利用斑馬魚模型研究蘆筍有效成分對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用

劉發(fā)生，王榮春，郭敬蘭，陳艷莉, ，夏青，孔浩天，馮潤(rùn)良，韓利文*，張愛平，劉可春

(1. 山東省科學(xué)院生物研究所，山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；2. 山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 太原 030001；3. 濟(jì)南大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014)

【藥理與毒理】

利用斑馬魚模型研究蘆筍有效成分對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用

劉發(fā)生1, 2，王榮春1，郭敬蘭1，陳艷莉1, 3，夏青1，孔浩天1，馮潤(rùn)良3，韓利文1*，張愛平2*，劉可春1

(1. 山東省科學(xué)院生物研究所，山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；2. 山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 太原 030001；3. 濟(jì)南大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014)

采用正常發(fā)育48 hpf的轉(zhuǎn)基因斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以氯霉素處理引起免疫抑制，分別加入25.0～200.0 mg/L的蘆筍多糖、6.25～100.00 mg/L的蘆筍皂苷，處理24 h，觀察各組斑馬魚的發(fā)育情況，拍照并統(tǒng)計(jì)斑馬魚體內(nèi)中性粒細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果表明,氯霉素處理斑馬魚后，斑馬魚體內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)量減少，蘆筍多糖在濃度為50.0～200.0 mg/L范圍內(nèi)對(duì)斑馬魚體內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)量減少具有明顯改善作用，且具有明顯的劑量依賴效應(yīng)；蘆筍皂苷在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)均顯示出顯著的改善作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蘆筍的有效成分蘆筍多糖、蘆筍皂苷對(duì)斑馬魚免疫功能具有明顯的調(diào)節(jié)作用。

蘆筍；蘆筍多糖；蘆筍皂苷；免疫調(diào)節(jié)；斑馬魚

蘆筍(Asparagusofficinalis.L)，學(xué)名石刁柏，為百合科天門冬屬多年生草本植物，是一種傳統(tǒng)的藥用植物，研究發(fā)現(xiàn)蘆筍提取物具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗真菌、降血脂及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[1]。目前蘆筍廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健等諸多領(lǐng)域，其市場(chǎng)需求也在不斷增加。已有研究表明，蘆筍提取物具有抗癌、降血脂、增強(qiáng)免疫功能、抗衰老等藥理作用。蘆筍蛋白質(zhì)組成具有人體所必需的各種氨基酸，含量比例也較恰當(dāng)，微量元素中有較多的硒、鉬、鎂、錳，以及其它多種如多糖、皂苷、天門冬酰胺、蕓香苷、葉酸等藥用成分[2]。蘆筍最早被人關(guān)注的是口服蘆筍原汁具有一定的抗癌作用[3]，進(jìn)一步推測(cè)可能是其中的多糖類成分，從此多糖成為研究最多的一類活性成分。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)蘆筍活性成分的提取、分離及純化工藝研究[4]-[6]，蘆筍的生物活性作用及物質(zhì)基礎(chǔ)研究等[7]-[11]等方面進(jìn)行了大量的研究與探討。研究表明蘆筍中的多糖、皂苷是主要活性成分。謝燕霞[12]以小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7為模型，研究了蘆筍多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的影響，結(jié)果表明不同組分的蘆筍多糖均可激活巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)，刺激巨噬細(xì)胞釋放NO，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖，同時(shí)巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照有增強(qiáng)趨勢(shì)，從細(xì)胞水平上證明了蘆筍多糖對(duì)巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)具有促進(jìn)作用。

皂苷及皂苷元也是一類具有廣泛藥理活性的天然產(chǎn)物，研究表明，一些皂苷能顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞(如骨肉瘤、結(jié)腸癌、白血病、肝癌和乳腺癌)的增殖，并誘導(dǎo)它們發(fā)生凋亡。人參皂苷Rh1能顯著增加環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下ICR小鼠的胸腺指數(shù)，增強(qiáng)吞噬功能[13]。從革皮氏海參中提取海參皂苷能顯著促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)，促進(jìn)小鼠的非特異性免疫功能[14]。還有中藥絞股藍(lán)[15]、合歡皮[16]、三七[17]中的皂苷成分也具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用。

本文以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，對(duì)蘆筍活性成分蘆筍多糖、蘆筍皂苷的免疫調(diào)節(jié)功能進(jìn)行研究，為蘆筍藥用功能的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及溶液配制

Tg(lyz: EGFP)中性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)基因品系斑馬魚，由山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;

蘆筍多糖(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100292-200201純度為50%)，蘆筍皂苷(上海撫生生物有限公司，批號(hào)：100339-200407，純度為30%)。

鏈霉蛋白酶(Solarbio公司，批號(hào):119E0417)，二甲基亞砜DMSO(生工生物工程有限公司，批號(hào)：BB02BA0001)，氯霉素(上海超研生物科技有限公司)，PTU(上海中喬新舟生物科技有限公司)，其余試劑為分析純。

IX 51倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，TH4-200顯微熒光器(日本Olympus公司)，DP2-BSW圖像采集系統(tǒng) (日本Olympus公司)，SAX 16體視熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，博訊SPX-300B-G型光照培養(yǎng)箱(上?；巧锟萍加邢薰?，XW-80A微型漩渦混合儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)，斑馬魚養(yǎng)殖飼養(yǎng)設(shè)備(北京愛生科技公司)，LE204E電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

精密稱取蘆筍多糖35.1 mg、蘆筍皂苷37.5 mg，分別用二甲基亞砜(DMSO)配制成200 g/L的母液，備用；精密稱取氯霉素77.2 mg，用DMSO配制成100 g/L的母液，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

挑選受精后48 h (hour post fertilization, hpf) 健康斑馬魚胚胎，脫去卵膜，置于24孔培養(yǎng)板中，每孔10枚，加入氯霉素，同時(shí)分別加入蘆筍多糖、蘆筍皂苷，再加入培養(yǎng)液至2 mL，各實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置三組平行和氯霉素組，使孔中氯霉素終濃度為150.0 mg/L，蘆筍多糖終濃度為12.5、50.0、200.0 mg/L，蘆筍皂苷終濃度為6.25、25.00、100.00 mg/L，同時(shí)設(shè)立DMSO溶劑對(duì)照組。加蓋置于28 ℃光照培養(yǎng)箱中孵育至72 hpf，然后利用IX 51倒置顯微鏡觀察并采集每條魚的圖像，利用Image Pro-Plus軟件對(duì)斑馬魚泄殖腔至尾部區(qū)域的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 蘆筍多糖對(duì)斑馬魚中性粒細(xì)胞數(shù)量的影響

本文中所用Tg(lyz：EGFP)斑馬魚為中性粒細(xì)胞特異標(biāo)記綠色熒光的轉(zhuǎn)基因品系。氯霉素會(huì)引起免疫抑制，導(dǎo)致斑馬魚軀干部中性粒細(xì)胞數(shù)量減少。

蘆筍多糖對(duì)斑馬魚中性粒細(xì)胞數(shù)量的影響如圖1所示。

A 溶劑對(duì)照組；B 氯霉素組；C 12.5 mg/L蘆筍多糖組；D 50.0 mg/L蘆筍多糖組；E 200.0 mg/L蘆筍多糖組圖1 不同濃度蘆筍多糖溶液對(duì)72 hpf的斑馬魚免疫抑制模型中性粒細(xì)胞的影響(n=30)Fig.1 Effects of asparagus polysaccharide solution with different concentrations on neutrophils in 72 hpf zebrafish immune suppression model(n=30)

氯霉素對(duì)斑馬魚中性粒細(xì)胞的影響如圖1(B)所示，與圖1(A)對(duì)比，熒光點(diǎn)數(shù)明顯減少，代表著氯霉素組中性粒細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組相比明顯下降，說明免疫抑制模型成功建立。當(dāng)加入蘆筍多糖后，隨著給藥濃度的增加，熒光點(diǎn)數(shù)也隨之增加，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，濃度越大，中性粒細(xì)胞越多，呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)，說明蘆筍多糖對(duì)免疫損傷具有較強(qiáng)修復(fù)作用，見圖1(C-E)。

不同濃度蘆筍多糖對(duì)免疫損傷后斑馬魚中性粒細(xì)胞數(shù)量如表1所示。

表1 在72 hpf 時(shí)不同濃度蘆筍多糖溶液對(duì)斑馬魚中性粒細(xì)胞數(shù)目的影響

##表示與溶劑對(duì)照組相比p<0.01；*表示與氯霉素造模組相比p<0.05，**表示p<0.01。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示溶劑對(duì)照組斑馬魚軀干部中性粒細(xì)胞數(shù)目為85±4.51個(gè)，氯霉素處理后中性粒細(xì)胞數(shù)降至59±4.55個(gè)，與對(duì)照組相比，數(shù)目有較大幅度下降，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。加入蘆筍多糖后，斑馬魚中性粒細(xì)胞的數(shù)目也隨之增加，當(dāng)蘆筍多糖給藥濃度為200 mg/L時(shí)，中性粒細(xì)胞的數(shù)目達(dá)到85±4.88個(gè)，顯示蘆筍多糖對(duì)免疫功能具有一定的調(diào)節(jié)作用，且呈現(xiàn)出良好的劑量依賴效應(yīng)。

2.2 蘆筍皂苷對(duì)斑馬魚中性粒細(xì)胞數(shù)量的影響

蘆筍皂苷對(duì)斑馬魚中性粒細(xì)胞數(shù)量的影響如圖2所示。

A溶劑對(duì)照組；B氯霉素組；C 6.25 mg/L蘆筍皂苷組；D 25.00 mg/L蘆筍皂苷組；E 100.00 mg/L蘆筍皂苷組圖2 不同濃度蘆筍皂苷溶液對(duì)72 hpf的斑馬魚免疫抑制模型中性粒細(xì)胞的影響(n=30)Fig.2 Effects of asparagus saponins solution with different concentrations on neutrophils in 72 hpf zebrafish immune suppression model (n=30)

氯霉素對(duì)斑馬魚中性粒細(xì)胞的影響如圖2(B)所示，與圖2(A)對(duì)比，熒光點(diǎn)數(shù)明顯減少，代表著氯霉素組中性粒細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組相比明顯下降，說明免疫抑制模型成功建立；而從圖2(C-E)可見，隨著蘆筍皂苷的加入，熒光點(diǎn)的數(shù)量增加，說明蘆筍皂苷對(duì)免疫損傷具有一定的修復(fù)作用。

不同濃度蘆筍皂苷對(duì)免疫損傷后斑馬魚中性粒細(xì)胞數(shù)量如表2所示。

表2 在72 hpf 時(shí)不同濃度蘆筍皂苷溶液對(duì)斑馬魚中性粒細(xì)胞數(shù)目的影響

##表示與溶劑對(duì)照組相比p<0.01;*表示與氯霉素造模組相比p<0.05，**表示p<0.01。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示溶劑對(duì)照組中中性粒細(xì)胞數(shù)目為85±4.51個(gè)，氯霉素處理后中性粒細(xì)胞數(shù)降至60±4.54個(gè)，與對(duì)照組相比，數(shù)目有較大幅度下降，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。蘆筍皂苷在6.25～100.00 mg/L的實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)具有較好的免疫功能調(diào)節(jié)作用。

3 討論

斑馬魚具有胚胎透明，發(fā)育快速等特點(diǎn)，可直接通過熒光倒置顯微鏡觀察熒光蛋白(EGFP)標(biāo)記后的斑馬魚器官發(fā)育或細(xì)胞發(fā)生，目前已構(gòu)建了多種熒光蛋白標(biāo)記的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，可用于觀察斑馬魚固有免疫的發(fā)育及免疫應(yīng)答的啟動(dòng)和發(fā)生，實(shí)時(shí)考察藥物對(duì)斑馬魚免疫功能的調(diào)節(jié)作用[18]。

中性粒細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，在固有免疫中發(fā)揮吞噬殺傷作用，同時(shí)可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，對(duì)適應(yīng)性免疫起重要的輔助和調(diào)節(jié)作用。因此，中性粒細(xì)胞數(shù)量的多少可直接反映免疫應(yīng)答效應(yīng)的強(qiáng)弱，體現(xiàn)藥物對(duì)斑馬魚固有免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在氯霉素誘導(dǎo)的斑馬魚免疫抑制的條件下，斑馬魚體內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)目顯著降低，在給予蘆筍多糖處理后使斑馬魚體內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)目增加，且具有明顯的量效關(guān)系，顯示對(duì)免疫系統(tǒng)的改善作用，季宇彬[19]-[20]等研究表明蘆筍多糖對(duì)S180小鼠紅細(xì)胞CD35的數(shù)量和活性也具有顯著性增強(qiáng)作用，同時(shí)蘆筍多糖具有增強(qiáng)淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)的作用，從而說明蘆筍多糖具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。

在蘆筍早期研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了其乙醇提取物具有免疫調(diào)節(jié)功能[21]，但是，并未揭示免疫調(diào)節(jié)作用是否與多糖之外的成分有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蘆筍中皂苷成分也呈現(xiàn)出了一定的對(duì)免疫系統(tǒng)的改善作用，在氯霉素誘導(dǎo)斑馬魚免疫抑制使斑馬魚體內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)目顯著降低的條件下，給予蘆筍皂苷處理，觀察到斑馬魚體內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)目增加，呈現(xiàn)出了一定的免疫提升作用，為蘆筍的提高免疫、抗腫瘤作用等功能提供了新的證據(jù)。

本研究以斑馬魚為動(dòng)物模型，探討了蘆筍多糖、蘆筍皂苷對(duì)斑馬魚的免疫調(diào)節(jié)作用，為研究蘆筍的免疫調(diào)節(jié)功能提供了依據(jù)，也為后續(xù)蘆筍多糖、蘆筍皂苷作為人體免疫佐劑的開發(fā)，以及臨床應(yīng)用的推廣等提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Theimmune-regulatoryeffectsofactiveingredientsofasparagususingzebrafishmodel

LIUFa-sheng1, 2,WANGRong-chun1,GUOJing-lan1,CHENYan-li1, 3,XIAQing1,KONGHao-tian1,FENGRun-liang3,HANLi-wen1*,ZHANGAi-ping2*,LIUKe-chun1

(1.BiologyInstitute,ShandongAcademyofSciences,KeyLaboratoryforDrugScreeningTechnologyofShandongAcademyofSciences,ShandongJinan250014China; 2.ShanxiMedicalUniversity,SchoolofPharmaceuticalScience,ShanxiTaiyuan030001,China; 3.UniversityofJinan,ShandongJinan250014,China)

∶In this experiment, 48 hpf (hour post fertilization) healthy transgenic zebrafish Tg(lyz: EGFP) was used as animal model. Firstly, immune suppression of zebrafish embryos was induced by chloramphenicol treatment. Then those zebrafish embryos were treated with 25.0～200.0 mg/L asparagus polysaccharide and 6.25～100.00 mg/L asparagus saponins for 24 h, respectively. Finally, the development of zebrafish in each group was observed under the microscope,and the number of neutrophils in zebrafish was recorded and counted to evaluate their immune-regulatory effects. The results showed that the numbers of neutrophils in 72hpf zebrafish trunk area decreased in chloramphenicol-induced group.Asparagus polysaccharide group(50.0～200.0 mg/L) showed a significant immunological enhancement effect with dose-dependent manner. Asparagus saponins could also significantly improve chloramphenicol-induced immunosuppressive effects within the experimental dose range. In this study, This study showed that the active ingredients of asparagus, such as polysaccharide and asparagus saponin, had obvious regulation effects on the immune function of zebrafish, which provided the scientific basis for further development of asparagus.

∶Asparagus; Asparagus polysaccharide; Asparagus saponins;immune-regulation;zebrafish

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.06.005

2017-09-11

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016GSF121009，2016GGC01089)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2016YL009)；國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201505030)

劉發(fā)生 (1993—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬锓治?。E-mail: liufasheng34@163.com

*通信作者，韓利文 (1980—)，男，博士，研究方向?yàn)樗幬锖Y選及代謝組學(xué)研究。E-mail: hanliwen08@126.com；張愛平 (1965—)，女，博士，研究方向?yàn)樗幬锱c生物大分子相互作用研究。E-mail: zhangap1@163.com

R965.1

A

1002-4026(2017)06-0029-06