Wnt/β-catenin信號調控對海馬區(qū)Aβ1-42誘導的神經干細胞損傷的影響①

盛寶英，姜堯佳，李 瑩，任秀敏，教 偉，王增冕，田嘉瑩，吳佳歡，王 杰

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院神經內科，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯市中心醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

Wnt/β-catenin信號調控對海馬區(qū)Aβ1-42誘導的神經干細胞損傷的影響①

盛寶英1，姜堯佳1，李 瑩1，任秀敏1，教 偉1，王增冕1，田嘉瑩1，吳佳歡1，王 杰2

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院神經內科，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯市中心醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：通過調控Wnt/β-catenin信號的表達以觀察其對β淀粉樣蛋白所誘導的海馬區(qū)神經干細胞損傷的影響。方法：通過Aβ1-42注射大鼠海馬區(qū)誘導神經干細胞損傷，實驗組同時注射Wnt3a激動Wnt/β-catenin信號表達，于5周后評價各組間認知功能水平并采用免疫組織化學法檢測各組間BrdU陽性細胞數。結果：Aβ1-42可致海馬區(qū)神經干細胞增殖水平降低，損傷后引起明顯認知功能障礙；Wnt/β-catenin信號激動可減輕Aβ1-42所誘導的神經干細胞損傷，促進神經干細胞增殖，并可改善認知功能。結論：Wnt/β-catenin信號上調可促進內源性NSCs的增殖分化，是治療阿爾茨海默病的途徑之一。

阿爾茨海默病；神經干細胞；Wnt/β-catenin；Aβ1-42；BrdU；增殖

海馬區(qū)神經細胞凋亡是引起阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的重要機制之一[1]。目前，AD的發(fā)病機制與病因仍處進一步研究之中，為大多學者所公認的重要機制之一是由于各種原因引起的β-淀粉樣蛋白(Aβ)代謝發(fā)生障礙而過度累積于腦組織中， 不僅引起膠質細胞的過度增生，而且進一步使Aβ相關的免疫級聯(lián)反應得到觸發(fā)，進而造成神經元凋亡[2]。有研究顯示，Wnt/β-catenin信號的激活可以促進成體動物神經干細胞(Neural stem cells，NSCs)的增殖及向神經元分化[3]。因此，本研究利用Wnt/β-catenin信號激動劑Wnt3a調控Wnt/β-catenin表達，對比由Aβ1-42所誘導的海馬區(qū)神經干細胞損傷大鼠認知能力及內源性神經干細胞增殖水平的變化，探討AD的治療方法。

1 材料和方法

1.1 材料

清潔級成年雄性Wistar大鼠40只，體重220～250g(佳木斯大學實驗動物中心)；Y型電迷宮(張家港生物醫(yī)學儀器廠)；恒溫培養(yǎng)箱(Sanyo公司)；立體定向儀(上海光電儀器廠)；垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；轉膜儀(德國GE公司)；小鼠抗大鼠BrdU(Sigma公司)；Aβ1-42(Sigma公司)；Wnt3a(Peprotech公司)；SABC試劑盒及DAB顯色液(博士德公司)；β-Catenin抗體及其磷酸化抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 AD造模[4]:與實驗分組 40只大鼠隨機分為對照組10只、AD組15只及實驗組15只。其中對照組僅行麻醉，AD組及實驗組行AD造模。10%水合氯醛以0.2mL/kg為標準注射入大鼠腹腔進行麻醉；大鼠頭部固定于立體定位儀進行海馬定位[5]；術區(qū)備皮、消毒后行顱骨開孔；微量加樣器垂直大腦表面刺入3.0mm，5μL聚態(tài)Aβ1-42以1μL /min速度注入，留針10min保證懸液彌散后撤針行切口縫合。造模后分籠飼養(yǎng)并連續(xù)5d給予青霉素腹腔注射3萬U/kg，1次/d。7d后于Y型電迷宮測試大鼠行為學改變，以學習和認知能力下降為AD造模成功標準。其后，實驗組海馬組織注入Wnt3a蛋白(100mmol/L)5μL，另以5μL生理鹽水注射入AD組海馬區(qū)。

1.2.2 行為學評定[6]:各組大鼠于術后5周分別進行Y型電迷宮測試行為學改變，評定3次結果取均值。

1.2.3 標本采集與實驗:腹腔麻醉大鼠后心臟灌注PBS及8 %多聚甲醛處死，斷頭取腦于光鏡下切取海馬區(qū)組織。-80℃冷凍每例部分海馬組織樣本，采用Western-blot法檢測β-Catenin蛋白表達情況，以GAPDH為內參照，使用Visionworks 6.3.3軟件對圖像灰度值進行比較分析；部分海馬組織樣本脫水、石蠟包埋后切片(5μm)，進行BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)免疫組化染色，隨機選取400倍光鏡下不交疊視野，計數BrdU陽性細胞(細胞內棕褐色染色顆粒)，取4個視野均數進行比較分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 行為學測試結果

各組大鼠實驗前學習與記憶能力無明顯差異(P>0.05)。術后5周各組間差異明顯，AD模型組大鼠評測顯示其學習與記憶能力同對照組比較顯著降低(P<0.01)；實驗組大鼠學習與記憶能力同對照組比較明顯降低(P<0.05)；實驗組大鼠學習與記憶能力明顯高于AD模型組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠行為學測試結果

注：*、#、△為各組間比較，△、#P<0.05，*P<0.01。

2.2 大鼠海馬組織中β-Catenin檢測結果

圖1顯示Western blot檢測各組大鼠海馬組織中β-Catenin蛋白電泳條帶結果。AD模型組β-Catenin蛋白條帶與對照組比較可見β-Catenin蛋白表達減少，其顏色變淺且條帶變細；實驗組與對照組及AD模型組比較顯示，實驗組β-Catenin蛋白條帶顏色深且條帶寬，說明β-Catenin蛋白表達增多。

圖1 β-Catenin的免疫蛋白印記

圖2顯示光密度值分析結果。AD模型組與對照組比較統(tǒng)計學差異明顯(P<0.05)，其β-Catenin相對光密度值明顯降低，表明Aβ1-42引起大鼠海馬組織中β-Catenin表達下調；實驗組與AD模型組比較統(tǒng)計學差異顯著(P<0.01)，其β-Catenin相對光密度值顯著增加，表明Wnt3a使AD大鼠海馬組織中β-Catenin表達上調；實驗組與對照組間比較(P<0.05)，也表明Wnt3a上調了β-Catenin的表達。

圖2 β-Catenin在海馬組織中的表達變化

(注：*、#、△為各組間比較，*、#P<0.05，△P<0.01。)

2.3 免疫組織化學染色觀察BrdU陽性細胞在大鼠海馬組織的表達

在細胞增殖周期S期BrdU被攝入細胞內，因此海馬組織中的BrdU染色細胞可以被定義為增殖期的神經干細胞。圖3免疫組化染色顯示，實驗組BrdU陽性細胞數較AD模型組及對照組均明顯增加(P< 0.05)，說明WNT3a通過激活β-Catenin蛋白的表達促進NSCs的增殖分化；AD模型組與對照組比較，BrdU陽性細胞顯著減少(P< 0.05)，提示Aβ1-42通過抑制Wnt/β-catenin信號的表達而抑制NSCs的增殖分化，見表2。

表2 各組大鼠海馬組織BrdU陽性細胞計數結果

注：*、#、△為各組間比較，*、#P<0.05，△P<0.01。

圖3 各組大鼠海馬組織BrdU染色結果(×400)

3 討論

關于AD發(fā)病機制的研究中，目前廣為接受的是“β淀粉樣蛋白學說”[2]。研究表明，Aβ作為極強的神經毒性物質，其代謝發(fā)生異常而致大量累積于神經系統(tǒng)，可能是AD發(fā)生和發(fā)展的始動因素[7]。并且近年有相關研究表明，在由Aβ所介導的神經元損傷進程中，Wnt/β-catenin信號通路可能具有重要作用[8]。

Wnt基因自被發(fā)現以來，目前在哺乳動物體內共發(fā)現19種Wnt 基因亞型。在多種Wnt亞型中，Wnt3a是影響神經干細胞分化的重要亞型，其參與經典的Wnt信號傳導通路(Wnt/β-catenin通路)[9]。研究表明，在無活化Wnt信號的正常細胞質中，β-catenin是以磷酸化的降解復合物形式存在[10]，并最終被蛋白酶體降解，因此在正常細胞中僅存在很低水平的游離狀態(tài)β-Catenin[11]。當Wnt通路活化時，可以抑制磷酸化的β-catenin降解復合物形成，從而提高細胞質中游離狀態(tài)的β-catenin水平，并進而轉運到細胞核中與特定的靶基因結合，進一步啟動靶基因的轉錄[12]。研究發(fā)現，大鼠NSCs被Wnt3a質粒轉染后，Wnt3a在NSCs獲得表達，可使NSCs向神經細胞分化增多[13]。

但以往研究集中于離體狀態(tài)下NSCs的培養(yǎng)與增殖調控，以及移植NSCs對AD的作用，對于內源性NSCs增殖調控及其對AD的影響方面的研究相對較少。通過本研究表明，Aβ1-42損傷海馬區(qū)所誘導的AD大鼠模型與正常大鼠比較，其β-Catenin蛋白表達顯著降低(P<0.05)，而經Wnt3a對抗后可顯著上調β-Catenin蛋白的表達(P<0.01)；同時，β-Catenin蛋白表達增高后，海馬組織中NSCs增殖分化顯著增多(與對照組比較P<0.05，與AD組比較P<0.01)；此外，經Wnt3a對抗后，實驗組大鼠學習記憶等行為能力顯著優(yōu)于AD組(P<0.05)。綜合以上結果，進一步證實Aβ1-42可以抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，并且可能是Aβ致AD的發(fā)病機制之一；激活Wnt/β-catenin信號通路可以增強內源性NSCs的增殖分化，并且可以拮抗Aβ1-42誘導的神經細胞損傷、促進神經功能修復，是治療AD的可進一步探索研究方法之一。

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黑龍江省教育廳科學技術研究項目，編號：12531698。

盛寶英(1964～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導師。

姜堯佳(1976～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任醫(yī)師。E-mail：jyj761024@163.com。

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1008-0104(2017)06-0101-03

2017-06-13)