刺梨自然發(fā)酵后抗氧化物質(zhì)含量與抗氧化活性分析

（貴州大學(xué)，貴州貴陽550025）

刺梨自然發(fā)酵后抗氧化物質(zhì)含量與抗氧化活性分析

熊巧儀，劉丁群，魯敏

（貴州大學(xué)，貴州貴陽550025）

以刺梨果實與冰糖按3種比例（質(zhì)量比1∶1，2∶1，4∶1）制作酵素，測定酵素及刺梨自然發(fā)酵后殘余果實中維生素C（VC）、總酚、類黃酮、類胡蘿卜素含量及超氧化物歧化酶（SOD）活力，同時采用超氧陰離子自由基（·O2－）、羥基自由基（·OH）和1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）體系分析體外抗氧化活性，并比較抗氧化物質(zhì)與抗氧化活性之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，果糖比1∶1制作的刺梨酵素中VC、總酚、SOD酶活性、·OH清除率與·O2－清除率最高，分別達(dá)到 1 519.31mg/100mL、60.65mg/mL、8 571.43 U/mL、78.69%和 98.66%，且 VC、總酚和 SOD 酶活性與·OH 及·O2－清除率呈顯著到極顯著正相關(guān)；果糖質(zhì)量比4∶1自然發(fā)酵后殘余果實中類胡蘿卜素、類黃酮、總酚、·OH清除率與DPPH·清除率最高，分別為32.05mg/100 g、13.55mg/g、37.58mg/g、62.42%和95.33%，且類胡蘿卜素、類黃酮和總酚均與·OH及DPPH·清除率呈顯著到極顯著正相關(guān)。不論在刺梨酵素中，還是在刺梨自然發(fā)酵后的殘余果實中，總酚與·OH清除率始終存在極顯著的正相關(guān)性

刺梨；酵素；抗氧化物質(zhì)；抗氧化活性

酵素是一種功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品，通常以水果為原料，經(jīng)過一種或多種有益菌發(fā)酵，含有豐富的酶、維生素、礦物質(zhì)和次級代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)成分，具有抗衰老、抗菌消炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、修復(fù)機(jī)體損傷等功能[1]。在自然界中，酵母菌廣泛存在于各種水果的表面，因此，自然水果酵素逐漸成為近年來的研究熱點，如葡萄[2-3]、蘋果[4]、藍(lán)莓[5]等自然酵素；此外，還有木瓜[6]、冬棗[7]及火龍果[8]酵素。研究發(fā)現(xiàn)，不同水果酵素中起抗氧化作用的抗氧化物質(zhì)種類存在一定差異。葡萄、蘋果及藍(lán)莓自然酵素在發(fā)酵過程中抗氧化性能總體呈現(xiàn)上升趨勢，且抗氧化性與酚類物質(zhì)變化相關(guān)性較大[2-5]。冬棗酵素在發(fā)酵過程中羥自由基清除率和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力均不斷升高；黃酮含量發(fā)酵前后沒有顯著變化[7]?；瘕埞退鼐哂泻軓?qiáng)的超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基清除能力，酵素內(nèi)SOD活力為300 U/mL，并且也有一定的淀粉酶和脂肪酶的活性[8]。

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）是我國特有果樹資源，其果實富含維生素 C（VC）[9-10]、SOD[11]、類黃酮[12]、以及氨基酸[13]等多種營養(yǎng)物質(zhì)而具有極高的營養(yǎng)、保健和醫(yī)藥價值[14-16]，但刺梨酵素的相關(guān)研究尚未見報道。刺梨酵素為刺梨果實自然發(fā)酵后的代謝產(chǎn)物，研究其抗氧化物質(zhì)種類及含量、抗氧化性能以及兩者之間的相關(guān)性可為刺梨酵素產(chǎn)品的有效開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。同時，與其他大多數(shù)水果不同，由于刺梨果實中富含膳食纖維[17]，制作酵素后的刺梨果實烘干后還可制成蜜餞、果干等產(chǎn)品，因此，本研究將測定刺梨酵素及刺梨自然發(fā)酵后殘余果實的維生素C、總酚、類黃酮、類胡蘿卜素含量及SOD活力，同時采用超氧陰離子自由基體系、羥基自由基體系和DPPH·體系3種自由基體系分析刺梨自然發(fā)酵后抗氧化物質(zhì)含量與抗氧化活性，為進(jìn)一步闡明刺梨酵素及相關(guān)產(chǎn)品的保健功能機(jī)理和綜合性開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

刺梨：采自貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系刺梨種質(zhì)資源圃；冰糖（一級品）：市購。

α，α-二苯基-β-苦苯肼（DPPH）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸草酸（EDTA）、2，6 二氯酚靛酚、福林酚、碳酸鈉、乙醇、沒食子酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、蘆丁、鄰苯三酚、鹽酸、硫酸亞鐵、水楊酸等試劑均為分析純：賽蘭博科技有限公司；雙蒸水：貴州大學(xué)自制。

BS110S型電子天平：德國Sartorius公司；數(shù)顯pH儀、Sorvall Stratos冷凍高速離心機(jī)：美國Thermo公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲清洗器：中國昆山市超聲儀器有限公司；UV-2500紫外可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 刺梨酵素制作及自然發(fā)酵后殘留果實的前處理

于2016年9月從貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系刺梨種質(zhì)資源圃中選擇無病蟲害，整齊一致的刺梨成熟果實，采后立即運回實驗室。將刺梨去頭去尾、去籽去刺，切 4塊，與冰糖按不同質(zhì)量比（1∶1、2∶1、4∶1）配制，密封后讓其在黑暗條件下25℃自然發(fā)酵，3個月后得到刺梨酵素，同時將自然發(fā)酵后的殘留果實烘干研磨后過65目篩，并取2.5 g于50mL有蓋試管中，加入25mL含1%鹽酸的乙醇溶液，于30℃搖床（100 r/min）浸提2 h，過濾后定容至50mL，用于后續(xù)試驗。

1.2.2 維生素C的測定（2，6-二氯酚靛酚法）[18]

準(zhǔn)確量取1mL樣品，加入2%草酸溶液，定容至10mL，搖勻，備用。用已標(biāo)定的2，6二氯酚靛酚溶液滴定至出現(xiàn)微紅色且30 s內(nèi)不褪色為止，記下染料的用量。同時。以10mL 20 g/L草酸溶液作為空白，按同樣方法進(jìn)行滴定，重復(fù)3次。

式中：V為待測液總體積，mL；V1為樣品消耗體積，mL；V0為空白試劑消耗體積，mL；VS為滴定所取體積，mL；m為樣品質(zhì)量，mL；ρ為滴定液標(biāo)定體積，mL。

1.2.3 總酚的測定（Folin-Denis法）[19]

取1mL樣品于試管中，分別加入0.5mL福林酚，3mL 2%Na2CO3，室溫下避光2 h后，以80%乙醇為對照。用紫外分光光度計測定765 nm的吸光值，計算總酚含量，以mg/mL的沒食子酸為單位，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度y與吸光度x的回歸方程。按照上述方法制作，測其吸光值，并計算總酚含量，酵素樣品中的總酚以沒食子酸的含量（mg/mL）表示。

式中：C為沒食子酸的濃度，（mg/mL）；V為溶液體積；n為稀釋倍數(shù)；m為殘留果實樣品質(zhì)量。

1.2.4 類黃酮的測定（亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法）[12]

將1mL樣品置于10mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻后靜置6min；加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻后靜置6min；再加入4%氫氧化鈉溶液4mL，搖勻；最后用蒸餾水稀釋至刻度，靜置15min，以試劑空白為參比，510 nm下測定吸光值。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，以蘆丁濃度C（mg/mL）與其吸光值A(chǔ)的關(guān)系擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所測刺梨酵素樣品溶液類黃酮的含量。

式中：C為類黃酮濃度，（mg/mL）；V為提取液定容體積，mL；v為測定液體積，mL；m為被測殘留果實質(zhì)量，g。

1.2.5 類胡蘿卜素（比色法）[20]

取刺梨酵素（或刺梨發(fā)酵后殘留果實樣液）于440 nm比色測定吸光度，以蒸餾水為對照。

酵素中類胡蘿卜素含量/（mg/mL）=A×20；殘留果實樣液中類胡蘿卜素含量/（mg/100 g）=（A×20×V×100）/m

式中：A為吸光值；20為換算系數(shù)；V為提取液體積，L；m為被測殘留果實質(zhì)量，g。

1.2.6 SOD活性測定（鄰苯三酚自氧化法）[11]

在試管中按表l加入緩沖液和雙蒸水，于25℃恒溫20min后加入25℃預(yù)熱過的鄰苯三酚（對照管用10 mmol/L鹽酸代替），迅速搖勻，立即傾入比色杯中，在波長325 nm處每30 s測定一次吸光值A(chǔ)0。SOD活性測定法按下表1操作，加入鄰苯三酚前，先加入0.5mL的不同濃度的刺梨酵素，并減少同體積雙蒸水，其它操作均與上述相同，所測吸光值為ASOD。

表1 鄰苯三酚自氧化速率測定加樣表Table 1 Sample adding table of determining autoxidation rate of pyrogallic acid

式中：V1為反應(yīng)液總體積，mL；V2為測定樣品體積，mL；ΔA0為鄰苯三酚的自氧化速率；ΔASOD為樣品光密度值變化速率；n為稀釋倍數(shù)。

1.2.7 對超氧陰離子自由基（·O2－）清除作用的測定[8]

取0.05 mol/L pH8.2的 Tris-HCl緩沖液 4.5mL，置于25℃水浴中預(yù)熱20min，分別加入lmL不同濃度的酵素和0.4mL 25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5min，加入8 mol/L HCl l.0mL終止反應(yīng)，以Tris-HCl緩沖液作參比，在299 nm處測定吸光度，計算清除率。空白對照組以lmL試樣溶劑代替樣品。每個處理均做3個重復(fù)。

清除率的計算公式：

式中：A1為空白的吸光值；A2為樣品的吸光值。

1.2.8 對羥基自由基（·OH）清除作用的測定[8]

·OH由Fenton反應(yīng)產(chǎn)生，·OH氧化水楊酸產(chǎn)生對510 nm光有特征吸收的2，3-二羥基苯甲酸，通過測定水楊酸捕獲·OH所得到的產(chǎn)物確定·OH的清除率。在試管中加入2 mmol/L FeS043mL、1 mmol/L H2O23mL，搖勻，接著加入6 mmol/L水楊酸3mL，搖勻，于37℃水浴加熱15min后取出，測其吸光值A(chǔ)0。然后分別加入1mL不同濃度的樣液，搖勻，繼續(xù)水浴加熱15min，取出測其吸光值A(chǔ)X。計算酵素液對·OH清除率。

式中：A0為空白的吸光值；AX為樣品的吸光值。

1.2.9 對DPPH自由基清除作用的測定[8]

準(zhǔn)確稱取20 mgDPPH，用無水乙醇定容于250mL容量瓶中，得到濃度為20 mmol/L的DPPH溶液。取2mL樣液及2mL的20 mmol/LDPPH混勻后反應(yīng)30min，測定波長517 nm下吸光值的變化，對照溶劑用無水乙醇代替，按下式計算DPPH·清除率。

式中：Ai為DPPH液與樣液的吸光值；Aj為無水乙醇與樣液的吸光值；Ac為DPPH液與無水乙醇的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

在Microsoft Excel 2003中對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。采用DPSv7.05分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 刺梨自然發(fā)酵后酵素及殘留果實中抗氧化物質(zhì)含量

刺梨酵素抗氧化物質(zhì)含量見表2。

刺梨果實與冰糖比例為4∶1制作刺梨酵素時，類胡蘿卜素與類黃酮含量最高，分別為（166.73±7.39）mg/mL和（59.34±0.91）mg/mL，顯著高于果糖質(zhì)量比為 2∶1及1∶1的處理。而從VC、總酚和SOD酶活性來看，則果糖質(zhì)量比1∶1制作的刺梨酵素含量最高，分別為（1 519.31±4.92）mg/100mL、（60.65±0.78）mg/mL 和（8 571.43±0.0）U/mL，其中 VC含量是4∶1處理的 19倍，SOD酶活性是4∶1處理的5倍，SOD酶活性比火龍果酵素高出28倍[8]。刺梨自然發(fā)酵后殘留果實中抗氧化物質(zhì)含量見表3。

表2 刺梨酵素抗氧化物質(zhì)含量Table 2 The content of antioxidant substances in Rosa roxburghii natural ferment

表3 刺梨自然發(fā)酵后殘留果實中抗氧化物質(zhì)含量Table 3 The content of antioxidant substances in fruits after Rosa roxburghii natural fermentation

在刺梨自然發(fā)酵后殘留果實中沒有檢測到VC及SOD酶活性，類胡蘿卜素、類黃酮和總酚均以果糖質(zhì)量比 4 ∶1 處理為最高，分別為（32.05±0.02）mg/100 g、（13.55±0.05）mg/g 和（37.58±0.02）mg/g，其中類黃酮含量是1∶1處理的8倍。

2.2 刺梨自然發(fā)酵后酵素及殘留果實中抗氧化活性分析

刺梨酵素抗氧化活性見表4。

刺梨果實與冰糖比例為1∶1制作刺梨酵素時，·OH清除率與·O2-清除率最高，分別為78.69%和98.66%，顯著高于果糖質(zhì)量比為2∶1及4∶1的處理，其中·OH清除率約為2∶1及4∶1處理的3.5倍。3種果糖比處理對DPPH·清除率沒有顯著影響。刺梨自然發(fā)酵后殘留果實抗氧化活性見表5。

表4 刺梨酵素抗氧化活性Table 4 The antioxidant activity in Rosa roxburghii natural ferment

表5 刺梨自然發(fā)酵后殘留果實抗氧化活性Table 5 The antioxidant activity in fruits after Rosa roxburghii natural fermentation

在刺梨自然發(fā)酵后殘留果實中·OH清除率與DPPH·清除率均以果糖質(zhì)量比4∶1處理為最高，分別為62.42%和95.33%，而·O2-清除率則以果糖比2∶1顯著高于其它2個處理，為49.46%。

2.3 刺梨自然發(fā)酵后酵素及殘留果實中抗氧化物質(zhì)含量與抗氧化活性相關(guān)性分析

抗氧化能力的強(qiáng)弱由不同種類的抗氧化物質(zhì)所決定，酚類物質(zhì)是影響多數(shù)水果自然酵素抗氧化活性的重要抗氧化物質(zhì)[2-5]。刺梨酵素抗氧化物質(zhì)含量與抗氧化活性的相關(guān)性見表6。

表6 刺梨酵素抗氧化物質(zhì)含量與抗氧化活性的相關(guān)性Table 6 The correlation between antioxidant substances and antioxidant activity in Rosa roxburghii natural ferment

刺梨總酚與·OH清除率呈極顯著正相關(guān)（r=0.99，P＜0.01），與·O2－清除率呈顯著相關(guān)（r=0.75，P＜0.05），表明酚類物質(zhì)也是影響刺梨酵素抗氧化活性的重要物質(zhì)。此外，刺梨酵素中還存在另2種關(guān)鍵抗氧化物質(zhì)：VC和SOD，其中VC與·OH清除率呈極顯著正相關(guān)（r=1.00，P＜0.01），與·O2－清除率呈顯著相關(guān)（r=0.71，P＜0.05），而SOD與·OH 及·O2－清除率均呈極顯著正相關(guān)（r=0.86，P＜0.01；r=0.96，P＜0.01）。類胡蘿卜素與類黃酮在刺梨酵素中與·OH及·O2－清除率均呈極顯著負(fù)相關(guān)，這可能與本試驗設(shè)置的果糖比質(zhì)量比有關(guān)（表6）。類黃酮在水果酵素中的抗氧化能力不突出，這在冬棗酵素中也得到證實[7]。刺梨酵素中的DPPH·清除率始終維持在較高水平（96%左右），不與果糖質(zhì)量比及其中的各類抗氧化物質(zhì)顯現(xiàn)相關(guān)性。刺梨自然發(fā)酵后殘留果實中抗氧化物質(zhì)含量與抗氧化活性的相關(guān)性見表7。

表7 刺梨自然發(fā)酵后殘留果實中抗氧化物質(zhì)含量與抗氧化活性的相關(guān)性Table 7 The correlation between antioxidant substances and antioxidant activity in fruits after Rosa roxburghii natural fermentation

類胡蘿卜素、類黃酮和總酚均與·OH及DPPH·清除率均呈顯著到極顯著正相關(guān)，因此這3類物質(zhì)均是其重要的抗氧化物質(zhì)。且·OH及DPPH·清除率均與果糖比呈極顯著正相關(guān)，而·O2－清除率卻不與果糖比及類胡蘿卜素、類黃酮和總酚顯現(xiàn)相關(guān)性。

3 結(jié)論

刺梨果實與冰糖按 3種質(zhì)量比（1 ∶1，2∶1，4∶1）均能制作刺梨酵素。果糖質(zhì)量比1∶1制作的刺梨酵素中 VC、總酚、SOD 酶活性、·OH 清除率與·O2－清除率最高。果糖質(zhì)量比4∶1自然發(fā)酵后殘余果實中類胡蘿卜素、類黃酮、總酚、·OH清除率與DPPH·清除率最高。刺梨酵素中VC、總酚和SOD酶是主要抗氧化物質(zhì)，而刺梨自然發(fā)酵后殘余果實中重要抗氧化物質(zhì)則是類胡蘿卜素、類黃酮和總酚。

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Analysis in Content of Antioxidant Substances and Antioxidant Activity after Natural Fermentation of Rosa roxburghii Fruits

XIONG Qiao-yi，LIU Ding-qun，LUmin
（Guizhou University，Guiyang 550025，Guizhou，China）

Natural ferment of Rosa roxburghii was manufactured at three proportions（mass ratio，1 ∶1，2 ∶1，4 ∶1）between fruits and rock candy.The content of Vitamin C （VC），total phenol，flavonoid，carotenoid and superoxide dismutase（SOD）activity were determined in natural ferment and in fruits after Rosa roxburghii natural fermentation.The superoxide anion radical （·O2－），hydroxyl radical（·OH）and 1，1-，two phenyl，-2-hydrazine group free radical（DPPH·）systems were used to analyze antioxidant activity in vitro.And the correlation between the antioxidant substances and antioxidant activity was compared.The result showed that VC，total phe nol，SOD activity，·OH clearance and·O2－clearance were highest in natural ferment at a proper proportion（1 ∶1）between fruits and rock candy，reached to 1 519.31mg/100mL，60.65mg/mL，8 571.43 U/mL，78.69%and 98.66%respectively，in which VC，total phenol and SOD activity were significantly to very significantly positively correlated to·OH clearance and·O2－clearance.In addition，the total phenol，flavonoid，carotenoid，·OH clearance and DPPH·clearance were at tiptop in fruits after Rosa roxburghii natural fermentation at another proportion （4 ∶1）between fruits and rock candy.The values were severally 32.05mg/100 g，13.55mg/g，37.58mg/g，62.42%and 95.33%.And the total phenol，flavonoid and carotenoid were significantly to very significantly positively correlated to·OH clearance and DPPH·clearance.Whether in natural ferment or in fruits after Rosa roxburghii natural fermentation，very significantly positive correlation was always observed between total phenol and·OH clearance.

Rosa roxburghii；ferment；antioxidant substances；antioxidant activity

熊巧儀，劉丁群，魯敏.刺梨自然發(fā)酵后抗氧化物質(zhì)含量與抗氧化活性分析[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（1）：147-151

XIONGQiaoyi，LIUDingqun，LUMin.Analysis inContent ofAntioxidant Substances andAntioxidant Activity after Natural Fermentation of Rosa roxburghii Fruits[J].Food Research and Development，2018，39（1）：147-151

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.029

國家自然科學(xué)基金（31660558）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃訓(xùn)練項目（貴大國創(chuàng)字2016018）

熊巧儀（1995—），女（漢），在讀本科生，園藝專業(yè)。

*通信作者：魯敏（1984—），女（漢），副教授，博士，研究方向：果樹生理與分子生物學(xué)。

2017-06-08