過表達SecS對H2O2誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細胞氧化損傷的保護性作用①

呂思勉，欒卓誠，孫晗嫣，孫晗然，葛堂棟

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

過表達SecS對H2O2誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細胞氧化損傷的保護性作用①

呂思勉，欒卓誠，孫晗嫣，孫晗然，葛堂棟

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：探討SecS在H2O2誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細胞氧化損傷中的保護性作用。方法：根據(jù)轉(zhuǎn)染及H2O2處理情況將H9c2心肌細胞分為4組：正常對照組，SecS過表達組，H2O2處理組和SecS過表達+H2O2處理組。MTT法檢測各組細胞存活率，酶標儀檢測SOD活性和MDA水平。結(jié)果：與正常對照組比， H2O2處理組細胞存活率明顯下降(P<0.01)，SOD活性明顯降低(P<0.05)，MDA水平明顯升高(P<0.01)；與H2O2處理組相比，SecS+H2O2組細胞存活率明顯上升(P<0.05)，SOD活性明顯上升(P<0.05)，MDA水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)論：過表達SecS能夠?qū)笻2O2引起的心肌細胞損傷，提高大鼠H9c2心肌細胞抗氧化能力，對心肌細胞氧化損傷有一定的保護作用。

SecS；氧化應(yīng)激；心肌細胞

氧化應(yīng)激與缺氧再灌注損傷等引起的心肌損傷密切相關(guān)，伴隨應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧或氧自由基是導(dǎo)致心肌細胞凋亡的重要原因[1]。硒是人體和動物維持生命所必需的微量元素之一，在機體內(nèi)主要發(fā)揮抗氧化作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，缺硒能夠引起心肌細胞氧化損傷和凋亡，但致病機制仍不清楚。硒在體內(nèi)主要以硒代半胱氨酸的形式進入硒蛋白而發(fā)揮作用。目前，人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)25種硒蛋白。這些硒蛋白主要包括谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidases，GPxs)類、硫氧還蛋白還原酶類(thioredoxin reductases，Txnrds)以及脫碘酶類(iodothyronine deiodinases，Dios)[3]。在人體內(nèi)，硒代半胱氨酸的合成需要三個步驟，其中最后一步反應(yīng)由SecS酶(O-phosphoseryl-tRNA:selenocysteinyl-tRNA synthase，SecS)催化[4]。SecS又稱為SEPSECS，以磷酸吡多醛為輔酶，主要存在于肝臟、肺、腎臟以及心臟等部位，其它組織中也有少量表達。研究發(fā)現(xiàn)，SecS編碼基因突變能夠?qū)е逻M行性腦萎縮(Progressive cerebellocerebral atrophy，PCCA)或克羅恩病(Crohn’s Disease，CD)顯示SecS基因變異可能與腦部及腸道炎性疾病關(guān)系密切[5, 6]。但是，SecS酶是否在心肌細胞中發(fā)揮重要作用尚無報道。本研究通過在大鼠H9c2細胞中過表達SecS并檢測各組細胞存活率、抗氧化能力以及脂質(zhì)過氧化水平，以觀察其對H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞氧化損傷的保護性作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大鼠H9C2 細胞株購于中國科學(xué)院上海細胞庫。SecS過表達載及LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑體購自Invitrogen公司，SecS抗體購于Proteintech公司，MTT檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司，SOD和MDA檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

大鼠H9c2細胞接種于含有適量DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，置于37℃，含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)，每隔2d以1:3比例傳代。

1.2.2 轉(zhuǎn)染與分組

提前一天將細胞以5×105的接種量接種于六孔板，培養(yǎng)24h后，利用LipofectamineTM 2000將pCDNA3.1-SecS及pCDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染到H9c2細胞，培養(yǎng)48h后，加入400μmol/L的H2O2繼續(xù)培養(yǎng)12h。根據(jù)轉(zhuǎn)染及H2O2處理情況將H9c2細胞分為4組：正常對照組(NC)，SecS過表達組(SecS)，H2O2處理組(NC+H2O2)，SecS過表達+H2O2處理組(SecS+H2O2)。

1.2.3 Western blot印跡檢測

提取H2O2處理后的各組細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量，取蛋白樣品40μg，SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂奶粉封閉2h，SecS抗體(1:1000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，辣根過氧化物酶標記的二抗(1:10000稀釋)室溫孵育2 h，凝膠成像系統(tǒng)成像。以GAPDH為內(nèi)參，分析目的蛋白表達水平。

1.2.4 MTT法檢測H9c2細胞存活率

將各組細胞接種于96孔板，經(jīng)H2O2處理12h后，加入20μL MTT(終濃度為5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄掉上清液，加入150μL二甲基亞砜，震蕩溶解結(jié)晶物，用酶標儀檢測560 nm處的吸光度值。

1.2.5 SOD和MDA檢測

SOD活性和MDA水平檢測按照試劑盒說明書進行。其中，SOD測定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA水平檢測以硫代巴比妥酸為底物，酶標儀分別檢測532nm和450nm處吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用方差分析，各組兩兩比較用LSD檢驗。P<0.05為差異顯著有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染前后H9c2心肌細胞SecS蛋白表達水平檢測

將pCDNA3.1- SecS過表達載體轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞，同時轉(zhuǎn)染空載體最為對照。結(jié)果顯示，與空白對照組(NC)以及空載體組(vector)相比，轉(zhuǎn)染pCDNA3.1- SecS組SecS蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，顯示載體構(gòu)建成功。見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染前后H9c2心肌細胞SecS蛋白表達水平*P<0.01

2.2 過表達SecS對H9c2心肌細胞存活率的影響

與正常對照組相比，過表達SecS后心肌細胞存活率無明顯變化；加入400μmol/L的H2O2作用12h后，細胞存活率明顯下降(P<0.01)；與H2O2處理組相比，過表達SecS組細胞存活率由58.30%±0.56%上升至77.23%±0.63%(P<0.05)，顯示過表達SecS能夠顯著提高氧化損傷后的H9c2心肌細胞存活率。見圖2。

圖2 過表達SecS對H9c2心肌細胞存活率的影響

**P<0.01；#P<0.05。

2.3 過表達SecS對H9c2心肌細胞SOD活性的影響

與正常對照組相比，過表達SecS后心肌細胞SOD活性無明顯變化；經(jīng)400μmol/L的H2O2處理12h后，SOD水平降至空白對照組的55.57%(P<0.05)；與H2O2處理組相比，過表達SecS組心肌細胞SOD活性明顯(P<0.05)。結(jié)果顯示，過表達SecS能夠明顯提高H9c2心肌細胞主要抗氧化酶活性，增強細胞抗氧化能力。見圖3。

圖3 過表達SecS對H9c2心肌細胞SOD活性的影響

*P<0.05；#P<0.05。

2.4 過表達SecS對H9c2心肌細胞MDA水平的影響

與正常對照組相比，過表達SecS后H9c2心肌細胞MDA水平無明顯變化；經(jīng)400μmol/L的H2O2處理12h后，MDA水平升高3.39倍(P<0.01)；與H2O2處理組相比，過表達SecS組H9c2心肌細胞MDA水平顯著下降(P< 0.05)。結(jié)果顯示，過表達SecS能夠降低氧化損傷后心肌細胞應(yīng)激水平。見圖4。

圖4 過表達SecS對H9c2心肌細胞MDA水平的影響

**P<0.01；#P<0.05。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，過量氧自由基或活性氧(reactive oxygen species，ROS)導(dǎo)致的氧化應(yīng)激水平升高與很多心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程關(guān)系密切，如心肌肥大、心衰、心梗以及缺血再灌注損傷[7]。氧自由基主要由線粒體產(chǎn)生，就心臟而言，線粒體約占30%，因此心臟極易產(chǎn)生氧化損傷。氧化應(yīng)激極易導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，隨著脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加劇，氧化產(chǎn)物丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平隨之增高[8]。MDA含量是脂質(zhì)過氧化的一個常用指標，能夠反映細胞膜脂過氧化的程度。為降低氧化損傷程度，線粒體內(nèi)進化出一套完整的抗氧化體統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、NADH、谷胱甘肽過氧化物酶等。SOD活力能夠間接反應(yīng)細胞清除活性氧的能力，是判斷細胞抗氧化能力的一個常用指標。

硒是人體所必需的微量元素之一，通常以硒代半胱氨酸的形式進入硒蛋白而發(fā)揮作用，其中以谷胱甘肽過氧化物酶抗氧化作用最為明顯。目前，硒對心肌細胞的保護性機制仍不清楚。本研究通過過表達硒蛋白合成路線上游的關(guān)鍵酶SecS，觀察其在H2O2誘導(dǎo)的大鼠H9c2心肌細胞氧化損傷中的保護性作用。結(jié)果顯示，過表達SecS能夠增加H2O2引起的H9c2心肌細胞存活率，提高以SOD為代表的抗氧化酶活性，降低細胞脂質(zhì)過氧化水平，顯示SecS酶在心肌細胞氧化損傷時發(fā)揮重要作用。因此，進一步研究硒蛋白合成過程中的關(guān)鍵因子與心臟功能的關(guān)系，闡明硒缺乏引起心肌細胞氧化損傷的分子機制，仍是我們亟待解決的問題。

[1]Wojtovich AP, Foster TH. Optogenetic control of ROS production[J]. Redox Biol，2014, 3(2): 368-376

[2]Brown KM, Arthur JR. Selenium, selenoproteins and human health[J]. Public Health Nutr，2001, 4(2): 593-599

[3]Frederick P, BELLINGER I, Arjun V, et al. BERRY Regulation and function of selenoproteins in human disease[J]. Biochem J，2009, 422(1):11-22

[4]Turanov AA, Xu XM, Carlson BA, et al. Biosynthesis of selenocysteine, the 21st amino acid in the genetic code, and a novel pathway for cysteine biosynthesis[J]. Adv Nutr,2011, 2(2):122-128

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[8]蔡綱, 黃平, 李紹民. 翻白草對CCl4所致慢性肝損傷大鼠肝組織中SOD、MDA、GSH水平的影響[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2016, 39(1):33-36

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目，編號：201610222032。

呂思勉(1996 ～)女，黑龍江佳木斯人，在讀本科生。

葛堂棟(1979 ～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，講師。E-mail: getangdong@163.com。

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1008-0104(2017)06-0114-02

2017-09-13)