表兒茶素沒(méi)食子酸酯抑菌活性的研究①

陳星卉

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150028)

表兒茶素沒(méi)食子酸酯抑菌活性的研究①

陳星卉

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150028)

目的：探討表兒茶素沒(méi)食子酸酯抑菌活性。方法：本研究通過(guò)二倍稀釋法測(cè)量最小抑菌圈從而確定ECG對(duì)6種致病菌的最小抑菌濃度(MIC)。采用結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)對(duì)表兒茶素沒(méi)食子酸酯作用前后細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的變化進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：表兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)大腸桿菌、腸炎沙門(mén)氏菌、變異鏈球菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC值0.125mg/mL;結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)中，隨著ECG濃度的增大，OD590也隨之增大。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)證明ECG的滅菌機(jī)制是對(duì)其細(xì)菌細(xì)胞膜通透性進(jìn)行改變，并破壞細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞外的小分子容易進(jìn)入以及引起細(xì)胞內(nèi)的小分子物質(zhì)泄漏。

表兒茶素沒(méi)食子酸酯；抑菌活性；最小抑菌濃度；致病菌

表兒茶素沒(méi)食子酸酯(簡(jiǎn)稱ECG)是從綠茶中分離得到的一種具有廣譜抗菌作用的活性物質(zhì)。本研究擬進(jìn)一步探索ECG對(duì)綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonella enteritidis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、變異鏈球菌(Streptococcus mutans)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)等常見(jiàn)致病菌是否存在抗菌作用，從而研究 ECG對(duì)上述6種致病菌抗菌活性及抗菌機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨著廣譜抗菌藥物使用頻繁，致使很多細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性。為了降低細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生，我們應(yīng)該合理的使用抗菌藥物。因此在天然藥物中對(duì)新型抗菌活性成分的研發(fā)，可以緩解耐藥性的問(wèn)題。表兒茶素沒(méi)食子酸酯是從綠茶中提取的活性物質(zhì)，是茶多酚的主要成分之一，其含量約為24%[1]。具有抗癌、抗突變、防治心腦血管系統(tǒng)疾病以及調(diào)理內(nèi)分泌、提高機(jī)體免疫力等生物活性[2～4]，同時(shí)也可以抑制機(jī)體內(nèi)生物代謝酶從而抑制新陳代謝作用。早些年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)茶葉及其茶多酚的藥理活性的研究進(jìn)展進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)分析[5～6]。發(fā)現(xiàn)其具有高效低毒的抗腫瘤[7]、抗氧化、抗菌、治療心血管疾病等的潛能[8]。蔡軼等[9]研究了表兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)對(duì)人鼻咽癌C666 -1細(xì)胞凋亡的影響，初步證實(shí)了表兒茶素沒(méi)食子酸酯人鼻咽癌C666 -1細(xì)胞[10]具有顯著的增殖抑制作用。焦嬋媛[11]等對(duì)表兒茶素及其衍生物表兒茶素沒(méi)食子酸酯抑制前列腺間質(zhì)細(xì)胞增值,得出ECG抑制前列腺間質(zhì)細(xì)胞增殖的作用機(jī)制是通過(guò)ERK44/42進(jìn)行的。表兒茶素沒(méi)食子酸酯也可以與傳統(tǒng)廣譜抗菌藥物協(xié)同作用從而提高其抑菌效果，華德興[12]等人對(duì)表兒茶素沒(méi)食子酸酯與四環(huán)素進(jìn)行協(xié)同實(shí)驗(yàn)，研究其抗金黃色葡萄球菌作用及機(jī)制從而得出ECG與抗生素類(lèi)藥物的協(xié)同抗菌效果會(huì)增強(qiáng)。

1.2 方法

1.2.1表兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)致病菌MIC的測(cè)定

參照瓊脂稀釋法測(cè)定致病菌的MIC[13]，將試驗(yàn)方法改進(jìn)，配制八種不同濃度的ECG。

在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行操作，準(zhǔn)備直徑0.75cm的濾紙片48個(gè)；采用二倍稀釋法配制八種濃度不同的ECG溶液；準(zhǔn)備六個(gè)固體培養(yǎng)基，每個(gè)固體培養(yǎng)基平皿背面做好標(biāo)記1.2.3.4.5.6.7.8；取濾紙片浸入2mg/mLECG溶液中放在平皿“1”位置，取第二張濾紙片浸入1mg/mLECG溶液中放在平皿“2”位置，按上述步驟依次放置浸泡過(guò)藥品溶液的濾紙片在固定位置，每個(gè)平皿放八個(gè)不同濃度藥品溶液的濾紙片；放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)；測(cè)量抑菌圈的直徑，最小直徑的抑菌圈所對(duì)應(yīng)的藥品濃度即為該致病菌的MIC值，具體濃度配置可見(jiàn)表1。

表1 ECG溶液的配制

1.2.2 致病菌細(xì)胞的完整性變化觀察

行離心操作，8000r/min下離心棄上清液；加入0.5%NaCl溶液200μL進(jìn)行洗滌再重懸；取致病菌懸液200μL取6個(gè)離心管，標(biāo)號(hào)，分別均勻的加入已經(jīng)接種過(guò)致病菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)液40mL；進(jìn)分裝在規(guī)格1mL的離心管中分別加入不同濃度藥物(MIC作為最大濃度，依次2倍稀釋?zhuān)?MIC，MIC，0.5MIC、0.5%NaCl)200μL；將離心管放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃孵育8h；孵育完成后，進(jìn)行離心取菌，加入200μL 的0.5%NaCl洗滌重懸；將1 mg/mL結(jié)晶紫溶液200μL加到各個(gè)離心管中，混勻后將離心管都放到恒溫培養(yǎng)箱中37℃孵育10min；孵育完成后，再進(jìn)行離心操作，取上清液進(jìn)行UV 590nm下測(cè)吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 表兒茶素沒(méi)食子酸酯MIC的測(cè)定結(jié)果

按最小抑菌濃度測(cè)定操作方法操作，測(cè)量六種致病菌的固體培養(yǎng)基上8個(gè)不同濃度濾紙片所產(chǎn)生的抑菌圈直徑大小比較，直徑。所以表兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)大腸桿菌、腸炎沙門(mén)氏菌、變異鏈球菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC值0.125mg/mL。抑菌圈直徑單位(cm)。見(jiàn)表2。

表2 MIC的測(cè)定結(jié)果

注：-代表沒(méi)有抑菌圈

2.2 結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將六組致病菌的1～4號(hào)離心管按結(jié)晶紫測(cè)定操作方法，測(cè)定各個(gè)離心管內(nèi)上清液590nm下的UV吸光度。大腸桿菌、腸炎沙門(mén)氏菌、變異鏈球菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌六組致病菌的1～4號(hào)離心管內(nèi)藥物濃度依次為0.250mg/mL、0.125mg/mL、0.063mg/mL、0mg/mL。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表3。

表3 致病菌細(xì)胞膜完整性測(cè)定

根據(jù)上表2～3可知，隨著ECG濃度的增加，OD590也增加，說(shuō)明ECG對(duì)致病菌細(xì)胞膜能造成破壞，并且隨著藥物ECG濃度的逐漸增大，致病菌細(xì)胞膜被造成的破壞更為嚴(yán)重(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 ECG對(duì)于6種致病菌的OD590測(cè)定

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)致病菌的細(xì)胞膜通透性作用，但是未完全考慮到ECG是否對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌等細(xì)菌的DNA、細(xì)胞壁或其它部位有無(wú)影響，若是條件允許，對(duì)其它部位也進(jìn)行相關(guān)測(cè)定是有必要的。

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陳星卉(1995～)女 ，黑龍江佳木斯人，學(xué)士。

R978.1

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2017-06-16)