黑加侖果渣提取物抗氧化活性研究

（牡丹江師范學(xué)院，黑龍江牡丹江157011）

黑加侖果渣提取物抗氧化活性研究

柴軍紅，何婷婷，金志民，王亞麗，邵鈺瑩

（牡丹江師范學(xué)院，黑龍江牡丹江157011）

以黑加侖果汁加工后的果渣為原料，通過微波-超聲輔助提取法提取果渣中多糖及水、醇萃取物；采用體外抗氧化體系研究果渣提取物超氧自由基、羥基自由基、DPPH自由基的清除能力，采用紅外對(duì)多糖進(jìn)行表征。結(jié)果表明：多糖為α-吡喃糖；多糖、醇提取物濃度在0.8mg/mL時(shí)DPPH自由基、羥基自由基清除率達(dá)到90%以上，水提取物達(dá)到80%以上；其多糖超氧自由基清除率達(dá)到60%以上；水、醇提取物超氧自由基在50%以上。所以，提取物具有顯著抗氧化活性，具有好的開發(fā)前景。

黑加侖果渣；果渣提取物；果渣多糖；抗氧化

黑加侖（Ribes nigrum L.），茶藨子科落葉直立灌木，別名：黑穗醋栗，黑果茶藨，黑豆等。野生分布于歐洲及亞洲，中國(guó)新疆為原產(chǎn)地之一，黑龍江、內(nèi)蒙古為主要栽培區(qū)域[1]。果實(shí)富含維生素C，原花青素、花青素、糖類和氨基酸[1]，有機(jī)酸等[2]，其果籽富含α-亞麻酸和γ-亞麻酸[3]。主要供制作飲料、果酒及果醬等[4-5]。國(guó)內(nèi)現(xiàn)有30多家企業(yè)，其產(chǎn)品以果汁飲料、果酒及蜜餞為主，以果汁生產(chǎn)為例，其年約產(chǎn)生200 t左右果渣[5]?，F(xiàn)階段果渣基本被丟棄或作為肥料，其資源浪費(fèi)比較嚴(yán)重。通過筆者對(duì)于其果渣初步成分研究結(jié)果表明：果渣脂肪酸加工前后變化很小，原花青素達(dá)到0.5%以上，多糖達(dá)到1.7%[6]，其具備潛在開發(fā)價(jià)值。為進(jìn)一步研究相關(guān)提取物活性價(jià)值，文章采用超聲-微波輔助提取法獲得提取物，并采用體外抗氧化手段對(duì)果渣水提物、醇提物及多糖進(jìn)行體外抗氧化等研究，以期為更進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

黑加侖果渣：黑龍江相關(guān)企業(yè)提供。

鹽酸（AR）：沈陽(yáng)試劑三廠；Tris（AR）、果膠酶（80 u/mg）：北京索萊寶科技有限公司；DPPH（BR）：Sigma；鄰苯三酚（AR）：天津博迪化工股份有限公司；鄰二氮雜菲（AR）：沈陽(yáng)科拓化工有限公司；硫酸亞鐵（AR）：天津博迪化工股份有限公司；硫酸鐵銨（AR）：天津科密歐化學(xué)試劑廠；雙氧水（AR）：哈爾濱試劑廠；無水乙醇（AR）：天津進(jìn)豐化工有限公司；L-抗壞血酸（AR）：天津永大化工有限公司；溴化鉀（AR）：山東濟(jì)寧佰一化工有限公司。

1.2 主要儀器

Frontier紅外光譜儀：美國(guó)珀金埃爾默股份有限公司；T6紫外可見分光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BSA224S-CW電子天平：德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI；SL-2010N超聲波萃取裝置：南京順流設(shè)備有限公司；NJL07-3型實(shí)驗(yàn)專用微波爐：南京杰全微波設(shè)備有限公司；FD-1冷凍真空干燥機(jī)：北京博醫(yī)康技術(shù)公司；PB-10酸度計(jì)：德國(guó)賽多利斯集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 果渣成分提取工藝流程

果渣成分提取工藝流程見圖1。

圖1 提取工藝流程Fig.1 The extracting processes

1.3.2 果渣水、醇成分提取

采用微波-超聲波復(fù)合法[7]提取相關(guān)活性物質(zhì)，具體如下：取干燥果渣，粉碎，過20目篩，精確稱取100 g，以蒸餾水（或50%～80%乙醇）為提取劑，果渣水提物固液比為：1 ∶20（g/mL），微波功率 300 W 下，微波提取5min；冷卻室溫后轉(zhuǎn)入超聲提取器中，超聲參數(shù)如下：超聲功率30 kW，提取溫度20℃，提取時(shí)間30min，提取2次，合并濾液并濃縮至原體積1/8或1/5（醇提取物），所得提取物低溫冰箱-70℃預(yù)凍后，冷凍干燥、備用。

1.3.3 果渣多糖提取

[7-8]，略有改動(dòng)。取自然陰干（控制水含量在3%以內(nèi)）果渣，粉碎過20目篩，精確取200 g左右，以蒸餾水為提取劑，固液比 1∶15（g/mL）、pH 值在6～7、以果渣計(jì)算，加入0.5%果膠酶，37℃下酶促2 h，微波處理2min滅活；功率30 kW下、溫度20℃～25℃，再超聲處理50min，提取2次，提取液濃縮至原體積1/8，加無水乙醇至濃度60%以上，常溫靜置6 h、4 000 r/min離心10min、Sevag法除蛋白、透析、凍干備用。

1.3.4 果渣提取物抗氧化研究

樣品液制備：分別稱取0.25 g的水、醇提取物及多糖，用少量煮沸的蒸餾水不斷攪拌使提取物溶解，配制成1mg/mL的提取物溶液作為母液。用母液分別配制 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL 的提取物溶液。

1.3.4.1 超氧自由基清除能力測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化測(cè)定超氧自由基清除能力[8-9]：在室溫下，以pH8.2Tris-HCl緩沖體系進(jìn)行自氧化研究，以10 mmol/L HCl溶液配制空白管為參比，在325 nm下，每隔0.5min測(cè)一次吸光度，自氧化速率（OD值）控制在0.060min～0.065min，測(cè)定3.5min計(jì)算結(jié)果。

樣品測(cè)定：加不同濃度待測(cè)樣品10 μL，同上操作，搖勻，立即測(cè)定，空白同上。

式中：A1（自氧化）為自氧化時(shí)吸光度隨時(shí)間變化；A2（樣品）為加入樣品液后吸光度隨時(shí)間變化。

1.3.4.2 羥基自由基清除能力測(cè)定

采用鄰二氮菲-FeSO4-H2O2體系研究羥基自由基清除能力[10-11]，在510 nm處測(cè)定其吸光度。重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

式中：A1為只加樣品和空白溶液的吸光度；A2為加H2O2溶液和樣品溶液的空白溶液吸光度；A3為不加H2O2和樣品的空白溶液的吸光度；A4為只加H2O2溶液和空白溶液的吸光度。

1.3.4.3 DPPH自由基清除能力測(cè)定

依據(jù)文獻(xiàn)[12-13]方法，略有改動(dòng)，在試管中依次加入2.5mL DPPH溶液和1.5 mL95%乙醇，總體積為4mL，記為D0；加入2.5mL DPPH溶液和1.5mL待測(cè)樣品溶液，測(cè)定值為D1；加入2.5mL 95%乙醇和1.5mL待測(cè)樣品溶液，測(cè)定值記為D2。溶液混勻在黑暗條件下反應(yīng)20min，在525 nm下測(cè)定其吸光度。重復(fù)3次。

1.3.5 多糖紅外表征

采用溴化鉀壓片法對(duì)多糖進(jìn)行紅外表征。

1.3.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

采用Excel2010計(jì)算數(shù)據(jù)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，Origin7.5制作相關(guān)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 果渣提取物抗氧化研究

黑加侖果渣提取物中含花色苷、多糖、維生素C等，為了進(jìn)一步研究并討論其不同提取物可能抗氧化價(jià)值，通過與維生素C抗氧化比較可以清晰確定相對(duì)抗氧化活性，為進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

2.1.1 提取物對(duì)超氧自由基的清除作用

提取物對(duì)超氧自由基的清除作用見圖2。

圖2 提取物對(duì)超氧自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effects of the extract on superoxide radical

依據(jù)圖2結(jié)果，明顯水提取物對(duì)于超氧自由基去除能力較弱，濃度在0.6mg/mL時(shí)可達(dá)到40%左右，多糖清除能力相對(duì)較好達(dá)到45%以上，醇提物達(dá)到以上53%，隨著濃度進(jìn)一步增大，多糖去除能力逐步加強(qiáng)，醇提物趨于平衡。這可能是粗多糖中含有少量花色苷、原花青素疊加的結(jié)果。水提物主要糖、花青素、花色苷、蛋白質(zhì)、果膠等。由于非還原糖、蛋白質(zhì)、果膠超氧自由基去除能力較差，所以相對(duì)沒有多糖明顯。醇提物可能涉及萜、甾類、核苷類、部分色素、樹脂等成分，其清除能力可能相對(duì)較差。

2.1.2 提取物對(duì)羥基自由基的清除作用

提取物對(duì)羥基自由基的清除作用見圖3。

圖3 提取物對(duì)羥基自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effects of the extract on hydroxyl radical

依據(jù)圖3結(jié)果，以上提取物均表現(xiàn)良好羥基自由基的清除作用，當(dāng)濃度0.20mg/mL就達(dá)到70%以上，在低濃度下，其抗氧化作用強(qiáng)于維生素C，在0.60mg/mL以上提取物抗氧化能力基本趨于平衡。由于羥基自由基與人體衰老有一定關(guān)系，所以果渣具備開發(fā)抗衰老相關(guān)產(chǎn)品潛質(zhì)[14]。

2.1.3 提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用

提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用見圖4。

圖4 提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effects of the extract on DPPH radical

通過研究其果渣提取物，發(fā)現(xiàn)其多糖在較低濃度是具有顯著的清除自由基作用，尤其對(duì)于DPPH自由基及羥基自由基，當(dāng)其濃度在0.60mg/mL時(shí)就達(dá)到87%以上，同濃度下其水提取、醇提物也顯示明顯清除能力。尤其水提取物（含有多糖），以上自由基清除率均較顯著。但是由于含有其他物質(zhì)（諸如：蛋白、花青素、果膠等），所以凍干后較為粘稠，深加工需要添加賦形劑才可獲得較好粉末產(chǎn)品。以上提取對(duì)于超氧自由基清除能力表現(xiàn)一般，多糖在0.80mg/mL時(shí)，達(dá)到60%清除率，而醇提物、水提物均在50%左右，這可能與熱提取工藝有一定關(guān)聯(lián)，加工過程高溫消耗部分抗氧化能力。通過與維生素C陽(yáng)性對(duì)照比較發(fā)現(xiàn)，其羥基自由基清除具有顯著優(yōu)勢(shì)，尤其多糖較為顯著。

2.2 多糖紅外表征結(jié)果

多糖紅外表征結(jié)果見圖5。

圖5 多糖紅外表征結(jié)果Fig.5 The infrared signature of polysaccharides

由圖5可知，在3 443.3 cm-1處有型寬而鈍的峰，可知為多糖O-H伸縮振動(dòng)峰，且為羥基之間締合結(jié)果；2 928.5 cm-1為糖類C-H伸縮振動(dòng)峰；其中1 646.2 cm-1有弱的吸收為-CHO的C=O伸縮振動(dòng)峰，可能為肽鍵酰胺羰基峰，說明此多糖可能含有蛋白殘基；778.23、921.89 cm-1為吡喃糖特征吸收之一[15-16]，進(jìn)一步在 1 103.5、1 021.7、1 077.5 cm-1有 3個(gè)強(qiáng)吸收峰證明為吡喃糖苷特征吸收。在832 cm-1～840 cm-1范圍內(nèi)有吸收這屬于α-吡喃糖苷鍵的特征吸收[17]，所以為α-吡喃糖。

3 結(jié)論

多糖紅外表征顯示其為α-吡喃糖，可能含有蛋白殘基，屬于蛋白糖，同時(shí)其具有好的抗氧化能力，所以有必要進(jìn)一步開展相結(jié)構(gòu)及其他活性篩選研究。利用體外抗氧化模型討論了果渣水提取物、醇提取物、多糖的抗氧化性，其結(jié)果表明：以上物質(zhì)均具有一定抗氧化能力，其中在羥基自由基清除方面顯示了良好的性能，接近或超過維生素C活性，當(dāng)濃度0.20mg/mL就達(dá)到74%～83%，在低濃度下，其抗氧化作用強(qiáng)于維生素C，在0.60mg/mL以上提取物抗氧化能力基本趨于平衡抗氧化活性在92%～94%，其DPPH自由基清除也顯示良好活性，在0.8mg/mL濃度下可以達(dá)到94%～97.74%；超氧自由基方面多糖活性最高在1mg/mL濃度下可以達(dá)到74.4%，其余提取物在53%～60%之間。因此，果渣提取物具有進(jìn)一步開發(fā)的價(jià)值。

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Study on Antioxidant Activity of Blackcurrant Marc Extract

CHAI Jun-hong ，HE Ting-ting，JIN Zhi-min，WANG Ya-li，SHAO Yu-ying
（Mudanjiang Normal University，Mudanjiang 157011，Heilongjiang，China）

The blackcurrant fruit as the raw material，polysaccharide and the extract of water and alcohol were extracted by microwave-ultrasonic assisted extraction.The polysaccharides were characterized by IR.In vitro antioxidant systems；the antioxidant activity of extract on blackcurrant's marc was discussed.Such as：superoxide radical，hydroxyl radical，DPPH.The results showed that：the infrared signature showed that polysaccharide was α-pyranos.The polysaccharide or alcohol extract concentration was 0.8mg/mL，the scavenging rate of DPPH radical and hydroxyl radical was more than 90%，the extract of water was more than 80%.The polysac－charide scavenging rate of superoxide radicals was 60%，the extract of water and alcohol was more than 50%.As a result，there was significant antioxidant activity about the extractions and the development of the blackcurrant's marc has a bright future.

blackcurrant marc；pomace extract；pomace polysaccharide；antioxidant activity

柴軍紅，何婷婷，金志民，等.黑加侖果渣提取物抗氧化活性研究[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（1）：16-20

CHAI Junhong，HE Tingting，JIN Zhimin，et al.Study on Antioxidant Activity of Blackcurrant Marc Extract[J].Food Research and Development，2018，39（1）：16-20

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.004

牡丹江師范學(xué)院國(guó)家級(jí)課題培育項(xiàng)目（GP201609）；牡丹江師范學(xué)院國(guó)家級(jí)課題培育項(xiàng)目（GY201307）；牡丹江市科技局攻關(guān)項(xiàng)目（G2014d1509）；牡丹江市科技局攻關(guān)項(xiàng)目（G2015k1960）

柴軍紅（1982—），男（漢），講師，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物檢測(cè)分析及應(yīng)用研究。

2017-06-16