紫包菜花色苷提取工藝及其對(duì)DPPH·清除活性研究

（江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院，江蘇南京211168）

紫包菜花色苷提取工藝及其對(duì)DPPH·清除活性研究

石雪萍，鄭萍

（江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院，江蘇南京211168）

以紫包菜為原料，采用乙醇水浴浸提法提取花色苷，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定從紫包菜中提取花色苷的工藝參數(shù)的適宜范圍，并進(jìn)一步通過(guò)正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝。紫包菜中花色苷的最佳工藝條件為：pH 1，提取溫度 50℃，料液比1∶40（g/mL），提取時(shí)間2.5 h，乙醇濃度60%。在這種提取條件下，花色苷得率可達(dá)到4.530mg/g。對(duì)提取的花色苷進(jìn)行DPPH·清除活性研究，結(jié)果表明，提取液花色苷含量越高，DPPH·的清除作用越大。

紫包菜；花色苷；提??；DPPH·

紫包菜又稱紫甘藍(lán)，是十字花科二年生植物，葉片紫紅，葉面有蠟粉，葉球近圓形。營(yíng)養(yǎng)豐富，尤其含有豐富的VC、VE和VB。作為彩色蔬菜，其中呈紫色的成分主要是花色苷，具有特定的藥理藥效功能，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥以及化妝品著色等領(lǐng)域，具有廣泛的開發(fā)應(yīng)用前景[1]。

近年來(lái)研究結(jié)果表明：顏色較深、較艷的蔬菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。因此，作為彩色蔬菜，紫甘藍(lán)的使用量增加，栽培面積亦逐步擴(kuò)大[2]?；ㄉ帐且活悘V泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等器官的細(xì)胞液中，從而使其呈現(xiàn)出紅色、藍(lán)色或紫色等顏色的天然的水溶性色素[3]?；ㄉ兆鳛橐环N天然食用色素，安全、無(wú)毒、資源豐富，而且具有一定營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。本試驗(yàn)研究紫包菜花色苷的最佳提取工藝和花色苷含量對(duì)DPPH·清除活性的影響，為紫包菜的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原材料及預(yù)處理

紫包菜：南京蘇果超市購(gòu)得。將紫包菜洗凈切碎，放入烘箱中于46℃下烘干，用粉碎機(jī)粉碎后放入自封袋中，將粉末置于干燥陰涼處待用。

1.2 儀器與試劑

721分光光度計(jì)：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵：河南省泰康科教儀器廠。

無(wú)水乙醇、鹽酸、冰乙酸、氯化鉀、醋酸鈉：均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總花色苷含量（ACY）的測(cè)定

采用pH示差法測(cè)定樣品中的花色苷含量[4]

吸取樣品制備液 1mL（0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl=25 ∶67，體積比）和 pH 4.5（0.2 mol/L NaAc·3H2O ∶0.2 mol/LHAc=1∶1，體積比）的緩沖液稀釋至 10mL，混勻。以1mL溶劑加9mL相應(yīng)緩沖液作空白，分別在510 nm和700 nm處測(cè)定吸光值。

花色苷含量按下式計(jì)算：

式中：DF為稀釋倍數(shù)；V為提取液總體積，mL；MW=449.2，為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量；29 600為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)；m為試樣的質(zhì)量，g；1是光路的路徑，cm；樣品含量以mg/g（矢車菊素-3-葡萄糖苷當(dāng)量）表示。

1.3.2 花色苷提取工藝優(yōu)化

由于不同的試驗(yàn)條件下花色苷的得率不同，因此，本次試驗(yàn)分別從pH值、乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、料液比5個(gè)方面進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以便找出花色苷得率最高的提取工藝。分析了各因素對(duì)紫包菜花色苷提取率的影響后，再對(duì)乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，分別準(zhǔn)確稱取樣品按紫包菜花色苷提取液的制備方法進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)[5]。

1.3.3 紫包菜花色苷對(duì)DPPH自由基抑制活性

1.3.3.1 溶液配制

DPPH溶液的配制：準(zhǔn)確稱取49.24mg的DPPH試劑，用95%乙醇溶解，定量轉(zhuǎn)入250mL的容量瓶中，用95%乙醇定容，搖勻得到濃度為0.5 mmol/L的DPPH溶液待用。

VC溶液的配制：稱取0.4 g的VC試劑，用蒸餾水溶解，定量轉(zhuǎn)入1 000mL的容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻得到濃度為0.4mg/mL的VC溶液；再用蒸餾水稀釋，分別得到濃度為 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10mg/mL 的 VC溶液。

樣液的配制：經(jīng)計(jì)算可知，驗(yàn)證試驗(yàn)所得提取液的濃度為0.10mg/mL，再用30%的乙醇液分別稀釋至濃度0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09mg/mL。

1.3.3.2 步驟

各取2mL不同濃度的樣液（或VC溶液）與2mL DPPH溶液及4mL 95%的乙醇溶液加入同一試管中，搖勻，在37℃下水浴30min，以95%乙醇溶液為參比，2mL的DPPH溶液＋6mL 95%的乙醇溶液為空白，在517 nm測(cè)定其吸光度，按下面公式計(jì)算其清除率。

式中：Ao為2mL DPPH溶液＋6mL 95%的乙醇溶液的吸光度；As為2mL DPPH溶液＋2mL樣液（或VC溶液）的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 pH值對(duì)紫包菜花色苷提取率的影響

稱取紫包菜5份，每份2 g于干燥的錐形瓶中。用70% 的乙醇和 HCl分別配制 pH 1、pH 2、pH 3、pH 4、pH 5的溶液，料液比為 1∶25（g/mL），放入 60℃ 水浴鍋中浸提2h，抽濾得到濾液。吸取樣液1mL，分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液稀釋至10mL，分別在510 nm和700 nm處測(cè)定吸光值[6]，結(jié)果見圖1。

圖1 不同pH值下花色苷的提取得率Fig.1 Extraction yield of anthocyanin under different pH values

由圖1可知，pH 1時(shí)紫包菜花色苷提取效率最高，花色苷提取液顏色為鮮艷紅色。隨著pH值的不斷提高，花色苷提取率逐步降低。樣液在pH 1.0緩沖溶液中的吸光值高于pH 4.5緩沖溶液中的吸光值。

2.1.2 溫度對(duì)紫包菜花色苷提取率的影響

稱取紫包菜5份，每份2 g于干燥的錐形瓶中。pH值為 1，乙醇濃度為 70%，料液比為 1 ∶25（g/mL），分別置于 40、50、60、70、80、90 ℃ 水浴鍋中，浸提 2 h，抽濾得到濾液。吸取樣液1mL，分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液稀釋至10mL，分別在510 nm和700 nm處測(cè)定吸光值，結(jié)果見圖2。

圖2 不同溫度下花色苷的提取得率Fig.2 Extraction yield of anthocyanin at different temperatures

由圖2可知，樣液在60℃左右時(shí)花色苷的提取率最高，不同溫度條件下，其提取率有所不同，提取率呈曲線。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)紫包菜花色苷提取率的影響

稱取紫包菜5份，每份2 g于干燥的錐形瓶中。pH值為 1，乙醇濃度為 70%，料液比為 1∶25（g/mL），置于 60 ℃ 水浴鍋中分別浸提 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 h，抽濾得到濾液。吸取樣液1mL，分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液稀釋至10mL，分別在510 nm和700 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算花色苷含量，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，不同時(shí)間下花色苷的提取率變化趨勢(shì)較為平緩，總體上呈緩慢上升的狀態(tài)；相同條件下，浸提3.5 h提取率最高。

2.1.4 乙醇濃度對(duì)紫包菜花色苷提取率的影響

圖3 不同時(shí)間下花色苷的提取得率Fig.3 Extraction yield of anthocyanin at different time

稱取紫包菜5份，每份2 g于干燥的錐形瓶中。分別加入 40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液50mL（料液比1∶25 g/mL），pH值為1，置于60℃水浴鍋中浸提2 h，抽濾得到濾液。吸取樣液1mL，分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液稀釋至10mL，分別在510 nm和700 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算花色苷含量，結(jié)果見圖4。

圖4 不同乙醇濃度下花色苷的提取率Fig.4 Extraction rate of anthocyanin under different ethanol concentration

由圖4可知，乙醇濃度為60%時(shí)花色苷提取率最高，當(dāng)濃度在80%以上時(shí)，提取率有明顯的下降趨勢(shì)，花色苷含量-乙醇濃度曲線有較為明顯的波動(dòng)；樣液在波長(zhǎng)510 nm處、pH 1.0緩沖溶液中的吸光值最高。

2.1.5 料液比對(duì)花色苷提取率的影響

稱取紫包菜5份，每份2 g于干燥的錐形瓶中。分別加入 20、30、50、60、70、80mL 的乙醇溶液 （70%），pH值為1，置于60℃水浴鍋中浸提2 h，抽濾得到濾液。吸取樣液1mL，分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液稀釋至10mL，分別在510 nm和700 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算花色苷含量，結(jié)果見圖5。

圖5 不同料液比下花色苷的提取率Fig.5 Extraction rate of anthocyanin at different material liquid ratio

由圖5可知，隨著料液比的升高，花色苷的含量逐步提高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶35（g/mL）時(shí)花色苷的提取率最高，料液比繼續(xù)升高，花色苷含量降低。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化紫包菜花色苷提取條件

分析了各因素對(duì)紫包菜花色苷提取率的影響后，再對(duì)乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，分別準(zhǔn)確稱取樣品按紫包菜花色苷提取液的制備方法進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)[5]，見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 Analysis of orthogonal test results

由表2可知，浸提液的料液比對(duì)花色苷提取的影響最大，其次是溫度和時(shí)間，乙醇濃度對(duì)花色苷提取的影響最小，最佳提取工藝組合為A1B3C3D1，即乙醇濃度為60%，料液比為1∶40（g/mL），提取溫度為50℃，提取時(shí)間為2.5 h。

按照此條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果得出，紫包菜花色苷含量可達(dá)到4.530mg/g，高于表2中任意一個(gè)組合，表明正交試驗(yàn)結(jié)果可行。

2.3 DPPH自由基清除試驗(yàn)結(jié)果

按照1.3.3.2試驗(yàn)步驟對(duì)所提取的紫包菜花色苷進(jìn)行DPPH自由基清除作用試驗(yàn)，結(jié)果見圖6。

圖6 不同樣液濃度下DPPH·的清除率Fig.6 Scavenging rate of DPPH·under the same liquid concentration

由圖6可明顯看出VC溶液的DPPH·清除率明顯高于樣品溶液。樣品溶液在濃度低于0.04mg/mL，花色苷對(duì)DPPH·清除沒(méi)有影響。濃度在高于0.04mg/mL時(shí)清除率開始上升，上升到0.09mg/mL時(shí)清除效果趨于平穩(wěn)。VC和花色苷均對(duì)DPPH·的清除有影響。濃度越高清除越明顯。當(dāng)濃度達(dá)到0.1mg/mL時(shí)，花色苷和VC對(duì)自由基的清除率接近。

3 結(jié)論

文章利用pH示差法測(cè)定紫包菜中花色苷的含量，并對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，紫包菜中花色苷最佳提取條件為：pH值為1，提取溫度50℃，料液比 1∶40（g/mL），提取時(shí)間 2.5 h，乙醇濃度 60%。在這種條件下，花色苷含量可達(dá)到4.530mg/g。DPPH自由基清除試驗(yàn)表明，紫包菜花色苷對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除作用，并隨著濃度的增加而增加。本試驗(yàn)表明紫包菜中的花色苷具有清除自由基的作用，為紫包菜中花色苷在不同領(lǐng)域的開發(fā)和研究提供了理論依據(jù)。

[1]尚宏麗,唐靜,孟鑫.紫甘藍(lán)花色苷提取及其穩(wěn)定性研究[J].食品工業(yè),2011(6):46-47

[2]王倩,汪云,宦衛(wèi)青,等.紫甘藍(lán)色素的提取及組分的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2010,22(6):1057-1060

[3]盧鈺,董現(xiàn)義,杜景平,等.花色苷研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,35(2):315-320

[4]宋德群,孟憲軍,王晨陽(yáng),等.藍(lán)莓花色苷的pH示差法測(cè)定[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,43(2):231-233

[5]朱洪梅,趙錳.紫甘薯花色苷的組分及抗氧化活性研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2009,29(1):39-45

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Study on the Extraction and DPPH·Scavenging Activities of Anthocyanin from Purple Cabbage

SHI Xue-ping，ZHENG Ping
（School of Engineering and Technology of Jiangsu Vocational Institute of Commerce，Nanjing 211168，Jiangsu，China）

The purple cabbage as raw material，the anthocyanin was extracted by ethanol water extraction method.The appropriate range of process parameters of the extraction of anthocyanin from purple cabbage was determined through single factor test，and then the best extraction process was determined by orthogonal test.The results showed that the optimum conditions of anthocyanins extraction from purple cabbage was pH=1，extraction temperature 50℃，material liquid ratio 1∶40 （g/mL），extraction time 2.5 h，ethanol concentration 60%.Under these conditions，the anthocyanin content could be up to 4.530mg/g.The DPPH·scavenging activity was also studied to research the scavenging ability of anthocyanins in purple cabbage.The results showed that the higher the content of anthocyanin in the extract，the bigger the scavenging effect of DPPH·.

purple cabbage；anthocyanin；extract；DPPH·

石雪萍，鄭萍.紫包菜花色苷提取工藝及其對(duì)DPPH·清除活性研究[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（1）：37-40

SHI Xueping，ZHENG Ping.Study on the Extraction and DPPH·Scavenging Activities of Anthocyanin from Purple Cabbage[J].Food Research and Development，2018，39（1）：37-40

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.008

石雪萍（1974—），女（漢），副研究員，博士，研究方向：功能成分研究與開發(fā)。

2016-07-27