酸堿粗提配合超聲破碎法制取可溶性長牡蠣(Crassostrea gigas)黑色素的研究*

何 成 于文超 蔡忠強(qiáng) 魏 磊 陳 軍 李佳榮 蓋超偉 李 壯 張子豪 郭 文 王曉通①

(1. 魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院 煙臺(tái) 264025; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長島增殖實(shí)驗(yàn)站 長島 265800; 3. 山東省海洋生物研究院 青島 266104)

黑色素(melanin)是分布范圍最為廣泛的生物色素之一, 呈黑色或者棕褐色, 是一類在動(dòng)植物體內(nèi)普遍存在的生物大分子(Kolliaset al, 1991; El Bassamet al, 2002), 難溶于酸、水以及有機(jī)溶劑等。黑色素具有清除自由基、抗氧化的功效, 在疾病的預(yù)防和治療,以及化工、食品等領(lǐng)域有著較好的應(yīng)用前景。黑色素所具備的調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老、保護(hù)心血管功能以及保護(hù)光照損傷等生物活性, 已使目前對其天然資源的開發(fā)研究成為一項(xiàng)熱點(diǎn)。牡蠣(Osteroida)是世界第一大養(yǎng)殖貝類, 屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)。牡蠣不僅肉鮮味美、營養(yǎng)豐富, 而且具有獨(dú)特的保健功能和藥用價(jià)值(申淑琦等, 2009)。牡蠣作為貝類研究的模式生物, 研究其所含的色素具有廣泛的生物學(xué)意義。目前本課題組已經(jīng)確認(rèn)牡蠣軟體部、貝殼外表面和閉殼肌痕處的黑色物質(zhì)的確為黑色素(于文超等, 2015; Haoet al, 2015), 其本身在某些生物體內(nèi)具有防紫外、抗氧化, 抵御病毒、提高免疫力等生物活性(Sarnaet al, 1984; Menteret al, 1998;Pughet al, 2005)。黑色素屬于難溶性物質(zhì), 微溶于強(qiáng)堿溶液, 不溶于水、酸溶液、鹽溶液和大部分有機(jī)溶劑(El Bassamet al, 2002; Goncalveset al, 2005;Selvakumaret al, 2008), 由于黑色素的大部分功效驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)需要用到黑色素溶液, 黑色素的難溶性導(dǎo)致長牡蠣黑色素的功效驗(yàn)證工作難以開展。目前, 生物大分子的降解最常用手段是酶解法, 但由于其成本高, 特異性強(qiáng), 而且至今也未發(fā)現(xiàn)能夠酶解長牡蠣(Crassostrea gigas)黑色素的對應(yīng)酶, 因此酶解法在本實(shí)驗(yàn)中行不通。然而, 作者發(fā)現(xiàn)超聲破碎法可以有效地將大顆粒的難溶黑色素降解為可溶的小顆粒,并實(shí)驗(yàn)了一系列流程, 確定了可溶性黑色素的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生變化, 最終確定該套可溶性長牡蠣黑色素的制取鑒定方法。本文的研究結(jié)果對推動(dòng)牡蠣黑色素的功能研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)迪牁悠?/h3>

黑色長牡蠣(Crassostrea gigas): 本實(shí)驗(yàn)所用牡蠣樣品為本課題組培育的長牡蠣。外殼均為黑色, 平均殼高10cm, 均重150g。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑 鹽酸、氫氧化鈉、溴化鉀、乙醚、蒸餾水等。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器 超聲細(xì)胞破碎儀、高速冷凍離心機(jī)、電熱恒溫水浴鍋、循環(huán)水真空泵、真空冷凍法干燥機(jī)、激光粒度儀、傅里葉紅外光譜儀、紫外分光光度計(jì)、電熱鼓風(fēng)干燥箱、電子天平、索氏提取器、研缽、濾紙、燒杯、三角燒瓶、玻璃棒等。

1.3 超聲降解法制備可溶性長牡蠣黑色素

1.3.1 將牡蠣外表殼用清潔刷清洗, 去除表面的泥土、藻類等附著物;

1.3.2 利用酸堿法提取天然長牡蠣黑色素(于文超等,2015)。將黑色的貝殼及外套膜進(jìn)行粉碎、鹽酸水解、水浴加熱、乙醚抽脂、干燥等流程制取2g以上天然長牡蠣黑色素;

1.3.3 稱取2g天然長牡蠣黑色素溶于100mL體積的0.5mol/L NaoH溶液中, 均勻攪拌使其最大化溶解;

1.3.4 將盛有該混合液的玻璃燒杯置于盛有 30℃水的大燒杯中水浴保溫, 同時(shí)將大燒杯置于超聲細(xì)胞破碎儀中震蕩, 設(shè)定振幅 50%, 超聲2s, 間歇2s, 總處理時(shí)間為1h;

1.3.5 冷卻至室溫后, 滴加1mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0后, 將混合液8000×g離心30min;

1.3.6 棄沉淀取上清, 置于廣口器皿中, 置于–80℃冰箱冷凍凝固處理;

1.3.7 將樣品放入真空冷凍干燥機(jī)干燥, 24h后取出所得固體密封保存。

1.4 可溶性長牡蠣黑色素驗(yàn)證

1.4.1 粒度分析 分別取少量天然長牡蠣黑色素和超聲降解后的樣品溶于去離子水中, 使用激光粒度儀測試樣品粒度。

1.4.2 紅外光譜鑒定 分別取超聲降解干燥的樣品和天然長牡蠣黑色素樣品約 0.5mg與 KBr壓制成片, 使用傅里葉紅外光譜儀, 掃描400—4000nm波長范圍的透光率。

1.4.3 紫外光譜鑒定 取天然長牡蠣黑色素 0.1g,溶解在 0.01mol/L氫氧化鈉水溶液中, 并用同樣的氫氧化鈉溶液做基線, 掃描190—500nm波長范圍的光譜吸光值; 取超聲降解后的樣品 0.1g溶于去離子水中, 并同樣用去離子水做基線, 掃描 190—500nm 波長范圍的光譜吸光值。

2 結(jié)果

2.1 天然長牡蠣黑色素粒度分析結(jié)果

對天然長牡蠣黑色素和超聲降解處理后的物質(zhì)組分進(jìn)行粒度分析, 所得數(shù)據(jù)用Origin8.0軟件處理。

圖1 天然長牡蠣黑色素和超聲處理后黑色素組分粒度分布圖Fig.1 The particle size distribution of the Pacific oyster natural melanin and the ultrasonic degradated product melanin

超聲處理前, 天然長牡蠣黑色素的顆粒粒度廣泛分布于0.3—1100μm(圖1a), 顆粒大小不一, 極差能達(dá)到 1300μm, 而且每個(gè)顆粒范圍所占比例都不大,約 2%左右; 超聲破碎處理后的組分則集中分布于0.3—0.9μm, 1.2—2.9μm, 顆粒粒度明顯下降(圖 1b), 且分布集中, 所占比例也明顯提高, 表示原先的黑色素大分子都已降解成為小顆粒黑色素, 且顆粒大小均勻。

2.2 天然長牡蠣黑色素紅外光譜分析結(jié)果

天然長牡蠣黑色素的紅外光譜圖如圖 2a所示;超聲降解處理后物質(zhì)的紅外光譜圖如圖2b所示。由圖 2a可以看出, 天然長牡蠣黑色素的紅外光譜在1630cm–1和 3400cm–1附近有明顯吸收峰; 由圖 2b可以看出, 超聲降解處理后的長牡蠣黑色素在 1630cm–1和 3400cm–1附近同樣具有明顯的吸收峰, 且峰值所對應(yīng)的波長相當(dāng)接近。表明該兩種樣品官能團(tuán)結(jié)構(gòu)基本相同, 也就是說超聲破碎前后, 黑色素的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化, 引起偏振峰的決定黑色素作用的官能團(tuán)在破碎后依舊存在, 確認(rèn)為可溶性長牡蠣黑色素。

2.3 天然長牡蠣黑色素紫外光譜分析結(jié)果

天然長牡蠣黑色素和超聲降解后黑色素的紫外光譜比較如圖3所示。通過對比可以看出, 超聲降解后的物質(zhì)與天然長牡蠣黑色素的紫外吸收曲線趨勢相似, 并且兩者共同在 210nm左右有最大吸收峰,210nm后吸光趨勢一直下降, 但超聲處理后的黑色素吸光值明顯高于天然長牡蠣黑色素, 表明處理后的黑色素水溶液溶質(zhì)含量高于天然長牡蠣黑色素堿溶液, 從圖中顯示, 該對比較為明顯, 表明兩物質(zhì)的溶解性差異較大。

圖2 天然長牡蠣黑色素和超聲降解后長牡蠣黑色素的紅外光譜圖Fig.2 IR scanning spectra of the Pacific oyster natural melanin and the ultrasonic degradation melanin

圖3 天然長牡蠣黑色素和超聲降解處理后物質(zhì)的紫外光譜圖Fig.3 UV absorption spectra of the Pacific oyster natural melanin and ultrasonic degradation product

3 討論

3.1 天然長牡蠣黑色素形態(tài)分析

通過對天然長牡蠣黑色素和超聲降解處理后物質(zhì)的粒度分析可知, 超聲處理之后黑色素顆粒的平均粒度大幅度下降(圖 1), 直觀地說明超聲破碎作用將天然長牡蠣黑色素大分子從高度聚合狀態(tài)降解為小顆粒物質(zhì), 從而大大提高其本身的溶解性(Hegedusicet al, 1984; 李素霞等, 2010)。由此可以推斷, 導(dǎo)致長牡蠣黑色素難溶的主要原因?yàn)槠浔旧淼念w粒過大, 通過借助外界能量來打破其大分子結(jié)構(gòu),釋放小顆粒, 是改變其溶解性的可行方法。因此我們選用了超聲波破碎的方式, 并確定了一些該破碎成功所需要的特殊條件, 如30℃恒溫水浴等。達(dá)到了預(yù)期的溶解效果, 處理后的黑色素成功溶解于水, 驗(yàn)證了該方法的可行性。

3.2 天然長牡蠣黑色素結(jié)構(gòu)分析

黑色素可分為真黑素和褐黑素, 而真黑素又可分為黑真黑素和棕真黑素(李華等, 2002; 李文等,2007)。與天然長牡蠣黑色素相比, 可溶性降解產(chǎn)物在波長1630cm–1和3400cm–1附近仍然有明顯的吸收峰,研究表明, 真黑色素吲哚環(huán)偏振引起 1630cm–1處的特征吸收(Stainsacket al, 2003; Liuet al, 2005; 郝世鑫等, 2015), 說明降解后主要化學(xué)結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生太大變化, 破碎處理后的物質(zhì)仍然為黑色素且為真黑色素(郭欣等, 2013), 推斷超聲主要破壞黑色素顆粒的高度聚合狀態(tài)并有效的提高天然長牡蠣黑色素的溶解性, 而黑色素的主要化學(xué)結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)并沒有被破壞, 保留了黑色素本身具備的理化性質(zhì)和自身特性, 故紅外光譜掃描這些常規(guī)指標(biāo)都與處理前基本保持一致?；瘜W(xué)性質(zhì)在處理前后的穩(wěn)定性, 保證了其生物活性與長牡蠣體內(nèi)黑色素的一致性, 使得可溶性黑色素制得后, 可以用于后續(xù)黑色素生物功能驗(yàn)證工作。

3.3 天然長牡蠣黑色素溶解度分析

從圖3的紫外光譜比較可以進(jìn)一步看出, 超聲波降解后的黑色素最大吸收峰出現(xiàn)在210nm左右(付湘晉, 2005; 李琦等, 2010; Mustaphaet al, 2015), 與未經(jīng)超聲波降解的長牡蠣黑色素相同, 進(jìn)一步說明了超聲波沒有影響化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化; 有意思的是, 超聲處理后的黑色素溶液吸光值明顯高于天然長牡蠣黑色素, 說明處理后黑色素水溶液的溶質(zhì)含量高于天然長牡蠣黑色素堿溶液, 從而具有更高的吸光率, 這可能是由于超聲降解后的黑色素顆粒直徑更小、數(shù)目更多, 暴露出了更多的吲哚環(huán)基團(tuán), 從而具有更高的吸光率(Craftet al, 1992; Dubeyet al, 2014)。該結(jié)果成功解決了今后可能面臨的黑色素濃度低的問題, 更少的黑色素可發(fā)揮更大生理作用, 避免了因黑色素濃度過低而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)所需溶液體積過大的問題。由此流程制得的可溶性長牡蠣黑色素適用于絕大部分黑色素功效驗(yàn)證相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

3.4 天然長牡蠣黑色素的去除雜質(zhì)功能

由步驟 1.3.5可知, 破碎處理后, 留有部分不溶于水和堿溶液的沉淀, 推斷該沉淀為酸堿粗提制得的其它未知雜質(zhì)。由于步驟1.3.5中進(jìn)行了去除沉淀操作, 相當(dāng)于去除了酸堿粗提中難以去除的雜質(zhì), 提升了所得可溶性長牡蠣黑色素的純度。

4 結(jié)論

本研究采用酸堿法結(jié)合超聲破碎處理法, 成功制取了可溶性長牡蠣黑色素, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 該方法制取的長牡蠣黑色素能夠溶于水而化學(xué)性質(zhì)沒有發(fā)生改變, 可以作為其他實(shí)驗(yàn)研究的材料。該流程是牡蠣黑色素提取方法的延伸和拓展, 可溶性黑色素的成功制取可為長牡蠣黑色素的功能研究奠定基礎(chǔ)。

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