一種含D-松醇發(fā)酵飲料對2型糖尿病大鼠肝損傷的干預作用

秦程廣，高山，孫明哲，崖薷丹，張澤生

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

一種含D-松醇發(fā)酵飲料對2型糖尿病大鼠肝損傷的干預作用

秦程廣，高山，孫明哲，崖薷丹，張澤生*

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

研究一種含D-松醇功能成分的混合菌種發(fā)酵飲料對STZ誘導2型糖尿病大鼠肝損傷的干預作用。通過釀酒酵母和乳酸菌混合發(fā)酵含D-松醇的角豆粉（carob powder）提取液，制備一款含D-松醇功能成分的發(fā)酵型低糖飲料。采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)SD大鼠4周后腹腔注射STZ建立2型糖尿病模型，將實驗大鼠分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組、發(fā)酵飲料低劑量組、發(fā)酵飲料高劑量組。灌胃發(fā)酵飲料4周后，測定大鼠空腹血糖（FBG）、肝臟指數(shù)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）含量，同時在光鏡下觀察各組大鼠肝組織細胞病理形態(tài)學改變。結(jié)果表明：與正常對照組相比，模型對照組大鼠血清中AST、ALT水平極顯著性升高（P＜0.01），HE染色顯示模型對照組大鼠較正常對照組大鼠肝細胞脂肪變性明顯，肝組織結(jié)構不清楚，肝細胞排列紊亂。與模型對照組大鼠相比，陽性對照組大鼠及發(fā)酵飲料劑量組大鼠血清中AST、ALT水平顯著性降低（P＜0.05），HE染色顯示陽性對照組和發(fā)酵飲料劑量組大鼠較模型對照組大鼠肝細胞脂肪變性明顯減少，肝細胞排列基本規(guī)則。結(jié)論：此含D-松醇發(fā)酵飲料對2型糖尿病大鼠的肝損傷有一定的干預作用。

D-松醇；發(fā)酵飲料；肝損傷；干預作用

2型糖尿?。╰ype-2 diabetes mellitus，T2DM）是一種以高血糖為主要表現(xiàn)的慢性、復雜性的代謝疾病，常伴胰島素抵抗、高血脂，其并發(fā)癥范圍廣泛[1]。過去人們對糖尿病的聚焦點主要在神經(jīng)損害、血管損害、腎損害，然而肝臟作為調(diào)節(jié)血糖最重要的器官，是參與機體糖代謝的重要組織之一，在穩(wěn)定血液中葡萄糖水平方面起到關鍵作用，肝功能在糖尿病治療中的作用正被更多的人關注[2-3]。D-松醇又名右旋肌醇甲醚、甲基肌醇、咳寧醇、三扁豆醇、3-甲基肌醇，是D-手性肌醇3位羥基中的H被甲基取代后的環(huán)多醇，屬于單糖，廣泛存在于豆類植物中[4-5]。已有研究表明[6-7]D-松醇可以降低2型糖尿病小鼠的血糖含量，同時對其肝損傷具有一定的干預作用。

乳酸菌和酵母菌在傳統(tǒng)發(fā)酵制品中經(jīng)過長期的自然發(fā)酵，已形成了一個穩(wěn)定的微生態(tài)環(huán)境，菌種間的相互促進和相互制約控制著產(chǎn)品的風味特點、營養(yǎng)特性。有學者認為酵母菌的代謝產(chǎn)物二氧化碳、丙酮酸或其化合物、丙酸鹽、琥珀酸鹽能夠刺激乳酸菌活動，為乳酸菌提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時提出酵母菌產(chǎn)生的維生素復合物、氨基酸刺激乳酸菌活動的結(jié)論[8-11]。

角豆（Ceratonia siliqua L.）因其含有豐富的D-松醇而具有較高價值。本研究以角豆粉（carob powder）為原料，酵母菌和乳酸菌為發(fā)酵菌種，通過兩種益生菌將原料中的糖利用而保留D-松醇，制備一款含D-松醇功能成分的發(fā)酵型低糖飲料，不僅降低了產(chǎn)品的含糖量，發(fā)揮益生菌的營養(yǎng)價值，同時又具有降血糖的功效。通過對實驗大鼠肝臟中一些生理生化指標的檢測，觀察肝組織病理結(jié)構變化，驗證該發(fā)酵飲料具有緩解糖尿病大鼠肝損傷的作用，從而為開發(fā)含D-松醇的功能性產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

所用動物為清潔級Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠75 只[12]，體重（200±10）g，購自北京大學醫(yī)學部實驗動物中心。

1.2 材料與設備

角豆粉：購于土耳其；實驗動物基礎飼料：北京維通利華實驗動物技術有限公司；羅格列酮：天津老百姓大藥房；鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）：美國 Sigma公司；大鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanineaminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate transaminase，AST）、肝糖原試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司；血糖試紙：美國lifescan公司；酵母菌、乳酸菌：天津科技大學食品工程與生物技術學院實驗室所有。

XS205電子天平：METTLER TOLEDO公司；One-Touch血糖儀：美國強生公司；UV-1800分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；BX53F正置熒光顯微鏡：日本Olympus公司；GSO RVALL LEGEND MICRO 17R離心機：美國Thermo Fisher公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 含D-松醇功能成分發(fā)酵飲料的制備

將角豆粉在料液比 1∶6（g/mL），溫度 60℃，時間2 h，提取2次的條件下制得提取液[13]；將提取液總糖濃度濃縮至 120mg/mL，按 1 ∶1（mL/mL）的比例添加12%的酵母菌和乳酸菌，37℃發(fā)酵42 h，離心后取上清液，高溫殺菌冷卻至室溫即為含D-松醇功能成分發(fā)酵飲料，其中D-松醇含量為18.1mg/mL。

1.3.2 糖尿病大鼠模型的建立

實驗動物始終飼養(yǎng)于潔凈級動物房中，恒溫[（23±2）℃]、恒濕（70%）條件穩(wěn)定，并保持12 h明暗交替。75只實驗大鼠喂飼基礎飼料進行1周適應性飼養(yǎng)后，隨機選取15只禁食（不禁水）12 h，測空腹血糖，作為該批次動物基礎血糖值。之后隨機分籠、標記、稱重，分正常對照組（15只）、模型組（60只）。正常對照組喂飼正常飼料，模型組喂飼高脂高糖飼料（高脂高糖飼料配方為：50%基礎飼料、20%白砂糖、16%豬油、11%酪蛋白、1%明膠、1%膽固醇、0.5%膽酸鹽、0.5%礦物質(zhì)、0.5%維生素[16]），4周后禁食（不禁水）12 h。將STZ溶解于無菌pH 4.2～4.5、0.1 mol/L的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖溶液中，溶液注射濃度為0.1 g/L。模型組大鼠按體重一次性腹腔注射STZ 30mg/kg，正常對照組則按體重一次性腹腔注射等量緩沖溶液。1周后禁食（不禁水）12 h，測血糖，模型組大鼠血糖值大于16.7 mmol/L的48只大鼠為高血糖造模成功動物[14-15]。

1.3.3 實驗動物分組

將48只造模成功大鼠按空腹血糖水平隨機分為4組，即模型對照組（C組）、陽性對照組（P組）、低劑量組（DL組）、高劑量組（DH組），每組 12只，組間血糖差異不大于1.1 mmol/L。再選取12只同一批次的正常大鼠作為正常對照組（N組），開始進入實驗階段。期間保證實驗動物自由飲水、攝食，每天觀察精神狀況、活動、飲食、飲水、體毛色澤情況。

實驗設計方案如表1所示。

表1 實驗設計方案Table 1 Experimental Design for grouping mice

1.3.4 血糖測定實驗

每7 d測定血糖值，禁食（不禁水）12 h后尾端靜脈取血，用血糖儀測定空腹血糖值。血糖下降率/%=（實驗前血糖值-實驗后血糖值）/實驗前血糖值×100。

1.3.5 肝臟生理生化指標檢測

1.3.5.1 臟器指數(shù)

臟器指數(shù)是指臟器質(zhì)量與體重的比值。

1.3.5.2 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）的測定

參照中生北控丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒使用說明書操作進行測定。

測定原理：谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化L-丙氨酸的氨基轉(zhuǎn)移，生成丙酮酸。丙酮酸與還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）在乳酸鹽脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）的催化下反應生成乳酸和氧化鈦煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）。NADH 在 340 nm處有特異吸收峰，其被氧化的速率與血清中ALT的活性成正比，在340 nm處測定NADH下降速率，即可測出ALT活性。

1.3.5.3 天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的測定

參照中生北控丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒使用說明書操作進行測定。

測定原理：谷草轉(zhuǎn)氨酶催化L-天冬氨酸的氨基轉(zhuǎn)移與蘋果酸脫氫酶（Malate dehydrogenase，MDH）催化的反應偶聯(lián)，使NADH氧化成NAD+。NADH在340 nm處有特異吸收峰，其被氧化的速率與血清中的AST的活性成正比，在340 nm處測定NADH下降速率，即可測出AST活性。

1.3.6 肝臟組織切片的病理學觀察

1.3.6.1 組織固定

取新鮮肝組織1塊（約10 mm×10 mm×2 mm），置于10%中性甲醛中固定，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，制成厚度3 μm切片，蘇木素-伊紅染色，中性樹膠封固。

1.3.6.2 肝細胞觀察

肝組織經(jīng)過石蠟包埋、切片、HE染色之后在正置熒光顯微鏡下觀察肝細胞病理變化，評估發(fā)酵飲料是否具有改善2型糖尿病大鼠肝損傷的作用。

1.4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”（M±SD）表示，運用SPSS軟件以t檢驗進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 含D-松醇發(fā)酵飲料對實驗大鼠臟器指標的影響

糖尿病患者普遍出現(xiàn)體重下降、身體消瘦的癥狀，同時肝臟因受損出現(xiàn)水腫的現(xiàn)象[17]，動物內(nèi)臟器官的重量、形態(tài)、色澤和臟器指數(shù)是衡量動物健康狀況的重要指標。依據(jù)臟器重量、臟器指數(shù)可大體確定機體病變程度，所以臟器指數(shù)是動物實驗中常用的基礎數(shù)據(jù)，含D-松醇發(fā)酵飲料對實驗大鼠臟器指數(shù)的影響見表2。

表2 含D-松醇發(fā)酵飲料對實驗大鼠臟器指標的影響（M±SD，n=10）Table 2 Effects of a fermented beverage enriched D-pinitol on organ index of experimental rat（M±SD，n=10）

從表2可以看出，在體重方面，C組大鼠體重與N組大鼠體重相比極顯著性降低（P＜0.01）；給予受試樣品后，P組與DH組大鼠體重相對于C組大鼠顯著性上升（P＜0.05）。C組大鼠的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)相較于N組大鼠均極顯著性升高（P＜0.01），說明機體已經(jīng)受損。給予受試樣品后，各組大鼠臟器指數(shù)有不同程度的恢復。

2.2 含D-松醇發(fā)酵飲料對實驗大鼠空腹血糖（FBG）的影響

糖尿病患者最直觀的病癥是患者的空腹血糖（Fasting billd glucose，F(xiàn)BG）明顯升高且長期維持在一個相對較高的水平，給予受試樣品干預期間，每周對實驗大鼠的空腹血糖值進行測定，實驗結(jié)果如表3所示。

表3 含D-松醇發(fā)酵飲料對實驗大鼠空腹血糖的影響（M±SD，n=10）Table 3 Effects of a fermented beverage enriched D-pinitol on FBG of experimental rat（M±SD，n=10）

由表3可知，造模成功后，C組大鼠FBG與N組大鼠相比極顯著性升高（P＜0.01）；給予受試樣品4周后，與C組大鼠FBG相比，P組大鼠FBG極顯著性下降（P＜0.01），血糖下降率為10.4%，DH組大鼠FBG顯著性下降（P＜0.05），血糖下降率為8.42%，DL組大鼠血糖下降率為5.36%，但無顯著性差異。

2.3 含D-松醇發(fā)酵飲料對實驗大鼠血清中ALT和AST的影響

轉(zhuǎn)氨酶是肝細胞損傷的敏感標志，因此測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性可反映肝細胞損傷的程度，結(jié)果如表4。

表4 含D-松醇發(fā)酵飲料對實驗大鼠血清中ALT和AST的影響（M±SD，n=10）Table 4 Effects of a fermented beverage enriched D-pinitol on the concentration of ALT and AST in serum of experimental rat（M±SD，n=10）

由表4可知，C組大鼠血清中AST和ALT值與N組相比極顯著性升高（P＜0.01）；DL組與C組相比ALT、AST值顯著性降低（P＜0.05）；P組和DH組與C組相比較，ALT、AST 值均極顯著性下降（P＜0.01）。

2.4 實驗大鼠肝細胞形態(tài)變化

肝臟組織經(jīng)過石蠟包埋、切片、固片、HE染色、封片后，在正置熒光顯微鏡下觀察肝細胞形態(tài)變化，結(jié)果如圖1所示。

圖1 肝細胞HE染色Fig.1 Hematoxylin-Eosin Staining of liver cell

由圖1可知，N組肝細胞形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構完整，肝細胞排列整齊，無變性。C組肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大量大小不一的脂肪空泡即發(fā)生脂肪變性，肝小葉結(jié)構不清楚，肝索排列紊亂。觀察P組、DL組及DH組可知，隨著灌胃劑量的增加，大鼠肝臟脂肪變性程度減輕，受損肝細胞數(shù)量減少，肝細胞排列逐漸趨于規(guī)則，與模型對照組相比，病理癥狀有明顯改善。

3 結(jié)論

本實驗通過給予實驗動物一個高糖高脂的飲食環(huán)境，誘導實驗動物出現(xiàn)胰島素抵抗現(xiàn)象，并伴隨腹腔注射低劑量STZ溶液損傷部分胰島β細胞來模擬建立生理、病理改變都接近于人類的2型糖尿病模型。

在美國，肝臟病變是2型糖尿病患者死亡的主要原因之一，2型糖尿病患者肝臟病變的標準死亡率遠遠高于2型糖尿病患者心血管病變的標準死亡率，2型糖尿病患者肝臟病變包括非酒精性脂肪肝病、肝硬化和肝細胞性肝癌、慢性丙型肝炎、急性肝功能衰竭。糖尿病患者血清AST、ALT的水平高于正常人[18]，這兩種轉(zhuǎn)氨酶參與的轉(zhuǎn)氨基反應是機體內(nèi)氨基酸與蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物三者相互轉(zhuǎn)化過程中的重要環(huán)節(jié)。ALT測定反映肝細胞損傷的靈敏度高于AST，肝損傷較輕時ALT便會釋放到血液中且在體內(nèi)滅活較慢，在肝細胞受損嚴重時，AST才會釋放到血液中。SD大鼠造模后，與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清中AST、ALT的活力極顯著性升高，說明大鼠肝細胞已經(jīng)嚴重受損，經(jīng)過4周干預后，陽性對照組和劑量組大鼠血清AST、ALT指標有不同程度的下降，說明羅格列酮和含D-松醇發(fā)酵飲料可以改善2型糖尿病大鼠受損的肝細胞。

通過正置熒光顯微鏡對肝臟切片進行觀察發(fā)現(xiàn)，模型對照組大鼠肝細胞腫脹程度增大，肝細胞呈彌漫性脂肪變性，胞質(zhì)內(nèi)充滿大量大小不等的圓形脂滴，肝小葉結(jié)構不清，小葉內(nèi)有炎癥細胞浸潤，細胞排布紊亂，進一步說明糖尿病會對肝細胞造成損傷，灌胃干預后，陽性對照組和劑量組大鼠肝臟細胞排列恢復規(guī)則，腫脹程度減小，脂肪變性現(xiàn)象明顯減輕，表明該含D-松醇發(fā)酵飲料能減輕2型糖尿病對大鼠肝臟的損傷，可使糖尿病肝臟的脂肪變性得到及時控制，對肝臟具有保護作用。

由此可見，該含D-松醇發(fā)酵飲料能夠降低患者血糖含量，增強機體抗氧化能力，對糖尿病肝臟損害有一定的保護作用，具體作用機制還有待進一步研究。

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Intervention Effect of A Fermented Beverage Enriched D-pinitol on Liver Damage of Type 2 Diabetic Rat

QIN Cheng-guang，GAO Shan，SUN Ming-zhe，AI Ru-dan，ZHANG Ze-sheng*
（Institute of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

This experiment studied the intervention effect of a fermented beverage enriched D-pinitol on liver damage of STZ-induced type 2 diabetic rat.To develop a fermented beverage which was low sugar，the fermentation of Saccharomyces cerevisiae and lactic acid bacteria with the carob powder extract enriched D-pinitol was been stuied.The type 2 diabetic rat were fed enrich-food for 4 weeks before administrated STZ，the SD rats were divided into normal control group，model control group，positive control group，low dose of fermented beverage enriched D-pinitol，high dose of fermented beverage enriched D-pinitol.After 4 weeks of a daily dose of the fermented beverage enriched D-pinitol，some biochemical parameters were measured，which includes FBG，the liver index，ALT，AST test and the pathology morphology change of rat liver tissue cell under research microscope.The Results showed that：Compared with normal control group，the serum AST，ALT level increased extremely significantly（P＜0.01），HE staining showed hepatocyte steatosis significantly in model control group rat，liver tissue structure was not clear，the arrangement of liver cell was disordered.Compared with model control group，the serum AST，ALT level decreased significantly（P＜0.05），HE staining showed liver steatosis decreased significantly in positive control group and dose group，the arrangement of liver cell was well-regulated.The fermented beverage enriched D-pinitol has the positive intervention effect on liver damage of type 2 diabetic rat.

D-pinitol；fermented beverage；liver damage；intervention effect

秦程廣，高山，孫明哲，等.一種含D-松醇發(fā)酵飲料對2型糖尿病大鼠肝損傷的干預作用[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（1）：157-161

QIN Chengguang,GAO Shan,SUN Mingzhe，et al.Intervention Effect of A Fermented Beverage Enriched D-pinitol on Liver Damage of Type 2 Diabetic Rat[J].Food Research and Development，2018，39（1）：157-161

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.031

秦程廣（1992—），男（漢），碩士研究生，研究方向：食品添加劑與功能配料。

*通信作者：張澤生（1956—），男（漢），教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分。

2017-05-31