超高效合相色譜法測定火龍果果酒中游離氨基酸的含量

齊寧利，龔霄，馬麗娜，張?zhí)K慧，龍倩倩，李積華, 2

1(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，廣東 湛江，524001) 2(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 湛江,524001)3(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖北 武漢，430070) 4(銅仁市食品藥品檢驗所，貴州 銅仁，554300)

超高效合相色譜法測定火龍果果酒中游離氨基酸的含量

齊寧利1，龔霄2*，馬麗娜2, 3，張?zhí)K慧2, 3，龍倩倩2, 4，李積華1, 2

1(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，廣東 湛江，524001) 2(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 湛江,524001)3(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖北 武漢，430070) 4(銅仁市食品藥品檢驗所，貴州 銅仁，554300)

建立超高效合相色譜測定食品中游離氨基酸的方法。選取Acquity UPC2Torus Diol(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱，流動相由A(超臨界二氧化碳)和B(V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1)組成，2.5 mmol/L乙酸銨作為改性劑，流速2.0 mL/min，紫外檢測器波長280 nm，補償范圍330～430 nm，背壓1 800 psi。結(jié)果表明，該方法具有良好的線性(R2= 0.999 0～0.999 8)，分離度高于1.22，檢出限和定量限范圍分別為23～57 ng/L和70～178 ng/L，線性范圍為20～400 μg/mL，加標(biāo)回收率在85.6%～101.2%之間。該方法被成功用于火龍果酒樣品中游離氨基酸含量的測定，也為分析其他食品基質(zhì)中游離氨基酸分布情況提供了新的方法。

超高效合相色譜(UPC2)；游離氨基酸；測定；火龍果果酒

氨基酸是一類既含氨基(—NH2)又含羧基(—COOH)的有機(jī)化合物的統(tǒng)稱，是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)的基本單位，也是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，不僅具有營養(yǎng)保健價值，還具有特殊的生理功效。除了作為重要的營養(yǎng)強(qiáng)化劑外，氨基酸本身也呈現(xiàn)酸、甜、苦、鮮味，被廣泛用于調(diào)味、增香、除臭、保鮮等諸多方面[1-3]。幾乎每類食品都含有游離氨基酸，在食品加工過程中，可以與肽、核苷酸、有機(jī)酸、糖、無機(jī)離子等形成相應(yīng)的呈味活性物質(zhì)，賦予每種食物獨特的風(fēng)味特征[4-6]。

目前，食品中游離氨基酸含量的測定主要采用電位滴定法、茚三酮比色法、消旋光法、氨基酸分析儀法、電噴霧質(zhì)譜法、色譜法等[7-10]。其中，高效液相色譜法準(zhǔn)確度最高，應(yīng)用最廣，但該方法最主要的缺點是分析時間長、分離度差、有機(jī)溶劑用量大。超高效合相色譜(UPC2)在2012年由Waters公司實現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，它集成了超臨界流體色譜(SFC)和UPLC技術(shù)，以超臨界CO2為主要的流動相，不僅可以與極性/非極性的多種固定相聯(lián)用，還可以使用相同的質(zhì)譜兼容的助溶劑，結(jié)合各種色譜柱進(jìn)行溶劑梯度調(diào)控，影響色譜分離，尤其適合結(jié)構(gòu)類似物，同分異構(gòu)體，對映異構(gòu)體和非對映體混合物的分離。具有黏度低、傳質(zhì)性能好、分離效率高、運行時間縮短、綠色環(huán)保的優(yōu)勢，對于確證復(fù)雜食品基質(zhì)中的分析物非常有價值[11-14]。本實驗建立了超高效合相色譜同時測定火龍果果酒中多種游離氨基酸的方法，并對其系統(tǒng)適用性進(jìn)行了初步考察，以期為氨基酸代謝組學(xué)研究提供新途徑和新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火龍果果酒(乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%)由湛江中熱科技有限公司提供。

氨基酸單標(biāo)(140624-201506，純度≥98%)，中國食品藥品檢定研究院；甲醇和乙腈(色譜純)、乙酸銨(色譜純，≥99%)，美國Sigma公司；乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯(DEEMM)、標(biāo)準(zhǔn)硼酸鹽緩沖液，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；高純二氧化碳?xì)怏w(≥99.99%)，湛江氧氣廠。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效合相色譜儀(配有紫外檢測器),美國Waters公司；Milli-Q超純水制備系統(tǒng),美國默克密理博公司；冷凍離心機(jī)，UNIVERSAL公司；旋渦振蕩器，德國IKA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別精確稱取0.1 g 各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1 mol/L的HCl溶液準(zhǔn)確定容至100 mL，配制成1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，通過梯度稀釋制備質(zhì)量濃度為0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃冷藏備用。

1.3.2 樣品前處理

取果酒樣品10 mL，1 500×g室溫下離心5 min，取上清液用0.22 μm水相膜過濾，待衍生化處理。

1.3.3 衍生化方法

參考REDRUELLO等報道的方法[15]，并做了修改。吸取490 μL標(biāo)準(zhǔn)硼酸鹽緩沖液(pH 9.0±0.1)于具塞離心管中，依次加入340 μL無水甲醇、450 μL標(biāo)品或樣品、15 μL的DEEMM，旋渦振蕩30 s后超聲水浴處理30 min，然后轉(zhuǎn)移到80 ℃水浴中恒溫反應(yīng)2 h，以保證過量的衍生化試劑和副產(chǎn)物完全降解，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后加入等體積甲醇，用0.22 μm水相膜過濾后進(jìn)樣分析。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Acquity UPC2Torus Diol(3.0 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相A為CO2，B為添加2.5 mmol/L乙酸銨的甲醇和乙腈(1∶1，v/v)混合溶液；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量2.0 μL；柱溫40 ℃；檢測波長280 nm，補償范圍330～430 nm；背壓1 800 psi；梯度洗脫：0～0.2 min 98% A，0.2～5.0 min 98%～70% A，5.0～15.0 min 70% A，15.0～17.5 min 70%～98% A。

1.3.5 系統(tǒng)適用性實驗

按照徐莉等[16]的方法進(jìn)行線性、檢測限和定量限、靈敏度和精密度、回收率等系統(tǒng)適用性考察。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱篩選

色譜的分離效果很大程度上取決于色譜填料及其鍵合方式[12]。本實驗選擇Acquity UPC2BEH (3.0 mm×100 mm，1.7 μm)、HSS C18SB(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)、Torus Diol(3.0 mm×100 mm，1.7 μm)和Torus PIC(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)四款UPC2色譜柱，以選擇性、分離度為主要指標(biāo)進(jìn)行篩查，結(jié)果見圖1。

圖1 不同色譜柱分離氨基酸混標(biāo)衍生物的色譜圖Fig.1 Chromatograms of amino acid derivatives separated with different chromatography columns

色譜柱Acquity UPC2Torus Diol填料為高密度二醇，其表面鍵合相的色譜性能與傳統(tǒng)的未鍵合硅膠固定相相當(dāng)，可以有效改善酸性或堿性化合物分離過程中的整體穩(wěn)定性。由圖1可知，Torus Diol色譜柱能夠?qū)⒍鄶?shù)氨基酸衍生物有效分離，具有較好選擇性。

2.2 改性劑的選擇

氨基酸是一類含有堿性氨基和酸性羧基的有機(jī)物，在水溶液中通常以兼性離子或偶極離子的形式存在，表現(xiàn)出典型的兩性電解質(zhì)特征。改變流動相pH環(huán)境會影響氨基酸衍生物的電離特性，進(jìn)而有助于改善峰形[16]。

本實驗選擇三氟乙酸或乙酸銨作為改性劑，以考察改性劑對氨基酸衍生物峰形的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸銨對氨基酸衍生物的拖尾峰形有較好的改善，圖2分別為添加改性劑前后氨基酸標(biāo)品衍生物的色譜圖。鑒于乙酸銨本身是一種強(qiáng)電解質(zhì)鹽，容易對超臨界系統(tǒng)造成影響，輕則損傷色譜柱、降低柱效，重則堵塞系統(tǒng)管路、引起壓力激烈波動，故將2.5 mmol/L的乙酸銨作為改性劑。

圖2 添加改性劑分離氨基酸標(biāo)品衍生物的色譜圖Fig.2 Chromatograms of amino acid derivatives separated with or without mobile phase modifier

2.3 助溶劑選擇

超臨界流體色譜是以超臨界CO2為主體，以少量甲醇、乙腈或異丙醇等有機(jī)溶劑為助溶劑，通過調(diào)整流動相的極性改變對分析物的溶解性，進(jìn)而達(dá)到改變目標(biāo)物洗脫順序和優(yōu)化分離效果的目的[17]。本實驗比較了甲醇、乙腈、甲醇和乙腈混合溶液等作為助溶劑對氨基酸衍生物的分離效果。

由圖3可以看出，在助溶劑甲醇中加入等體積乙腈，極性相對降低，流動相的溶解能力也得到相應(yīng)改變，部分氨基酸衍生物的保留變?nèi)?，出峰時間推遲，使得部分氨基酸衍生物之間的分離效果提高。雖然超臨界流體系統(tǒng)中采用的助溶劑比例不高，但對目標(biāo)化合物的保留強(qiáng)度即出峰時間快慢有著重要影響，這對于超臨界流體色譜方法開發(fā)、色譜條件優(yōu)化具有非常重要的意義。

圖3 不同助溶劑分離的氨基酸衍生物標(biāo)品的色譜圖Fig.3 Chromatograms of amino acid derivatives separated with different co-solvents

2.4 其他色譜條件優(yōu)化

超高效合相色譜技術(shù)結(jié)合了亞2 μm填料和高效超臨界流色譜兩項技術(shù)的優(yōu)點，具有較高的擴(kuò)散系數(shù)和傳質(zhì)速率，分析時間更短，分離效能更高。由于溫度、壓力和流速的微小變化都能引起流動相密度改變，進(jìn)而改變對分析物的溶解能力，所以調(diào)節(jié)柱溫、自動調(diào)節(jié)備壓都可以調(diào)節(jié)目標(biāo)化合物的分離效果[16-17]。本實驗考察了自動調(diào)節(jié)背壓(1 500～2 200 psi)、柱溫(30～60 ℃)和流速(1.0～3.0 mL/min)對樣品中目標(biāo)峰峰形及分離效果、色譜柱壓力及系統(tǒng)壓力、分析時間的影響。為保證系統(tǒng)安全，盡可能實現(xiàn)不同種類氨基酸衍生物及其與樣品雜質(zhì)的良好分離，優(yōu)化后色譜條件為：背壓1 800 psi，柱溫50 ℃，流速2.0 mL/min，結(jié)果見圖3。需要強(qiáng)調(diào)的是，與色譜柱、助溶劑及改性劑相比，這些色譜條件對目標(biāo)物分離不起關(guān)鍵作用，且它們之間相互影響，在實際方法開發(fā)過程中應(yīng)予以考慮。

2.5 線性、檢測限和定量限、靈敏度和精密度、回收率

選取1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg/mL的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.3方法進(jìn)行衍生化，考察線性、檢測限和定量限、靈敏度和精密度、回收率等指標(biāo)[18-19]。在上述優(yōu)化后的色譜條件下進(jìn)行測定，根據(jù)氨基酸單標(biāo)衍生物的保留時間進(jìn)行定性(如圖4A所示)。以氨基酸衍生物質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程，線性范圍在20～400 μg/mL；根據(jù)信噪比(S/N=9)計算出氨基酸的檢出限在23～57 ng/L，定量限在70～178 ng/L；通過加標(biāo)(添加水平分別為0.5、0.2、0.05 mg/mL)回收實驗得到加標(biāo)回收率在85.6%～101.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.48%～1.36%，結(jié)果見表1。由表1可知，該方法分離效果好(R=1.22～21.38)、靈敏度和精密度高，準(zhǔn)確性和再現(xiàn)性好。

1-亮氨酸；2-異亮氨酸；3-纈氨酸；4-丙氨酸；5-蛋氨酸；6-甘氨酸；7-苯丙氨酸;8-脯氨酸;9-絲氨酸; 10-酪氨酸;11-谷氨酸;12- 組氨酸;13-天冬氨酸;14-賴氨酸;15-精氨酸;16-半胱氨酸)圖4 氨基酸標(biāo)品(A)和樣品(B)中氨基酸衍生物的色譜圖Fig.4 Chromatogram of the derivatives of standard amino acids (A) and selected sample (B)

表1 氨基酸的線性、靈敏度、精密度及回收率Table 1 Linear ranges,sensitivity,precision and recovery of standard amino acids

注：x，氨基酸的質(zhì)量濃度(μg/mL)；y，氨基酸積分峰面積；1)檢出限(ng/L)：信噪比(S/N)為3；2)定量限(ng/L)：信噪比(S/N)為10。

2.6 樣品分析

取紅心火龍果酒1 mL，按照1.2.3方法進(jìn)行衍生化，用0.22 μm水相膜過濾，利用優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖如圖4B所示。

火龍果酒中游離氨基酸含量見表2。由表2可知，火龍果酒中的主要氨基酸有組氨酸(12.17 mg/L)、酪氨酸(5.02 mg/L)、絲氨酸(4.37 mg/L)、蛋氨酸(3.85 mg/L)、甘氨酸(3.76 mg/L)、苯丙氨酸(3.28 mg/L)和丙氨酸(3.22 mg/L)；其次為異亮氨酸(2.46 mg/L)、精氨酸(2.37 mg/L)、亮氨酸(2.03 mg/L)；此外，還有少量的賴氨酸(1.72 mg/L)，脯氨酸(1.53 mg/L)。

表2 火龍果酒樣品中游離氨基酸含量 單位：mg/LTable 2 Content of free amino acids of the selected pitaya wine

3 討論與結(jié)論

超高效合相色譜主要以超臨界CO2為主，具有黏度低、傳質(zhì)性能高和分離效率好等優(yōu)點。同時，助溶劑使用量大大降低，降低了運行成本并減少了對環(huán)境的污染。結(jié)合色譜柱亞 2 μm顆粒填料技術(shù)，使其在手性化合物、同分異構(gòu)體、結(jié)構(gòu)類似物等分析中具有明顯優(yōu)勢，被公認(rèn)為是一種高效液相色譜和氣相色譜的補充技術(shù)或替代技術(shù)。

前期對幾種不同試劑的衍生效果進(jìn)行了比較實驗，最終選擇操作過程簡單、衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定的DEEME作為氨基酸柱前衍生化試劑[20-23]，建立了基于超臨界流體色譜法測定食品中多種游離氨基酸的方法，結(jié)果表明該方法具有分析時間短、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。本實驗雖然針對火龍果果酒樣品進(jìn)行了方法驗證，理論上對于固體及半固體食品同樣適用，只要對樣品增加必要的預(yù)處理步驟，然后采用0.1 mol/L的HCl溶液進(jìn)行均質(zhì)，離心取上清液即可。針對游離氨基酸含量較高的食品基質(zhì)需要進(jìn)行適當(dāng)稀釋，必要時，也要對方法的洗脫程序進(jìn)一步優(yōu)化，以使目標(biāo)峰和雜質(zhì)峰得到有效分離。當(dāng)然，進(jìn)一步開展與HPLC色譜法的對比實驗也是今后研究的重要內(nèi)容[24]。總之，超高效合相色譜法對分析火龍果果酒中游離氨基酸種類及含量具有重要意義[25]，也為開展傳統(tǒng)發(fā)酵食品加工過程中氨基酸代謝組學(xué)研究提供了新途徑和新方法。

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Determinationoffreeaminoacidsinpitayawinebyultraperformanceconvergencechromatography

QI Ning-li1,GONG Xiao2*,MA Li-na2,3,ZHANG Su-hui2,3,LONG Qian-qian2,4,LI Ji-hua1,2

1(Agricultural Products Processing Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment on Agro-products Processing,Ministry of Agriculture,Zhanjiang 524001,China) 2(Agricultural Products Processing Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Zhanjiang 524001,China) 3(College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China) 4(Tongren Institute for Food and Drug Control,Tongren 554300,China)

A new method based on ultra performance convergence chromatography (UPC2) was developed for analysis of free amino acids in fruit wine.They were separated on an Acquity UPC2Torus Diol (3.0 mm×100 mm,1.7 μm) with a mobile phase consisted of supercritical CO2and methanol ∶acetonitrile (1∶1v/v,with 2.5 mmol/L ammonium acetate as mobile phase modifier).The flow rate was 2.0 mL/min and DAD detection was set at 280 nm with a compensation range of 330-430 nm.Back pressure was 1 800 psi.The results showed good linearity (R2=0.999 0-0.999 8) and high resolution (>1.22).The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) ranged from 23-57 ng/L and 70-178 ng/L,respectively.The linear range was between 20 and 400 μg/mL.The spiked recoveries were ranged from 85.6% to 101.12%.It was applied for the free amino acids analysis of selected pitaya wine,which could also provide a new method for the analysis of free amino acid distribution in other food matrix from different sources.

ultra performance convergence chromatography (UPC2); free amino acids; determination; pitaya wine

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015034

講師(龔霄副教授為通訊作者，E-mail:yiyesuifeng@126.com)。

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(1630122017021);湛江市科技計劃項目(2016A03012);農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303077)

2017-06-26，改回日期：2017-08-30