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    雙甘膦降解菌的篩選與降解性能

    2018-01-02 11:55:50封雍婕鄭鑫楊福民杜麗琨邱雪琳秦玥夏烈文
    科學(xué)與財(cái)富 2018年33期
    關(guān)鍵詞:磷酸鹽

    封雍婕 鄭鑫 楊福民 杜麗琨 邱雪琳 秦玥 夏烈文

    摘 要:利用預(yù)先堆肥的方式富集耐受雙甘膦微生物,進(jìn)而篩選出能降解雙甘膦的細(xì)菌并研究其降解效果,為處理含雙甘膦廢棄物提供依據(jù)。結(jié)果表明,篩選得到的微生物具有降解雙甘膦能力,降解產(chǎn)物主要為無(wú)機(jī)磷酸鹽。

    關(guān)鍵詞:雙甘膦; 降膦菌;磷酸鹽

    1引言:

    雙甘膦是廣泛使用的草甘膦除草劑IDA法生產(chǎn)過(guò)程中的中間體。雙甘膦生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的含雙甘膦廢棄物是草甘膦行業(yè)環(huán)保問(wèn)題的重要關(guān)注內(nèi)容,目前主要采用物化方法進(jìn)行處理。物化方法往往工藝條件苛刻、成要高昂、容易產(chǎn)生二次污染。微生物方法是廢水處理的常用手段,具有條件溫和、成要低廉的優(yōu)勢(shì)。研究微生物降解雙甘膦性能,對(duì)探索生化法處理雙甘膦廢水可能性具有重要意義。

    2實(shí)驗(yàn)部分:

    2.1材料

    雙甘膦(含量≥98%)取自草甘膦企業(yè)生產(chǎn)車(chē)間,菌種來(lái)源為城市下水道泥與景觀闊葉林落葉、果皮、雙甘膦混合物長(zhǎng)期培養(yǎng)所得土樣。

    培養(yǎng)基的配制。

    基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基:稱取2.00g (NH4)2SO4、0.20g MgSO4·7H2O、0.60g NaH2PO4·2H2O、0.65g K2HPO4·3H2O、0.64g CaCl2、3.00g雙甘膦加水?dāng)嚢枞芙猓{(diào)節(jié)pH 7。121℃滅菌20分鐘后備用。得到含磷源基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基,同樣方法,但以NaCl和KCl代替NaH2PO4·2H2O和g K2HPO4·3H2O,得到不含磷源基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基。

    平板固體培養(yǎng)基:

    基礎(chǔ)鹽平板固體培養(yǎng)基:按含磷基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基比例加入無(wú)機(jī)鹽和水,溶解扣按2%wt加入瓊脂粉,加熱攪拌使其溶解,定容至1000mL。

    牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:稱取3g牛肉膏、10g蛋白胨、15gNaCl、20g瓊脂粉加水?dāng)嚢枞芙?,調(diào)節(jié)pH 7,定容至1000mL。

    培養(yǎng)基在高壓蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌20分鐘,冷卻至50℃左右,無(wú)菌條件下倒入培養(yǎng)皿中,完全凝固并冷卻后分別得到基礎(chǔ)鹽平板固體培養(yǎng)基和牛肉蛋白胨平板固體培養(yǎng)基。

    2.2實(shí)驗(yàn)方法

    微生物的采集、富集培養(yǎng)與馴化。

    稱取10g土樣,加50mL水?dāng)嚢杈鶆颍胖脦仔r(shí)后取上清液用無(wú)菌水稀釋后作為原始菌種。用移液槍移取稀釋度10-1~10-5的菌液0.2mL至基礎(chǔ)鹽平板固體培養(yǎng)基上并涂布均勻,倒置,35℃恒溫培養(yǎng)72h。

    無(wú)菌條件下,用接種環(huán)從上述平板培養(yǎng)基中挑取一個(gè)單菌落利用平板劃線法接種于同種基礎(chǔ)鹽平板固體培養(yǎng)基,恒溫培養(yǎng)對(duì)菌落進(jìn)行一次純化。反復(fù)純化兩次,得到一株生長(zhǎng)形態(tài)均勻的菌株R,并用基礎(chǔ)鹽平板固體培養(yǎng)基斜面劃線保存?zhèn)溆?。挑取單個(gè)菌落并用平板劃線法接種于牛肉膏蛋白胨平板固體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增。

    降解菌對(duì)雙甘膦的降解性能測(cè)定。

    3結(jié)果與討論

    3.1雙甘膦降解菌的生長(zhǎng)狀況

    土樣中部分微生物具有雙甘膦耐受性。微生物篩選過(guò)程中在平板固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況如圖1所示。菌株為灰白色、菌落較小、干燥、呈扁平狀、邊緣不整齊圓形等。篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn),稀釋梯度為10-3的原始菌種在基礎(chǔ)鹽平板固體培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的微生物適合微生物篩選。

    3.2 培養(yǎng)液中雙甘膦的變化

    篩選得到的菌種在含3g/L雙甘膦的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中對(duì)雙甘膦的降解情況如圖2所示。在最初三天內(nèi)雙甘膦降解很快,三天過(guò)后雙甘膦降解率緩慢增加。這是因?yàn)榕囵B(yǎng)前3d該菌種R生長(zhǎng)情況達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,在該段時(shí)間內(nèi)菌種R對(duì)碳源需求較大,使雙甘膦的降解效率達(dá)到了近30%。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),菌株R處于穩(wěn)定期并逐漸衰亡,故第3~9d降解率增長(zhǎng)較慢。培養(yǎng)九天后液體培養(yǎng)基變得渾濁,雙甘膦不再降解,微生物基本死亡。

    通過(guò)對(duì)含無(wú)機(jī)磷源和不含無(wú)機(jī)磷源的培養(yǎng)液的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)含有無(wú)機(jī)磷源的培養(yǎng)液中雙甘膦的降解效果更好,但二者的降解效果相差不大,即該菌種R生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)無(wú)機(jī)磷源的需求不高,但少量的無(wú)機(jī)磷源有助于菌種在培養(yǎng)最初階段的生長(zhǎng)。

    3.3培養(yǎng)液中總磷變化

    篩選得到的雙甘膦降解菌在3g/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng),總磷的變化見(jiàn)表1。在雙甘膦降解菌培養(yǎng)過(guò)程中,總磷濃度先減小,然后增加,但變化幅度不大。

    3.4培養(yǎng)液中無(wú)機(jī)磷的變化

    3g/L的雙甘膦培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)磷的變化見(jiàn)表2。含磷源培養(yǎng)液中無(wú)機(jī)磷含量隨降膦菌培養(yǎng)時(shí)間增加而增加,不含磷源的培養(yǎng)液中無(wú)機(jī)磷含量在前6d檢測(cè)不出,在第9d時(shí)檢測(cè)出有無(wú)機(jī)磷。兩種培養(yǎng)液中雙甘膦降解菌均能將雙甘膦降解為無(wú)機(jī)磷,但含磷源培養(yǎng)液中雙甘膦轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)磷的量更大,說(shuō)明培養(yǎng)初期降解菌所需要的磷營(yíng)養(yǎng)由培養(yǎng)液中磷酸鹽提供更有利于雙甘膦降解菌生長(zhǎng),不含磷源的培養(yǎng)液中雙甘膦降解菌在最初6天中生長(zhǎng)緩慢,檢測(cè)不出降解產(chǎn)物無(wú)機(jī)磷。

    4結(jié)論

    采用雙甘膦為唯一磷源的平板固體培養(yǎng)基篩選方法,分離、純化得到的具有雙甘膦降解性能的菌株R。菌株在雙甘膦為唯一碳源和唯一磷源/唯一磷源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中均能對(duì)雙甘膦進(jìn)行降解,并部分轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)磷。但是在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)期內(nèi),雙甘膦降解率較低,且大部分雙甘膦未被降解或者沒(méi)有完全直接降解成無(wú)機(jī)磷而是被轉(zhuǎn)化成其他形態(tài)的有機(jī)磷。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 周海云,劉樹(shù)洋,徐寧,姜偉立,公彥猛,黃瑞琦. 雙甘膦廢水的濕式氧化處理。農(nóng)藥.2017, 17,56(1): 23-27

    [2]金瀟,顏冬云,秦文秀。有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物降解技術(shù).湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(09): 93-97

    [3] 全鑫, 周春雨, 范婕妤, 等. 草甘膦高效降解菌的篩選鑒定及降解特性研究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2010, 47(4): 921-925.

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