在250 mL錐形瓶中，加入5 g污水處理廠脫水后的干污泥，用1 mol/L NaOH溶液將污泥的pH值調節(jié)至12后，將錐形瓶置于37 ℃、110 r/min的氣浴恒溫振蕩器中振蕩24 h；然后用濾紙過濾，并用蒸餾水將濾餅洗滌至中性，將濾餅放在65 ℃下烘干；同時收集用蒸餾水洗滌濾餅前的濾液，將濾餅和濾液用于乙醇轉化實驗。

1.8 半同步和同步糖化發(fā)酵

在利用釀酒酵母或釀酒酵母和樹干畢赤酵母，半同步和同步糖化發(fā)酵稻草轉化乙醇時，采用前期的單因素優(yōu)化實驗得到的最佳糖化發(fā)酵條件：最佳初始pH值、底物濃度、污泥濃度或污泥預處理液量、酵母接種量、纖維素酶活力和發(fā)酵溫度等。根據(jù)乙醇得率，探討不同工藝、不同酵母和不同外加營養(yǎng)物質(污泥或污泥預處理液)對稻草糖化發(fā)酵轉化乙醇的影響。

1) 半同步糖化發(fā)酵

① 將預處理稻草分散于裝有100 mL蒸餾水的錐形瓶中，121 ℃滅菌30 min后加入纖維素酶，置于37 ℃、110 r/min的氣浴恒溫振蕩器中酶解24 h后，加入經121 ℃滅菌30 min的預處理污泥與釀酒酵母(或釀酒酵母和樹干畢赤酵母)，在與酶解相同條件下進行發(fā)酵，在不同時間取樣并于6 000 r/min離心5 min，取上清液用于測定乙醇得率。

② 將預處理稻草分散于裝有100 mL蒸餾水和污泥預處理液的錐形瓶中，121 ℃滅菌30 min后加入纖維素酶，置于37 ℃、110 r/min的氣浴恒溫振蕩器中酶解24 h后，加入釀酒酵母或釀酒酵母和樹干畢赤酵母，在與酶解相同條件下進行發(fā)酵，在不同時間取樣并于6 000 r/min離心5 min，取上清液用于測定乙醇得率。

2) 同步糖化發(fā)酵

將預處理稻草和預處理污泥分散于裝有100 mL蒸餾水或將預處理稻草分散于裝有100 mL蒸餾水和污泥預處理液的錐形瓶中，121 ℃滅菌30 min后，加入纖維素酶與釀酒酵母(或釀酒酵母和樹干畢赤酵母)，置于37 ℃、110 r/min的氣浴恒溫振蕩器中進行糖化發(fā)酵，在不同時間取樣并于6 000 r/min離心分離5 min，取上清液用于測定乙醇得率。

1.9 纖維素濾紙酶活力(FPA)和乙醇得率的測定方法

纖維素濾紙酶活力的測定參考QB2583-2003[9]附錄A所述方法。乙醇得率的測定采用重鉻酸鉀比色法[10-11]。乙醇得率(g/g)計算如下：乙醇得率=產生的乙醇質量/底物稻草質量。

2 結果與討論

2.1 外加預處理污泥的半同步糖化發(fā)酵稻草轉化乙醇

1 g預處理稻草和1 g預處理污泥于pH值為6、5 mL釀酒酵母、20 FPU纖維素酶的條件下進行半同步糖化發(fā)酵；2 g預處理稻草和1.5 g預處理污泥在pH值為6、4 mL釀酒酵母和3 mL樹干畢赤酵母、20 FPU纖維素酶的條件下進行半同步糖化發(fā)酵。不同時間取樣測定乙醇產量，結果如圖1所示。

由圖1可知，在利用釀酒酵母半同步糖化發(fā)酵稻草轉化乙醇過程中，時間為12～36 h時，乙醇得率隨著時間的增加而增加，在36 h時乙醇得率達到最高值(0.33 g/g)；時間為36～60 h時，乙醇得率隨著時間的增加而降低。在利用釀酒酵母和樹干畢赤酵母半同步糖化發(fā)酵稻草轉化乙醇過程中，時間為12～48 h時，乙醇得率隨著時間的增加而逐漸增加，在48 h時乙醇得率達到最高值，為0.20 g/g；時間為48～60 h時，乙醇得率隨著時間的增加而降低。

2.2 外加預處理污泥的同步糖化發(fā)酵稻草轉化乙醇

1 g預處理稻草和1.5 g預處理污泥于pH值為7、2 mL釀酒酵母、20 FPU纖維素酶的條件下進行同步糖化發(fā)酵；2.5 g預處理稻草和1.5 g預處理污泥在pH值為6、3 mL釀酒酵母和1 mL樹干畢赤酵母、5 FPU纖維素酶的條件下進行同步糖化發(fā)酵。不同時間取樣測定乙醇產量，結果如圖2所示。

由圖2可知，在利用釀酒酵母同步糖化發(fā)酵稻草轉化乙醇過程中，時間為12～36 h時，乙醇得率隨著時間的增加而增加，在36 h時達到最高值，最高乙醇得率為0.31 g/g；時間為36～60 h時，乙醇得率隨著時間的增加而降低。在利用釀酒酵母和樹干畢赤酵母同步糖化發(fā)酵稻草轉化乙醇過程中，時間為12～48 h時，乙醇得率隨著時間的增加而逐漸增加，在48 h時乙醇得率達到最高值，為0.17 g/g；時間為48～60 h時，乙醇濃度隨著時間的增加而降低。

2.3 外加污泥預處理液的半同步糖化發(fā)酵稻草轉化乙醇

1 g預處理稻草和60 mL污泥預處理液于pH值為6、5 mL釀酒酵母、20 FPU纖維素酶的條件下進行半同步糖化發(fā)酵；2 g預處理稻草和80 mL污泥預處理液在pH值為6、4 mL釀酒酵母和3 mL樹干畢赤酵母、20 FPU纖維素酶的條件下進行半同步糖化發(fā)酵。不同時間取樣測定乙醇得率，結果如圖3所示。

由圖3可知，在利用釀酒酵母半同步糖化發(fā)酵稻草轉化乙醇過程中，時間為12～36 h時，乙醇得率隨著時間的增加而逐漸增加；時間為36～60 h時，乙醇得率隨著時間的增加而降低；當時間為36 h時，乙醇得率達到最高值(0.40 g/g)。在利用釀酒酵母和樹干畢赤酵母半同步糖化發(fā)酵稻草轉化乙醇過程中，時間為12～24 h時，乙醇得率隨著時間的增加而增加，在24 h時乙醇得率達到最高值，為0.34 g/g；時間為24～60 h時，乙醇得率隨著時間的增加而逐漸降低。

2.4 外加污泥預處理液的同步糖化發(fā)酵稻草轉化乙醇

1 g預處理稻草和80 mL污泥預處理液于pH值為7、2 mL釀酒酵母、20 FPU纖維素酶的條件下進行同步糖化發(fā)酵；2.5 g預處理稻草和60 mL污泥預處理液在pH值為6、3 mL釀酒酵母和1 mL樹干畢赤酵母、5 FPU纖維素酶的條件下進行同步糖化發(fā)酵。不同時間取樣測定乙醇產量，結果如圖4所示。

由圖4可知，在利用釀酒酵母同步糖化發(fā)酵稻草轉化乙醇過程中，時間為12～48 h時，乙醇得率隨著時間的增加而增加，在48 h時達到最高值，最高乙醇得率為0.39 g/g；時間為48～60 h時，乙醇得率隨著時間的增加而降低。在利用釀酒酵母和樹干畢赤酵母同步糖化發(fā)酵稻草轉化乙醇過程中，時間為12～36 h時，乙醇得率隨著時間的增加而逐漸增加，在36 h時乙醇得率達到最高值，為0.22 g/g；時間為36～60 h時，乙醇得率隨著時間的增加而降低。

半同步糖化發(fā)酵體系初期葡萄糖濃度較高，會抑制后續(xù)同步糖化發(fā)酵過程中的稻草中纖維素糖化，從而影響乙醇得率。而同步糖化發(fā)酵技術主要是針對稻草中纖維素糖化產物葡萄糖對纖維素酶的反饋抑制問題，利用酵母將葡萄糖及時轉化成對纖維素酶抑制作用較小的乙醇，從而消除纖維素糖化的葡萄糖反饋抑制效應[12-13]，因此可得到較高的乙醇得率。而由圖1～圖4可知，外加預處理污泥的半同步糖化發(fā)酵稻草得到的最高乙醇得率高于外加預處理污泥的同步糖化發(fā)酵稻草得到的最高乙醇得率。因為污泥中的重金屬離子影響纖維素酶活力。吳國英和賈秀英[14]的研究結果表明，豬糞中一定濃度的Cu、Cd、Cr均可導致蚯蚓體內纖維素酶活力的下降，并且隨各污染物濃度的增加，纖維素酶活力下降的程度增大。在外加預處理污泥的同步糖化發(fā)酵體系中，纖維素酶和污泥是同時加入，污泥中的重金屬離子會降低纖維素酶活力，致使酶解效率降低，產生的葡萄糖濃度低，所以乙醇得率低；而半同步糖化發(fā)酵體系中纖維素酶和污泥是分開加入，污泥中的重金屬離子對纖維素酶活力的影響較同步糖化發(fā)酵體系小，故乙醇得率較高。外加污泥預處理液的半同步糖化發(fā)酵稻草得到的最高乙醇得率與外加污泥預處理液的同步糖化發(fā)酵稻草得到的最高乙醇得率非常接近，表明在2種糖化發(fā)酵體系中污泥預處理液對酵母的影響比較相似。

因為纖維素酶包含有部分木聚糖酶活力，所以能將稻草中的纖維素和半纖維素分別酶解成葡萄糖和木糖，釀酒酵母和樹干畢赤酵母可分別將葡萄糖和木糖發(fā)酵成乙醇，從而得到較高的乙醇得率。然而本研究中利用釀酒酵母糖化發(fā)酵稻草得到的乙醇得率均高于利用釀酒酵母和樹干畢赤酵母糖化發(fā)酵稻草得到的乙醇得率。在利用釀酒酵母和樹干畢赤酵母糖化發(fā)酵體系中，因為纖維素酶中的木聚糖酶活力較低，所以產生的木糖濃度較低，導致可供樹干畢赤酵母發(fā)酵轉化乙醇的木糖量較少，而此時樹干畢赤酵母就會利用葡萄糖來進行自身的繁殖，致使可供釀酒酵母發(fā)酵轉化乙醇的葡萄糖量減少，從而導致乙醇得率降低。

外加預處理污泥的半同步和同步糖化發(fā)酵稻草得到的最高乙醇得率均低于外加污泥預處理液的半同步和同步糖化發(fā)酵稻草得到的最高乙醇得率。因為堿法預處理可促進污泥中的微生物胞外聚合物(EPS)分解，使EPS中大量的溶解性蛋白質和碳水化合物釋放到預處理液中[5,15-16]。由于被釋放到污泥預處理液中的蛋白質較預處理污泥中多，所以稻草和污泥預處理液能夠提供更適合酵母生長的C/N，從而促進酵母發(fā)酵稻草酶解產物轉化乙醇，所以得到較高的乙醇得率。其中，外加污泥預處理液的釀酒酵母半同步糖化發(fā)酵稻草得到的乙醇得率最高，最高乙醇得率為0.40 g/g。

3 結論

半同步糖化發(fā)酵稻草得到的最高乙醇得率高于同步糖化發(fā)酵稻草得到的最高乙醇得率；利用釀酒酵母半同步和同步糖化發(fā)酵稻草得到的乙醇得率均高于利用釀酒酵母和樹干畢赤酵母半同步和同步糖化發(fā)酵稻草得到乙醇得率；外加預處理污泥的半同步和同步糖化發(fā)酵稻草得到的最高乙醇得率均低于外加污泥預處理液的半同步和同步糖化發(fā)酵稻草得到的最高乙醇得率。其中，外加污泥預處理液的釀酒酵母半同步糖化發(fā)酵稻草得到的乙醇得率最高，最高乙醇得率為0.40 g/g。

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Research on Ethanol from Semi-simultaneous and Simultaneous Saccharification and Fermentation of Rice Straw

HuangShuxin,LüJiliang*,XuYongbo,CaiYimin,ZhouBo,ZhangLijuan,WangZhen

(School of Environmental Science and Engineering,Hubei Polytechnic University,Huangshi Hubei 435003)

In this study,Saccharomyces cerevisiae or Saccharomyces cerevisiae and Pichia stipitis were used to convert rice straw into ethanol by semi-simultaneous and simultaneous saccharification and fermentation.Rice straw was used as substrates,and sludge or pretreated sludge solution was added to adjust the C/N ratio in the fermentation.The effects of different processes,different yeasts and different exogenous nutrients(sludge or pretreated sludge solution)on ethanol from saccharification and fermentation of rice straw were discussed.Under the conditions of pH=6,37 ℃ of fermentation temperature,5 mL inocula of Saccharomyces, cerevisiae and 20 FPU of cellulose,1 g of rice straw and 60 mL of the pretreated sludge solution were converted into ethanol with semi-simultaneous saccharification and fermentation for 36 h.The highest ethanol yield obtained was 0.40 g/g.

rice straw;semi-simultaneous and simultaneous saccharification and fermentation;sludge;pretreated sludge solution;ethanol

2017-10-06

湖北省自然科學基金項目(項目編號2014CFB183)；湖北理工學院大學生科技創(chuàng)新項目(項目編號17cx07)。

黃書鑫，本科生。

*通訊作者：呂繼良，講師，博士，研究方向：生物質能源轉化。

10.3969/j.issn.2095-4565.2017.06.006

X712

A

2095-4565(2017)06-0022-05

(責任編輯張銀鳳)