自組裝雙親短肽氨基酸組成及連接肽對(duì)其融合酶表達(dá)量的影響

趙偉欣，劉松，劉立明，陳堅(jiān)，堵國(guó)成

1(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)3(江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

自組裝雙親短肽氨基酸組成及連接肽對(duì)其融合酶表達(dá)量的影響

趙偉欣1,2，劉松1,2，劉立明3*，陳堅(jiān)1,2，堵國(guó)成1,2

1(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)3(江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

自組裝雙親短肽(self-assembling amphipathic peptides，SAPs)是一類親疏水氨基酸按一定規(guī)律分布，具有自聚合效應(yīng)的氨基酸短肽，融合在酶蛋白N端時(shí)，具有促進(jìn)表達(dá)和穩(wěn)定化的功能。以自組裝雙親短肽S1(AEAEAKAKAEAEAKAK)為出發(fā)序列，與來(lái)源于Bacillussp.WSHB04-02 的堿性果膠酶(alkaline polygalacturonate lyase，PGL)組成的融合酶為模式蛋白，考察SAPs的氨基酸組成及SAPs融合蛋白內(nèi)部連接肽(linker peptide)對(duì)PGL-SAP融合酶的表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示，含有較弱疏水性的甘氨酸和丙氨酸殘基的PGL-S1突變體可使融合酶正常表達(dá)，其中，含有組氨酸的PGL-S1v1具有相對(duì)最高的胞外酶活，較野生型提高了9倍，較PGL-S1提高了1.5倍。連接肽方面，與剛性連接肽相比，含有柔性連接肽的融合酶具有更高的胞外酶活，含有(GGGGS)3的PGL-F-S1融合酶胞外酶活是野生型的14倍。上述結(jié)果表明，SAPs的氨基酸組成及融合蛋白之間的連接肽對(duì)PGL融合酶的表達(dá)具有重要影響。

自組裝雙親短肽；融合蛋白；連接肽；氨基酸極性；表達(dá)量；堿性果膠酶

近年來(lái)，基于蛋白質(zhì)工程的融合蛋白技術(shù)已逐漸應(yīng)用于多功能酶構(gòu)建和酶靠近效應(yīng)研究中，是目前獲得高催化效率或高表達(dá)量酶蛋白的重要且有效的方法[1]。其中，末端融合功能肽的技術(shù)對(duì)酶蛋白的催化性質(zhì)或表達(dá)量的改造已取得廣泛應(yīng)用[2-4]。在無(wú)酶結(jié)構(gòu)信息和大量突變體篩選的條件下，能夠快速獲得正向的酶蛋白突變體，較傳統(tǒng)分子改造技術(shù)的效率顯著提高。融合短肽對(duì)酶熱穩(wěn)定性或催化效率的影響最初由日本大阪大學(xué)URABE 教授在研究嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)中的過(guò)氧化氫酶的性質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)[5]。此后，大阪大學(xué)KANAYA 團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)C-端融合嗜熱古菌(Sulfolobustokodaii)核糖核酸酶C-端七肽(IGCIILT)，可以不同程度地提高希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)核糖核酸酶、大腸桿菌(Escherichiacoli)核糖核酸酶和S.tokodaii脂酶的熱穩(wěn)定性[2]。

由親疏水氨基酸按照一定規(guī)律分布組成的自組裝雙親短肽(self-assembling amphipathic peptides,SAPs)被LU等首次應(yīng)用于脂肪氧合酶(Lipoxygenase，LOX，EC 1.13.11.12)的表達(dá)量及熱穩(wěn)定性改造[3]。其中具有特殊電荷分布的S1(AEAEAKAKAEAEAKAK)短肽最早是來(lái)源于畢赤酵母的Zuotion蛋白。其中一個(gè)重要的假設(shè)是[6]，Zuotion蛋白與單鏈結(jié)合蛋白Ssb在核糖體上共同作用于初始肽鏈或是Zuotion蛋白單獨(dú)激活A(yù)TPsae(ATP合成酶)的活性，促使Ssb與新生肽鏈結(jié)合，其中Ssb是連接新生肽鏈與核糖體連接的重要蛋白。蛋白表達(dá)過(guò)程中，蛋白質(zhì)自身的穩(wěn)定性對(duì)其表達(dá)量也起到關(guān)鍵作用，S1的穩(wěn)定化功能也可在一定程度上提高其表達(dá)量。隨后，末端融合S1對(duì)環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶[7]，腈水合酶[8]、堿性淀粉酶[9]及堿性果膠酶[10]的蛋白表達(dá)量、熱穩(wěn)定性及催化效率均有正向促進(jìn)作用。清華大學(xué)LIN等利用與S1氨基酸組成類似的SAP(LELELKLKLELELKLK)融合在酶蛋白末端，可促進(jìn)生成活性包涵體[11-12]。說(shuō)明氨基酸組成對(duì)SAPs融合蛋白的分泌表達(dá)有重要影響。

研究將以易表達(dá)及酶活檢測(cè)精準(zhǔn)方便的堿性果膠酶(PGL，E.C.4.2.2.2)[23]和綜合作用效果最好的短肽S1(AEAEAKAKAEAEAKAK)[6]組成的融合蛋白PGL-S1為模式蛋白，參照前期SAPs對(duì)PGL融合酶表達(dá)量、酶學(xué)性質(zhì)及催化效率等影響[10,24]，系統(tǒng)地考察SAPs的氨基酸組成及連接肽的剛?cè)嵝詫?duì)融合蛋白表達(dá)量的影響，為SAPs類融合蛋白的設(shè)計(jì)提供參考。其中，PGL是一種在堿性環(huán)境下具有高活性的一類果膠裂解酶，可以通過(guò)反式消去作用切斷聚乳糖醛酸的 α-1，4-糖苷鍵并釋放出不飽和的寡聚半乳糖醛酸[23]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

E．coliJM109，E．coliBL21(DE3)及含有堿性果膠酶基因的質(zhì)粒pET-22b(+)/pgl及pET-22b(+)/pgl-S1均由本研究室獲得。

1.1.2 試劑

PrimeSTAR DNA高保真聚合酶、DNA片段回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段連接酶及大腸桿菌感受態(tài)制備試劑盒均購(gòu)自于Takara(大連)公司。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和氨芐青霉素均購(gòu)買于生工生物工程(上海)股份有限公司。Nu PAGE? Novex? Bis-Tris預(yù)制凝膠及所用標(biāo)準(zhǔn)蛋白購(gòu)自 Life Technologies公司。堿性果膠酶底物聚半乳糖醛酸(PGA)購(gòu)自于Sigma公司。其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：酵母粉 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L,葡萄糖20 g/L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉 24 g/L，胰蛋白胨 12 g/L，甘油 5 g/L，K2HPO472 mmol/L，KH2PO417 mmol/L，pH 7.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PGL-S1融合酶突變體的構(gòu)建

自組裝雙親短肽S1(AEAEAKAKAEAEAKAK)由非極性疏水的丙氨酸及極性親水的谷氨酸和賴氨酸組成，對(duì)其氨基酸組成進(jìn)行研究，分為3個(gè)方面：疏水氨基酸突變、親水氨基酸突變和親疏水氨基酸同時(shí)改變。改造策略如表1所示。以質(zhì)粒pET-22b(+)/pgl-S1為模板，以表2中引物進(jìn)行PCR獲得含有PGL及S1突變體基因的DNA片段，純化回收后，經(jīng)DpnⅠ快切酶將質(zhì)粒模板消化后柱回收，末端磷酸化連接后轉(zhuǎn)化至E．coliBL21(DE3)中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)。

表1 S1突變體Table 1 S1 variants

表2 S1突變基因擴(kuò)增引物序列 Table 2 Oligonucleotides used for mutagenesis

1.2.2 PGL-linker-S1融合酶的構(gòu)建

選用具有代表性的柔性(GGGGS)3和剛性(EAAAK)3兩種連接肽，構(gòu)建融合蛋白，考察剛?cè)嵝匀诤厦副磉_(dá)量的影響。片段(GGGGS)3和(EAAAK)3由上海生工公司按照大腸桿菌密碼子偏好性合成，以質(zhì)粒pET-22b(+)/pgl-S1為模板，PGL-S1-F和PGL-S1-R為引物PCR獲得DNA片段，DpnⅠ快切酶消化，純化回收后，與(GGGGS)3和(EAAAK)3片段用ClonExpressTMII試劑盒(Vazyme)進(jìn)行同源重組。將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E．coliBL21(DE3)進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)。

1.2.3 重組菌發(fā)酵

種子培養(yǎng)：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化獲得的重組菌單菌落接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的種子培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)10 h。

搖瓶發(fā)酵：以3%的接種量接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)中，37 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)至菌濃0.6～0.8，加入終濃度為0.04 mmol/L的IPTG，于30 ℃，220 r/min條件下誘導(dǎo)發(fā)酵48 h。

1.2.4 堿性果膠酶的酶活測(cè)定

堿性果膠酶反應(yīng)體系為：酶稀釋液 20 μL，含 0.2% PGA 的甘氨酸-NaOH 緩沖液 (0.2 mol/L，0.44 mmol/L的 CaCl2，pH 9.4)2 mL，無(wú)活性的酶液為空白對(duì)照。堿性果膠酶反應(yīng)條件為：45 ℃水浴 15 min，使用 3 mL 磷酸溶液 (0.03 mol/L) 終止反應(yīng)，235 nm 處測(cè)定反應(yīng)物吸光度值。

單位堿性果膠酶酶活的定義為：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)裂解聚半乳糖醛酸產(chǎn)生1 μmol 的寡聚半乳糖醛酸所用的酶量。計(jì)算方法如下：

(1)

式中：b，比色皿厚度，cm；4 600，不飽和半乳糖醛酸于235 nm處的摩爾吸光系數(shù)，L/(mol·cm)；t：酶促反應(yīng)時(shí)間(在酶促反應(yīng)線性范圍之內(nèi))，min。

1.2.5 堿性果膠酶的蛋白電泳分析

SDS-PAGE凝膠電泳分析，使用Life technologies公司預(yù)制膠Nu PAGE?Novex?Bis-Tris，操作步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。以0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGL-S1突變體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

S1(AEAEAKAKAEAEAKAK)是一類親疏水氨基酸交替分布的含有兩親性質(zhì)的短肽，能夠在水中自發(fā)組成有序的納米結(jié)構(gòu)。為研究不同氨基酸組成對(duì)該類雙親短肽融合蛋白的表達(dá)量及分泌的影響，對(duì)組成S1的氨基酸進(jìn)行不同類型的突變(表1)。采用PT linker(PTPPTTPTPPTTPTPT)連接自組裝雙親短肽及PGL(圖1A)。將構(gòu)建得到的9種SAPs融合酶的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E．coliBL 21(DE3)中表達(dá)。

2.2 PGL-linker- S1突變體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以PGL-S1為出發(fā)菌株，選取具有代表性的柔性(GGGGS)3，剛性(EAAAK)3及PTPPTTPTPPTTPTPT三種連接肽，研究不同剛?cè)嵝缘倪B接肽對(duì)對(duì)該類SAPs融合蛋白的表達(dá)量的影響(圖1B)。將構(gòu)建得到的3種融合酶的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E．coliBL 21(DE3)中表達(dá)。

圖1 PGL-S1 融合酶突變體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(A)；含有不同連接肽的PGL-S1融合酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(B)Fig.1 The plasmids construction of PGL-S1 variants(A);The plasmids construction of PGL-S1 with different linker(B)

2.3 不同氨基酸組成的S1 variants對(duì)PGL融合酶表達(dá)量的影響

將野生型PGL，PGL-S1及9種PGL-S1突變體表達(dá)菌株分別在上述條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液處理，測(cè)定胞外酶活，結(jié)果如圖2所示。

M-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量；0-PGL；1-PGL-S1；2-PGL-S1v1；3-PGL-S1v2；4-PGL-S1v3；5-PGL-S1v4；6-PGL-S1v5；7-PGL-S1v6；8-PGL-S1v7；9-PGL-S1v8；10-PGL-S1v9圖2 PGL及其融合酶突變體胞外酶的SDS-PAGE電泳分析(A)；胞外酶活測(cè)定結(jié)果(B)Fig.2 The SDS-PAGE analysis of PGL and the fusion enzymes(A)；The crude enzyme activity analysis of PGL and the fusion enzymes(B)

結(jié)果顯示，N端融合S1后，PGL-S1的胞外酶活提高至野生型的3倍。親水的極性氨基酸方面，當(dāng)將帶有正電荷的賴氨酸突變?yōu)閭?cè)鏈帶有咪唑基團(tuán)的帶有正電荷的組氨酸后，表達(dá)量顯著提高，PGL-S1v1的胞外酶活是PGL的10倍，PGL-S1的2.5倍。S1v2中將谷氨酸突變?yōu)閭?cè)鏈更短的帶有同樣負(fù)電荷的天冬氨酸后，表達(dá)量下降至與野生型相近，但將賴氨酸突變?yōu)橄嗨菩再|(zhì)帶有胍基的精氨酸時(shí)，相較于PGL-S1表達(dá)量變化不明顯。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合S1v2和S1v3，設(shè)計(jì)S1v4，PGL-S1v4胞外表達(dá)量相較于PGL-S1提高了0.7倍。氨基酸的疏水性對(duì)融合酶的可溶表達(dá)起決定性作用，丙氨酸替換為疏水性更強(qiáng)的纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸及苯丙氨酸后，蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯降低，但突變?yōu)楦拾彼岷蟊磉_(dá)量有所增加。說(shuō)明S1類自組裝雙親短肽的氨基酸組成對(duì)自組裝雙親短肽N端融合酶的蛋白表達(dá)量及胞外分泌有重要影響。

2.4 不同剛?cè)嵝缘倪B接肽對(duì)PGL融合酶表達(dá)量的影響

為比較不同剛?cè)嵝赃B接肽對(duì)PGL融合酶表達(dá)量的影響，以PGL-S1為出發(fā)菌，成功構(gòu)建PGL-F-S1及PGL-R-S1融合酶，分別以柔性(GGGGS)3和剛性連接肽(EAAAK)3連接。測(cè)定胞外酶活，結(jié)果如圖3所示，柔性連接肽對(duì)融合酶表達(dá)及分泌表達(dá)促進(jìn)效果更為明顯，在相同發(fā)酵條件下，PGL-F-S1胞外酶活較PGL-S1提高了2.39倍，較PGL提高了近13倍。而含有剛性連接肽(EAAAK)3的PGL-R-S1的胞外酶活與PGL-S1相近。

M-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量；1-PGL-S1；2-PGL-R-S1；3-PGL-F-S1圖3 含有不同連接肽的PGL融合酶胞外酶的SDS-PAGE電泳分析(A)；胞外酶活測(cè)定結(jié)果(B)Fig.3 The SDS-PAGE analysis of PGL and PGL-S1 with different linker(A); The crude enzyme activity analysis of the PGL and PGL-S1 with different linker peptide

3 討論

為提高異源蛋白的表達(dá)量，研究者通常融合較大的可溶性蛋白標(biāo)簽，如麥芽糖結(jié)合蛋白[25]等，但此類蛋白由于分子量過(guò)大導(dǎo)致影響原始酶學(xué)性質(zhì)等原因，常常需要后續(xù)處理將其除去。PFEFFER[26]等在大腸桿菌中表達(dá)目的蛋白的同時(shí)表達(dá)分子伴侶蛋白，提高了目的蛋白的可溶性表達(dá)比例。但在原核生物中，分子伴侶加速或減緩蛋白質(zhì)正確表達(dá)的過(guò)程往往不穩(wěn)定，在缺乏組裝所需要的空間位置時(shí)，有可能產(chǎn)生不正確的副反應(yīng)。與多種蛋白質(zhì)融合技術(shù)對(duì)比[13,27]， N端融合分子量較小的自組裝雙親短肽，在無(wú)需了解酶或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息的基礎(chǔ)上，可作為一種便捷、高效的酶蛋白改造策略。

以S1為出發(fā)短肽，研究自組裝雙親短肽的氨基酸組成對(duì)其融合酶表達(dá)量的分析，將包括S1在內(nèi)的10種雙親短肽融合至PGL的N端，考察其對(duì)蛋白表達(dá)量的影響。最終確定SAPs內(nèi)的疏水氨基酸組成對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)量有重要影響，其中疏水性最小的丙氨酸和甘氨酸可以使得融合蛋白進(jìn)行正常的可溶性表達(dá)。與PGL相比，PGL-S1v1胞外粗酶活提高了9倍。其中較為特殊的是，將丙氨酸替換為疏水性更強(qiáng)的亮氨酸后，胞內(nèi)不溶部分蛋白量顯著增加，且含有一定的酶活(胞內(nèi)酶活測(cè)定結(jié)果未列出)，這也與前期清華大學(xué)LIN等[11-12]的報(bào)道一致，其中S1v6(LELELKLKLELELKLK)由于具備可大量生成活性包涵體的特點(diǎn)，前期已被開(kāi)發(fā)成可作為蛋白質(zhì)純化生產(chǎn)的“pull-down”標(biāo)簽。

連接肽作為該類融合蛋白的重要組成部分，其長(zhǎng)度及剛?cè)嵝詫?duì)SAPs與蛋白之間相互作用起到關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，相較于剛性連接肽，柔性連接肽(GGGGS)n能更有效促進(jìn)SAPs對(duì)PGL的分泌效果，這類沒(méi)有形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的能力的連接肽，在空間上一般是以無(wú)規(guī)卷曲的形式存在能增加蛋白的可溶性，抗蛋白酶降解，并能提供催化過(guò)程中蛋白所需的柔性空間，使各個(gè)結(jié)構(gòu)域不相互干擾，因此得到非常廣泛的應(yīng)用[28-29]。且前期研究表明，對(duì)(GGGGS)n連接肽進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，在大腸桿菌中表達(dá)量可大幅度提高[16]，這也與本研究結(jié)果相符。相同長(zhǎng)度剛性(EAAAK)n系列連接肽與PT linker具有相近的結(jié)果，其中(EAAAK)n類連接肽自身能夠形成α螺旋[30]，能有效隔開(kāi)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，在中間形成相對(duì)穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而在一定程度上減少蛋白酶攻擊的可能性，這對(duì)真核表達(dá)體系的SAPs的融合酶尤為重要。

氨基酸的組成及連接肽的屬性對(duì)該類融合酶的設(shè)計(jì)仍然是個(gè)案處理(case by case)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，與現(xiàn)有功能多肽的應(yīng)用[31-32]及對(duì)連接肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)[33-34]等，為SAPs類融合酶或其他融合酶的設(shè)計(jì)提供參考。

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Analysisofthefactorsinfluencingtheexpressionofenzymesfusedwithself-assemblingamphipathicpeptides

ZHAO Wei-xin1,2,LIU Song1,2,LIU Li-ming3*,CHEN Jian1,2,DU Guo-cheng1,2

1(Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China) 2(School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China) 3(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Self-assembling amphipathic peptides (SAPs) are a kind of functional peptides,which have alternating hydrophilic and hydrophobic residues and can affect the thermal stability and catalytic properties of the fused enzymes.In this study,several SAPs fusion protein comprising S1 peptide (AEAEAKAKAEAEAKAK) derivatives andBacillussp.WSHB04-02 alkaline polygalacturonate lyase (PGL) or PGL-S1 with different linker peptides were constructed,and the effect of the linker peptides and the amino acids composition of SAPs on expression quantity the fusion enzymes were examined.The results showed that the hydrophobicity of hydrophobic amino acids make a critical contribution on the expression of PGL.The SAPs containing the weaker hydrophobic alanine and glycine residues could lead to normal expression of fusion protein.The PGL-S1v1 possessed relative high crude enzyme activity.Compared with the PGL and PGL-S1,the extracellular enzyme activity of PGL-S1v1 was increased by 9-fold and 1.5-fold,respectively.As for the linker peptides,the flexible linkers efficiently enhanced the extracellular expression of the fusion protein compared with the rigid counterparts.The crude enzyme activity of PGL-F-S1 with flexible linker peptide was increased 14-fold compared with PGL.These results suggested that the amino acids composition of SAPs and the flexibility of the linker peptides could effectively affect the expression quantity the fusion protein.

self-assembling amphipathic peptides; fusion enzymes; linker peptides; polarity of amino acid; catalytic efficiency; alkaline polygalacturonate lyase

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014923

博士研究生(劉立明教授為通訊作者，E-mail：mingll@jiangnan.edu.cn)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31401638)；江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(BE2016629)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31771913)

2017-06-08，改回日期：2017-09-03