新生SD大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)①

趙 勇，劉曉偉，林治宇，馬 雷，徐振宇，呂少春，李梅秀，田國(guó)忠

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

新生SD大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)①

趙 勇，劉曉偉，林治宇，馬 雷，徐振宇，呂少春，李梅秀，田國(guó)忠

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

目的:探討乳鼠原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，簡(jiǎn)便穩(wěn)定地獲得高存活率和純度的心肌細(xì)胞。方法: 無菌條件下取1～3d內(nèi)新生SD大鼠的心室肌組織，首先用胰蛋白酶消化心肌組織一次，再用I型膠原酶短時(shí)多次消化，然后應(yīng)用差速貼壁分離法和化學(xué)試劑抑制法純化心肌細(xì)胞。對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、存活率檢測(cè)和免疫熒光鑒定。結(jié)果:臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率在95%以上。培養(yǎng)24h后的心肌細(xì)胞已貼壁生長(zhǎng)，呈梭形及多邊形，有自發(fā)性搏動(dòng)，48h后細(xì)胞偽足相互交織成網(wǎng)，進(jìn)而形成細(xì)胞簇，呈現(xiàn)同步性搏動(dòng)。免疫熒光鑒定心肌細(xì)胞純度達(dá)96%。結(jié)論:此種方法能夠可靠地獲得較高存活率和純度的原代乳鼠心肌細(xì)胞。

心肌細(xì)胞；原代培養(yǎng)；新生大鼠

體外培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞，其細(xì)胞成分單一，且相對(duì)集中，具備原有的許多結(jié)構(gòu)和功能，還消除了神經(jīng)、體液等因素的影響，因此在研究心肌細(xì)胞生理、病理、心血管疾病的發(fā)病機(jī)制及藥物作用機(jī)理等方面都有廣泛的應(yīng)用。關(guān)于心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的文獻(xiàn)報(bào)道很多，但如何獲得較高存活率和純度的心肌細(xì)胞仍是關(guān)鍵問題。本研究對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)的方法進(jìn)行了深入探討，經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)觀察，總結(jié)出一種穩(wěn)定可靠的原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法，能培養(yǎng)出純度高、活力強(qiáng)的心肌細(xì)胞。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1～3d的新生SD大鼠10～16只，雌雄不限，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑

胰酶(Beyotime)，I型膠原酶(Sigma)，DMEM(HyClong)，胎牛血清(四季青)，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxy Uridine，BrdU)(Sigma)，α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-Sarcomeric actinin)單克隆抗體(博士德)，F(xiàn)ITC(北京中杉金橋)，DAPI(博士德)。

1.3 新生大鼠心肌細(xì)胞的制備

取出生1～3d的SD大鼠，雌雄不限，用75%酒精對(duì)乳鼠全身皮膚進(jìn)行消毒3次，在劍突上一肋剪開胸骨，擠出心臟，將心尖周圍組織剪下放入預(yù)冷的D-Hanks液中反復(fù)沖洗3次，將心肌剪成0.5～1mm3大小的糜狀物后放入一小玻璃瓶中，加入0.08%胰酶溶液，放入磁力攪拌子，蓋好瓶口，放在磁力攪拌器上，37℃水浴下，以60～80r/min轉(zhuǎn)速攪拌消化4min。棄去上清液，再加入0.1%的I型膠原酶溶液反復(fù)消化6～9次或者至組織塊完全消化(肉眼見組織由紅轉(zhuǎn)白呈半透明)為止，每次消化8min，將上清液移入尖頭無菌離心管中，加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液以終止消化。然后將上清液經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾(去除未消化組織及細(xì)胞團(tuán))，以1000r/min離心10min，棄去上清液，在沉淀中加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，反復(fù)輕輕吹打后將細(xì)胞懸液移入直徑10cm的無菌培養(yǎng)皿中，放入含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中孵育90min，按差速貼壁分離法除去成纖維細(xì)胞純化心肌細(xì)胞。取出該培養(yǎng)皿，將未貼壁細(xì)胞懸液以2×105/mL密度接種于6孔板中(孔底預(yù)先放置無菌6孔板專用細(xì)胞爬片)，加入終濃度為0.1mmol/L的BrdU以抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，放在37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48～60h首次換液且不加BrdU，以后隔1天換液。

1.4 心肌細(xì)胞存活率檢測(cè)

將適量細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液9:1混勻，靜置1min，然后將混合液滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，而死細(xì)胞則被染成藍(lán)色。細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化和搏動(dòng)情況。

1.6 心肌細(xì)胞的免疫熒光鑒定

心肌細(xì)胞培養(yǎng)48～60h后取出細(xì)胞爬片，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，0.1%Triton X-100透化20min，PBS漂洗3次，10%山羊血清室溫封閉30min，加入小鼠抗大鼠α- Sarcomeric actinin(橫紋肌肌動(dòng)蛋白)抗體，4℃過夜，PBS漂洗3次，加入偶聯(lián)FITC的熒光二抗，避光室溫孵育1h，再加入DAPI 避光孵育5 min，倒置熒光顯微鏡下拍照。隨機(jī)取10個(gè)高倍視野，心肌細(xì)胞胞漿被抗α- Sarcomeric actinin抗體特異性染成綠色，DAPI 將細(xì)胞核染為藍(lán)色，計(jì)數(shù)綠色胞質(zhì)細(xì)胞數(shù)及藍(lán)色細(xì)胞核數(shù)。心肌細(xì)胞純度(%)=綠色胞質(zhì)細(xì)胞數(shù)/藍(lán)色細(xì)胞核數(shù)×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞存活率檢測(cè)

光鏡下觀察計(jì)數(shù)板上的心肌細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)溶液的混合液中心肌細(xì)胞的顏色，藍(lán)色為死細(xì)胞，未染色的為活細(xì)胞。經(jīng)檢驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞存活率在(96.68±0.67)%，見表1。

表1 大鼠心肌細(xì)胞存活率

2.2 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察可見，培養(yǎng)24h后的心肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，伸出偽足呈梭形及多邊形，折光度較強(qiáng)，有自發(fā)性搏動(dòng)，但節(jié)律和強(qiáng)度不同；48h后細(xì)胞偽足相互交織成網(wǎng)，進(jìn)而形成細(xì)胞簇，呈現(xiàn)同步性搏動(dòng)，頻率為40～90次/分鐘。

2.3 心肌細(xì)胞的免疫熒光鑒定

采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)在激光共聚焦顯微鏡下觀察見圖1，2，所得心肌細(xì)胞純度達(dá)(96.7±3.5)%，見表2。

圖1 心肌細(xì)胞鑒定IF×(100)

圖2 心肌細(xì)胞鑒定IF×(600)

實(shí)驗(yàn)次數(shù)心肌細(xì)胞純度(%)197．2296．8396．9496．5596．3

3 討論

首先無菌操作非常重要，乳鼠的全身酒精消毒3次，剪開皮膚、取心肌組織的剪刀和剪碎心肌要使用3把不同的剪刀，這三個(gè)步驟所涉及的鑷子也要區(qū)分開，另外在劍突上一肋橫行剪開胸骨要避免破壞消化道導(dǎo)致污染。只要進(jìn)行嚴(yán)格無菌操作，即使不加抗生素細(xì)胞培養(yǎng)不會(huì)被細(xì)菌污染，這樣既不會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，也排除了藥物干擾因素。消化心肌組織常用的酶有胰蛋白酶和膠原酶[1]，胰蛋白酶能水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)，但作用較強(qiáng)，容易損傷細(xì)胞膜，單獨(dú)使用胰蛋白酶，很難穩(wěn)定得到大量活力較強(qiáng)的心肌細(xì)胞。膠原酶作用較溫和，通過分解細(xì)胞間質(zhì)中的膠原纖維來釋放細(xì)胞，在新生大鼠心肌組織中，以I型膠原為主[2]，因此我們選用I型膠原酶來分離心肌細(xì)胞，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)得出使用1% I型膠原酶，短程多次消化，便能獲得大量活力較強(qiáng)的心肌細(xì)胞。以往常用胰蛋白酶和膠原酶[3～6]的混合液來消化心肌組織，我們也嘗試過多次，即使調(diào)低酶的濃度，縮短每次消化時(shí)間，仍常有消化過度的情況。另外，消化時(shí)我們使用磁力攪拌子來攪拌酶液中的心肌組織，使二者充分接觸，提高消化效率。消化后的心肌組織中含有大量的成纖維細(xì)胞，所以去除成纖維細(xì)胞是純化心肌細(xì)胞的關(guān)鍵。根據(jù)成纖維細(xì)胞貼壁速度快于心肌細(xì)胞的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用差速貼壁分離法除去絕大部分成纖維細(xì)胞，并結(jié)合化學(xué)試劑抑制法在培養(yǎng)的48～60h內(nèi)應(yīng)用Brdu抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，這樣能夠獲得純度較高的心肌細(xì)胞。

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1.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)：81370342；2.黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目，編號(hào)：201610222073；3.佳木斯大學(xué)科研項(xiàng)目編號(hào)：13Z1201531，13Z1201535；4.黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目，編號(hào)：2016-KYYWF-0608；5.黑龍江省研究生創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào)：YJSCX2012-368HLJ。

趙勇(1977～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副教授。

田國(guó)忠(1966～)男，黑龍江北安人，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師。E-mail：tgz1966@163.com。

R322.1+1

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1008-0104(2017)06-0001-02

2017-07-07)