微波提取無花果葉中的總黃酮及其體外抗氧化活性研究

崔鵬，陳志冉，史雷革

（1.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程系，河南開封475004；2.開封市綠色涂層材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南開封475004）

微波提取無花果葉中的總黃酮及其體外抗氧化活性研究

崔鵬1，2，陳志冉1，史雷革1

（1.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程系，河南開封475004；2.開封市綠色涂層材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南開封475004）

采用微波法提取無花果葉中的總黃酮，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取功率、提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響，并進(jìn)行四因素四水平正交試驗(yàn)，得到總黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，液料比55∶1（mL/g），提取功率200 W，提取時(shí)間3min，黃酮的含量為20.56mg/g；該提取物對DPPH自由基去除率達(dá)66.67%，羥基自由基去除率達(dá)30.49%，證明其具有較好的體外抗氧化能力。

無花果葉；正交試驗(yàn)；黃酮；抗氧化性

無花果為落葉灌木或喬木。分布在我國中部、西北部、南部諸省。無花果種植歷史悠久，有極高的營養(yǎng)價(jià)值，除果實(shí)外其葉藥用價(jià)值也很高。文獻(xiàn)詳述無花果葉的藥理性，其具有抗腫瘤、降血脂、降血糖、抗菌、抗病毒等[1]。無花果葉中含有黃酮類物質(zhì)、香豆類物質(zhì)、維生素C、氨基酸、蛋白質(zhì)等化學(xué)成分[2]。目前常見的黃酮類物質(zhì)提取方法有溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界CO2萃取法[3-4]。其中溶劑提取法時(shí)間長，操作繁瑣，不適用于規(guī)模生產(chǎn)；超聲波法耗時(shí)短，簡單易行，但容易形成超聲空白區(qū)影響提取效率[5-9]；超臨界CO2萃取法提取率高、提取物純度高，無污染，但其所需設(shè)備成本高，運(yùn)行成本昂貴；而微波法因耗時(shí)短，提取效率高，成本適中成為目前研究的熱點(diǎn)[10-13]。黃酮的測定方法常見的有三氯化鋁比色法和亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉分光光度法，前者因不能排除非黃酮類物質(zhì)的干擾存在局限性；后者穩(wěn)定性較高抗干擾能力強(qiáng)，是目前應(yīng)用廣泛的檢測方法[14-20]。因此，選擇微波輔助進(jìn)行提取，亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉分光光度法檢測黃酮的含量，并用正交試驗(yàn)對相應(yīng)試驗(yàn)條件進(jìn)行探討，為開發(fā)利用無花果葉提供部分參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無花果葉：市售；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：中國食品藥品檢定研究院；無水C2H5OH（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉（分析純）：天津登科化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁（分析純）：天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司；過氧化氫（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；硫酸亞鐵（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；水楊酸（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；1，1-二基-2-苦基肼自由基（DPPH）（分析純）：如吉生物科技。

1.2 儀器與設(shè)備

ISO9001超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)：南京先歐儀器制造有限公司；FA2004N電子分析天平：上海精密儀器有限公司；V-1200紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；101-1A電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

樣品：清洗，烘干，破碎，過200目篩，存于棕色瓶中備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.20mg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸量管吸取不同體積（mL）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于10mL的比色管，分別加入0.40 mL5%亞硝酸鈉溶液，0.40 mL10%硝酸鋁，搖勻放置5min后加入2.00 mL4%氫氧化鈉，并用濃度30%無水乙醇定容。在波長為505 nm條件下，以同樣濃度的乙醇作空白，測定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度C（mg/mL）和吸光度A為橫、縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：Y=1.6X-0.010 3，R2=0.999 3（n=6）。該標(biāo)準(zhǔn)曲線在 0～10mg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

1.3.3 總黃酮類物質(zhì)的提取

稱取1.000 0 g待測樣，加入不同體積分?jǐn)?shù)的提取液，選擇不同的液料比及提取溫度，提取時(shí)間后過濾轉(zhuǎn)移定容，得到黃酮提取液，低溫保存。

1.3.4 總黃酮類物質(zhì)提取率的計(jì)算

吸黃酮提取液0.20mL～10mL比色管，分別加入0.40 mL5%亞硝酸鈉溶液，0.40 mL10%硝酸鋁，搖勻放置5min后加入2.00 mL4%氫氧化鈉，并用濃度30%無水乙醇定容，測定吸光度。代入方程得黃酮類成分的含量。黃酮提取率的計(jì)算公式如下：

式中：ρ為黃酮類物質(zhì)提取率，mg/g；C為黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V為總黃酮提取液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 黃酮提取條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)條件，考察不同因素對無花果葉中黃酮提取率的影響，具體見表1。

表1 單因素試驗(yàn)條件Table 1 Experimental conditions of single-factor

1.3.6 優(yōu)化正交試驗(yàn)條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定提取液料比、微波功率、C2H5OH濃度、提取時(shí)間，設(shè)計(jì)四因素四水平正交試驗(yàn)，探索最佳試驗(yàn)參數(shù)。

1.3.7 無花果黃酮抗氧化性試驗(yàn)

以DPPH自由基和·OH自由基的去除率來考察無花果葉中黃酮的抗氧化性。

1.3.7.1 DPPH自由基的去除

配制濃度是0.2 g/L DPPH溶液，冷凍避光保存待用。取不同濃度樣品2mL，加入濃度為0.2mg/mL DPPH溶液，搖勻，避光反應(yīng)20min。以無水乙醇做參比，于515 nm測定吸光度。去除率公式為：

式中：Ai為DPPH溶液吸光度值；Ax為樣品液和DPPH溶液吸光度值；Ae為不含DPPH溶液時(shí)樣品液吸光度值。

1.3.7.2 ·OH的去除

參照賈之慎[21]等方法有部分改動(dòng)，采用水楊酸比色法測定羥基自由基去除率。取不同濃度梯度樣品1mL，加入2mL硫酸亞鐵，1.5mL水楊酸，再加入0.1mL過氧化氫啟動(dòng)反應(yīng)。以蒸餾水做參比，于510 nm測定吸光度。去除率公式為：

式中：A0為生成的羥基自由基溶液吸光度值；A1為樣品液和生成羥基自由基溶液吸光度值；A2為樣品液吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對無花果黃酮提取率的影響

稱取1.000 0 g待測樣，依據(jù)單因素試驗(yàn)條件序號Ⅰ進(jìn)行試驗(yàn)。測定、計(jì)算黃酮提取率見圖1。

圖1 乙醇濃度對無花果葉黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of concentration of ethanol on the extraction rate of flavonoids from Ficus carica leaves

由圖1可以看出，提取率隨乙醇濃度的增大逐漸提高，在乙醇濃度90%時(shí)提取率最高，確定此點(diǎn)為最佳乙醇濃度。

2.1.2 液料比對無花果黃酮提取率的影響

稱取1.000 0 g待測品，依據(jù)單因素試驗(yàn)條件序號Ⅱ進(jìn)行試驗(yàn)。測定、計(jì)算黃酮提取率見圖2。

圖2 液料比對無花果葉黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ratio of liquid to material on the extraction rate of flavonoids from Ficus carica leaves

由結(jié)果圖2可以看出，提取率隨液料比的升高逐漸增大并在55∶1（mL/g）時(shí)最高，繼續(xù)增加反而降低，分析原因可能是由于液料比增加使得待測物中黃酮類物質(zhì)濃度減少從而提取率降低造成。因此確定55∶1（mL/g）為最佳液料比。

2.1.3 微波時(shí)間對無花果黃酮提取率的影響

稱取1.000 0 g待測物，依據(jù)單因素試驗(yàn)條件序號Ⅲ進(jìn)行試驗(yàn)。測定、計(jì)算黃酮提取率見圖3。

圖3 微波時(shí)間對無花果葉黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of microwave time on the extraction rate of flavonoids in Ficus carica leaves

由結(jié)果圖3可以看出，提取率隨著微波時(shí)間增大而增大，在微波時(shí)間4min時(shí)最高，繼續(xù)增加提取率反而下降。由于微波時(shí)間較長時(shí)，乙醇被蒸干情況嚴(yán)重，導(dǎo)致提取率下降。

2.1.4 微波功率對無花果黃酮提取率的影響

稱取1.000 0 g待測品，依據(jù)單因素試驗(yàn)條件序號Ⅳ進(jìn)行試驗(yàn)。測定、計(jì)算黃酮提取率見圖4。

圖4 微波功率對無花果葉黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of microwave power on the extraction rate of flavonoids in Ficus carica leaves

由結(jié)果圖4可以看出，隨著提取時(shí)間的增加提取率逐漸增大，在微波功率400 W時(shí)最高，微波功率繼續(xù)增大提取率下降明顯，推測是由于提取溫度隨著提取功率的增大而升高，C2H5OH揮發(fā)的越快，從而影響試驗(yàn)效果，因此選擇400 W為最佳微波功率。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

為確定本試驗(yàn)的最佳條件，采用正交試驗(yàn)方法測定。稱取待測物1.000 0 g共16份，按照正交試驗(yàn)表2進(jìn)行試驗(yàn)。

表2 黃酮提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for flavonoids extraction conditions optimization

試驗(yàn)結(jié)果顯示，黃酮成分提取率受各因素的影響次序：C2H5OH濃度A＞液料比C＞微波功率D＞微波時(shí)間B。最佳方案是A3B1C3D1，即C2H5OH濃度90%，微波時(shí)間 3min，液料比 55 ∶1（mL/g），微波功率 200 W。該試驗(yàn)條件未在單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)中出現(xiàn)，進(jìn)一步對該方案進(jìn)行驗(yàn)證，依照上述試驗(yàn)條件重復(fù)提取5次進(jìn)行測定計(jì)算，結(jié)果如下：提取率分別是21.10%、20.98%、21.12%、20.93%、21.07%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.45%。平均值高于正交試驗(yàn)中的任一提取率，說明此方案可實(shí)施性較強(qiáng)。

2.3 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 DPPH自由基的去除試驗(yàn)

按照1.3.7.1步驟進(jìn)行DPPH自由基去除試驗(yàn)，并計(jì)算去除率見圖5。

圖5 無花果葉提取液濃度對DPPH自由基去除率影響Fig.5 DPPH radical scavenging activity of different extract concentrations from Ficus carica leaves

圖5顯示當(dāng)樣液濃度越大對DPPH自由基去除率越大，呈正相關(guān)，在7mg/mL時(shí)，對DPPH自由基去除率達(dá)到66.7%，樣液濃度在7mg/mL～10mg/mL時(shí)對DPPH自由基去除率相接近。無花果葉黃酮提取液具有一定的抗氧化性。

2.3.2 ·OH的去除試驗(yàn)

按照1.3.7.2步驟進(jìn)行·OH去除試驗(yàn)，并計(jì)算去除率見圖6。

圖6 無花果葉提取液濃度對·OH去除率的影響Fig.6·OH scavenging activity of different extract concentrations from Ficus carica leaves

圖6顯示當(dāng)樣液濃度增大，去除率也逐漸增大，在樣液濃度為8mg/mL時(shí)去除率達(dá)到最大30.49%，樣液濃度在8mg/mL～10mg/mL之間時(shí)·OH自由基去除率近似相等。

3 結(jié)論

1）本試驗(yàn)研究對象為無花果葉子，采用正交試驗(yàn)方法進(jìn)行，對無花果葉黃酮類成分的提取即含量測定進(jìn)行探討，確定最佳提取條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)中選取因素的主次關(guān)系為C2H5OH濃度＞液料比＞微波功率＞微波時(shí)間，最佳條件：C2H5OH濃度90%、微波時(shí)間3min、液料比 55 ∶1（mL/g）、微波功率 200 W，無花果葉中黃酮類物質(zhì)提取率為20.56mg/g。結(jié)果顯示無花果中黃酮類成分含量豐富。

2）進(jìn)行體外抗氧化性試驗(yàn)得出，無花果葉提取液對DPPH自由基去除率達(dá)66.67%，對·OH去除率達(dá)30.49%，證明無花果葉中黃酮類成分有較強(qiáng)的抗氧化能力，可以抑制癌細(xì)胞的增長、提高機(jī)體免疫能力，對細(xì)胞過氧化衰老有一定抑制作用。

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Microwave Extraction and Free Radical Scavenging Activity of Total Flavonoids from Ficus carica Leaves

CUI Peng1，2，CHEN Zhi-ran1，SHI Lei-ge1
（1.Department of Environment and Chemical Engineering，Yellow River Conservancy Technical Institute，Kaifeng 475004，Henan，China；2.Key Laboratory of Green Coating Materials of Kaifeng City，Kaifeng 475004，Henan，China）

Microwave-assisted flavonoids extraction from Ficus carica leaves and the best experimental conditions were studied.Total flavonoids were determined in Ficus carica leaves.The result showed that the optimal extraction condition as follows：alcohol concentration was 90%，material-water ratio was 55 ∶1mL/g，extraction power was 200 W，reflux time was 3min and the flavonoid extraction rate from Ficus carica leaves were 20.56mg/g.The extract showed that the DPPH clearance rate was 66.67%，the removal of·OH was 30.49%，it was proved that it had good anti-oxidative activity.

Ficus carica leaves；orthogonal experiment；flavonoids；antioxidative activity

崔鵬，陳志冉，史雷革.微波提取無花果葉中的總黃酮及其體外抗氧化活性研究[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（1）：41-45

CUI Peng，CHEN Zhiran，SHI Leige.Microwave Extraction and Free Radical Scavenging Activity of Total Flavonoids from Ficus carica Leaves[J].Food Research and Development，2018，39（1）：41-45

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.009

崔鵬（1977—），女（漢），講師，碩士，研究方向：化學(xué)化工、環(huán)境領(lǐng)域的教學(xué)與研究工作。

2017-09-08