家蠶微粒子病檢驗(yàn)的質(zhì)量管理

王 欣，潘麗芬

(江蘇省蠶種所，江蘇無(wú)錫 214151)

家蠶微粒子病是一種對(duì)養(yǎng)蠶業(yè)具有毀滅性的疫病，對(duì)蠶種生產(chǎn)危害極大，是農(nóng)業(yè)部規(guī)定的必檢疫病，是蠶種質(zhì)量合格的首要指標(biāo)，對(duì)檢驗(yàn)人員的操作技能、專業(yè)判斷和業(yè)務(wù)素質(zhì)要求很高。家蠶微粒子病顯微鏡檢驗(yàn)工作是一項(xiàng)繁瑣又極為嚴(yán)苛的工作過(guò)程，《桑蠶一代雜交種檢驗(yàn)規(guī)程》NY/T 327-1997中分別對(duì)病蛾率和病卵率的抽樣比例與合格標(biāo)準(zhǔn)做出詳細(xì)規(guī)定[1-2]，因此，要求樣品制備人員有責(zé)任心，鏡檢人員具有豐富的理論知識(shí)和識(shí)別判斷微孢子的經(jīng)驗(yàn)。農(nóng)村養(yǎng)蠶期分為春蠶、夏蠶和秋蠶，江蘇省蠶種繁育主要在春期。為了保障合格蠶種順利出庫(kù)，檢驗(yàn)部門應(yīng)及時(shí)接收母蛾樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，做好檢驗(yàn)過(guò)程的全面質(zhì)量管理，既要保障蠶種微粒子病方面的質(zhì)量安全，又要避免誤判造成經(jīng)濟(jì)損失。

1 強(qiáng)化過(guò)程管理，全面提高微粒子病檢驗(yàn)水平

家蠶微粒子病檢驗(yàn)應(yīng)實(shí)施規(guī)范化管理，針對(duì)檢驗(yàn)管理中的薄弱環(huán)節(jié)，完善管理措施，加強(qiáng)監(jiān)督制約，預(yù)防檢驗(yàn)中可能出現(xiàn)的各類問(wèn)題。

1.1樣品的接收與管理江蘇省采用委托檢驗(yàn)的方式對(duì)家蠶母蛾和成品卵微粒子病進(jìn)行檢疫。母蛾樣品接收時(shí)，應(yīng)逐批核對(duì)生產(chǎn)單位、批次、品種名和送檢數(shù)量，檢查樣品外觀是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求。一代雜交種成品卵樣品接收時(shí)，應(yīng)核對(duì)樣品的基本信息，并檢查散卵盒外觀和特性。樣品清點(diǎn)檢查結(jié)束后雙方簽字確認(rèn)。

1.2設(shè)備的管理家蠶微粒子病檢驗(yàn)的主要儀器包括離心機(jī)、旋渦混合儀、顯微鏡等；母蛾樣品處理主要使用旋轉(zhuǎn)式烘蛾機(jī)和集團(tuán)(群體)磨蛾機(jī)；成品卵樣品處理使用研缽和研棒。儀器設(shè)備由有資格的檢驗(yàn)人員操作或使用，以確保檢驗(yàn)過(guò)程安全、準(zhǔn)確。儀器設(shè)備使用前后均應(yīng)保證正常運(yùn)行，一旦出現(xiàn)故障，應(yīng)立即停止使用并做標(biāo)識(shí)，在可能出現(xiàn)影響到檢驗(yàn)結(jié)果的范圍內(nèi)對(duì)已檢樣品進(jìn)行溯源。另外，非檢驗(yàn)期間儀器設(shè)備應(yīng)按要求校準(zhǔn)或維護(hù)。

1.3檢驗(yàn)環(huán)境的控制保持家蠶微粒子病檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的整潔是保證檢驗(yàn)質(zhì)量的有效措施之一。根據(jù)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)規(guī)程的規(guī)定，應(yīng)配備相應(yīng)的設(shè)施，并滿足使用條件的環(huán)境要求，力求儀器設(shè)備布局合理。檢驗(yàn)員應(yīng)熟悉環(huán)境條件，并檢查環(huán)境條件是否符合要求；設(shè)備員負(fù)責(zé)保證設(shè)施和環(huán)境條件滿足要求及日常的維持。當(dāng)環(huán)境條件不符合要求時(shí)，應(yīng)采取措施使之盡快滿足。

1.4鏡檢技術(shù)的提高1870年，法國(guó)巴斯德博士發(fā)現(xiàn)并利用家蠶微粒子病胚種傳染的特點(diǎn)，提出母蛾顯微鏡檢法，淘汰病蛾所產(chǎn)蠶卵，該方法十分經(jīng)典、有效、經(jīng)濟(jì)，并一直沿用到現(xiàn)在。隨著規(guī)模技術(shù)的改變，過(guò)去的單蛾全檢模式已發(fā)展為集團(tuán)母蛾抽樣檢驗(yàn)。鏡檢的準(zhǔn)確性很大程度上取決于鏡檢人員的操作技能和專業(yè)判斷水準(zhǔn)，而相關(guān)鏡檢設(shè)備條件的改善也使檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度提高。

1.5技術(shù)人員的管理不論是樣品編號(hào)、樣品保管、樣品處理，還是顯微鏡檢驗(yàn)、消毒清洗，參與檢驗(yàn)的技術(shù)人員均應(yīng)經(jīng)崗位培訓(xùn)，考核合格后上崗。為使技術(shù)人員的知識(shí)不斷更新，技能不斷熟練，素質(zhì)不斷提高，應(yīng)定期組織開(kāi)展技術(shù)培訓(xùn)和知識(shí)更新的學(xué)習(xí)，注意對(duì)技術(shù)人員職業(yè)道德的教育，提高技術(shù)人員遵守規(guī)章制度和操作規(guī)程的意識(shí)。

1.6原始記錄的保存重視和規(guī)范原始記錄可為檢驗(yàn)工作可追溯提供可靠的依據(jù)。因此，記錄應(yīng)客觀、真實(shí)、準(zhǔn)確和及時(shí)地反映檢驗(yàn)過(guò)程和結(jié)果，以便在必要時(shí)可追溯，并保證檢驗(yàn)在盡可能接近原條件的情況下可復(fù)現(xiàn)。

1.7檢驗(yàn)前后信息的溝通家蠶微粒子病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)僅僅是微粒子病預(yù)防工作的一部分，為保證全面質(zhì)量管理，蠶種生產(chǎn)單位在送檢樣品時(shí)提供樣品的詳細(xì)信息，如生產(chǎn)單位、品種品系名稱、生產(chǎn)批次和送檢數(shù)量等；檢驗(yàn)部門應(yīng)在檢驗(yàn)前對(duì)樣品信息進(jìn)行重新編號(hào)處理，保證客戶送檢樣品信息安全，檢驗(yàn)部門還應(yīng)在全部檢驗(yàn)流程中保證樣品序號(hào)傳遞和記錄無(wú)誤；檢驗(yàn)報(bào)告應(yīng)及時(shí)發(fā)送給各送檢單位，以便及時(shí)安排下一步處理。蠶種生產(chǎn)單位也要根據(jù)檢驗(yàn)報(bào)告對(duì)帶毒母蛾所產(chǎn)蠶卵給予銷毀處理，相關(guān)部門進(jìn)行監(jiān)管控制。

2 依靠質(zhì)量管理體系，有效提高微粒子病檢驗(yàn)管理能力

質(zhì)量管理體系的建立和實(shí)施本身就是不斷提高檢驗(yàn)管理水平的過(guò)程，為不斷尋找檢驗(yàn)流程中的問(wèn)題和不足，需要不斷對(duì)檢驗(yàn)全過(guò)程實(shí)行糾正和改進(jìn)，最終使質(zhì)量管理體系有效地運(yùn)行和不斷地完善。建立健全質(zhì)量管理體系是家蠶微粒子病檢驗(yàn)部門能夠公平、公正、準(zhǔn)確、及時(shí)地提供檢驗(yàn)結(jié)果的有力保障，不但有利于提高檢驗(yàn)質(zhì)量和管理水平，也有利于蠶種生產(chǎn)單位和使用單位客觀、準(zhǔn)確地對(duì)蠶種質(zhì)量做出評(píng)價(jià)。

2.1加強(qiáng)檢驗(yàn)過(guò)程的監(jiān)督管理檢驗(yàn)部門一般應(yīng)設(shè)監(jiān)督員，專門負(fù)責(zé)對(duì)檢驗(yàn)樣品、檢驗(yàn)器具、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)人員、檢驗(yàn)過(guò)程、檢驗(yàn)數(shù)據(jù)等進(jìn)行監(jiān)督和控制。由于操作崗位之間聯(lián)系緊密，每道工序的檢驗(yàn)人員都要對(duì)前道工序進(jìn)行監(jiān)督檢查，檢驗(yàn)人員之間也應(yīng)在工作中互相監(jiān)督，確保樣品和操作過(guò)程準(zhǔn)確無(wú)誤。管理人員還應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)進(jìn)度進(jìn)行不定期地監(jiān)督抽查。

2.2提高檢驗(yàn)人員的質(zhì)量意識(shí)家蠶微粒子病檢驗(yàn)質(zhì)量的好壞不但與檢驗(yàn)設(shè)備、檢驗(yàn)水平有關(guān)，更與檢驗(yàn)人員的質(zhì)量意識(shí)相關(guān)。只有增強(qiáng)檢驗(yàn)人員的質(zhì)量意識(shí)，才能提高檢驗(yàn)人員工作的熱情和責(zé)任心。實(shí)施質(zhì)量責(zé)任分管制，對(duì)自己承擔(dān)的檢驗(yàn)工作負(fù)責(zé)，同時(shí)努力提高技術(shù)能力。

2.3持續(xù)改進(jìn)質(zhì)量管理體系開(kāi)展家蠶微粒子病檢驗(yàn)項(xiàng)目往往會(huì)出現(xiàn)不符合檢驗(yàn)工作的情況，可能是偶發(fā)的對(duì)檢驗(yàn)或檢驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有嚴(yán)重影響的不符合，也有可能對(duì)檢驗(yàn)技術(shù)能力、檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性甚至檢驗(yàn)管理體系產(chǎn)生嚴(yán)重不符合。這時(shí)應(yīng)及時(shí)識(shí)別不符合，建立糾正預(yù)防措施，分析產(chǎn)生原因、潛在隱患、追溯可能產(chǎn)生不良影響的檢驗(yàn)結(jié)果，對(duì)不符合項(xiàng)進(jìn)行改正、評(píng)估，并啟動(dòng)改進(jìn)措施，對(duì)效果進(jìn)行驗(yàn)證、跟蹤，將嚴(yán)重程度和風(fēng)險(xiǎn)降到最低，確保檢驗(yàn)質(zhì)量。如若出現(xiàn)嚴(yán)重后果，要及時(shí)與樣品送檢單位聯(lián)系溝通，做好處理和服務(wù)工作。

3 規(guī)范顯微鏡檢驗(yàn)技術(shù)，保障微粒子病檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性

顯微鏡檢驗(yàn)技術(shù)是鑒別和檢驗(yàn)微粒子病的有效技術(shù)，但很多因素可能影響微粒子病檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，規(guī)范顯微鏡檢技術(shù)顯得尤為重要。

3.1規(guī)范的鏡檢技術(shù)因?yàn)殓R檢主要靠技術(shù)人員的肉眼在600倍視野中觀察微粒子孢子有無(wú)及數(shù)目，每個(gè)技術(shù)人員檢驗(yàn)2個(gè)樣本，每個(gè)樣本不少于5個(gè)視野，并在檢驗(yàn)結(jié)果有差異時(shí)進(jìn)行復(fù)檢確認(rèn)[2]，否則使用過(guò)程中人為因素和客觀條件很容易造成結(jié)果的誤判。

3.2顯微鏡的管理顯微鏡使用環(huán)境應(yīng)保持干燥、整潔、平穩(wěn)，避免陽(yáng)光直射，對(duì)目鏡、物鏡鏡片清潔時(shí)用酒精、乙醚混合液輕擦。檢驗(yàn)期間顯微鏡應(yīng)按儀器操作說(shuō)明規(guī)范使用，并做好記錄，使用期限不超過(guò)校準(zhǔn)有效期。顯微鏡應(yīng)定期進(jìn)行維護(hù)，每年送質(zhì)檢部門校準(zhǔn)，并執(zhí)行期間核查程序，確保檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、有效。

3.3鏡檢人員的技術(shù)培訓(xùn)從事家蠶微粒子病鏡檢工作的人員應(yīng)每年接受專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)，包括顯微鏡的使用操作、家蠶微粒子孢子的相關(guān)知識(shí)、微粒子病檢驗(yàn)的最新技術(shù)進(jìn)展，以及蠶桑發(fā)展相關(guān)理論知識(shí)、質(zhì)量檢驗(yàn)相關(guān)培訓(xùn)等。定期對(duì)鏡檢技術(shù)進(jìn)行培訓(xùn)，有利于技術(shù)人員規(guī)范操作，提高鏡檢準(zhǔn)確率和檢驗(yàn)?zāi)芰Α?/p>

4 討論

4.1送檢樣品的真實(shí)性和代表性委托檢驗(yàn)只對(duì)來(lái)樣負(fù)責(zé)，生產(chǎn)單位送檢的樣品務(wù)必與實(shí)際生產(chǎn)相符。另外家蠶一代雜交種微粒子病檢驗(yàn)，不論是母蛾還是成品卵，都是抽樣檢驗(yàn)，因此，抽樣一定要有代表性。

目前，江蘇省共有18家蠶種生產(chǎn)單位，商品蠶種的母蛾微粒子病檢驗(yàn)由省級(jí)主管部門——江蘇省蠶種所統(tǒng)一負(fù)責(zé)，采用送樣委托檢驗(yàn)的方式。因此，檢驗(yàn)站的家蠶微粒子病檢驗(yàn)任務(wù)繁重，責(zé)任重大。由于母蛾檢驗(yàn)全部采用送樣方式，因此，很難解決母蛾抽樣中的非技術(shù)性問(wèn)題，檢驗(yàn)部門僅對(duì)送檢樣品負(fù)責(zé)[3]?！吨腥A人民共和國(guó)產(chǎn)品質(zhì)量法》對(duì)應(yīng)承擔(dān)產(chǎn)品質(zhì)量責(zé)任的生產(chǎn)和銷售方做出了規(guī)定，質(zhì)量監(jiān)督工作由相應(yīng)的監(jiān)督管理部門負(fù)責(zé)。因此，明確蠶種生產(chǎn)、檢驗(yàn)和監(jiān)督各方的主體和責(zé)任，也是加強(qiáng)家蠶微粒子病檢驗(yàn)和防控管理的趨勢(shì)。

4.2檢驗(yàn)人員的技術(shù)水平與責(zé)任性基于顯微鏡技術(shù)的家蠶微粒子病檢驗(yàn)，是一項(xiàng)技術(shù)要求高、任務(wù)重、壓力大的工作。為確保檢驗(yàn)工作的質(zhì)量和進(jìn)度，應(yīng)對(duì)技術(shù)人員進(jìn)行培訓(xùn)，通過(guò)考核后持證上崗。同時(shí)，應(yīng)定期組織開(kāi)展技術(shù)培訓(xùn)和知識(shí)更新的學(xué)習(xí)，使技術(shù)人員的知識(shí)不斷更新、技能不斷熟練、素質(zhì)不斷提高，應(yīng)注意加強(qiáng)技術(shù)人員職業(yè)道德的教育，提高人員遵守規(guī)章制度和操作規(guī)程的意識(shí)。另外管理人員應(yīng)加強(qiáng)對(duì)檢驗(yàn)過(guò)程的監(jiān)督。

4.3檢驗(yàn)技術(shù)的改進(jìn)與提高顯微鏡鏡檢技術(shù)已有100多年歷史，且仍是目前家蠶微粒子病檢驗(yàn)的主要方法。隨著生物科學(xué)的不斷進(jìn)步，越來(lái)越多形式的免疫學(xué)或分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法用于檢驗(yàn)家蠶微粒子病[4]。

4.3.1微孢子蟲(chóng)染色鏡檢技術(shù)。由于顯微鏡肉眼觀察微孢子蟲(chóng)對(duì)技術(shù)人員的熟練操作技巧和判斷能力要求較高，若技術(shù)不熟練很容易漏判或誤判微孢子，因此，科研人員針對(duì)微孢子蟲(chóng)染色后用于鏡檢的技術(shù)進(jìn)行一系列的研究。使用 KMnO4甲基紫法將家蠶微孢子蟲(chóng)染成紫色，區(qū)別于其他家蠶病原孢子，提高檢出率[5]。使用熒光染色劑 Calcofluor White M2R 染色法染色后家蠶微孢子蟲(chóng)孢子在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)青藍(lán)色熒光，光線穩(wěn)定，熒光強(qiáng)度高，特異性強(qiáng)，因此，檢驗(yàn)高效、快速[6]。

4.3.2免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)。根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)的原理，并有效結(jié)合免疫放大技術(shù)，近年來(lái)免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)已逐步用于家蠶微孢子的鑒定。應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)，將抗家蠶微粒子孢子的單克隆抗體與免疫金銀染色法(IGSS)相結(jié)合，從光鏡水平對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)進(jìn)行鑒定[7]。應(yīng)用炭素凝集反應(yīng)法對(duì)家蠶母蛾微孢子進(jìn)行檢驗(yàn)，快速而且簡(jiǎn)便[8]。應(yīng)用酶標(biāo)抗體間接法和酶標(biāo)抗體PAP法對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)孢子進(jìn)

行鑒別診斷，前者相對(duì)簡(jiǎn)單，后者敏感性更高[9]。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和膠體金免疫層析試驗(yàn)(GICA)組裝研制家蠶微孢子蟲(chóng)快速檢驗(yàn)試紙條，以期能夠靈敏、準(zhǔn)確地診斷家蠶微粒子病[10]。

4.3.3分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)。分子生物學(xué)研究中PCR技術(shù)的應(yīng)用最為常見(jiàn)，因該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)易、檢驗(yàn)高效等特點(diǎn)，近年來(lái)也被用于家蠶微粒子病檢驗(yàn)。多引物 PCR的方法能夠?qū)嶋H用于診斷早期的家蠶微孢子蟲(chóng)[11]。通過(guò)優(yōu)化熒光定量PCR反應(yīng)體系，已成功構(gòu)建并研制出家蠶微孢子蟲(chóng)診斷試劑盒[12]。PCR技術(shù)對(duì)樣品的要求較高，觀察時(shí)染色劑溴化乙錠(EtBr，EB)也對(duì)人體產(chǎn)生毒害作用?？蒲腥藛T利用原位雜交技術(shù)診斷家蠶卵及幼蟲(chóng)體內(nèi)感染的家蠶微孢子蟲(chóng)，但操作復(fù)雜，成本較高[13]。

21世紀(jì)初，日本科學(xué)家建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，無(wú)需熱循環(huán)儀，能夠快速、簡(jiǎn)單、高效的檢驗(yàn)病原微生物。因此，科研人員將此方法應(yīng)用在檢驗(yàn)家蠶微粒子病上，玻璃珠破碎法、FTA卡和 LAMP 技術(shù)結(jié)合起來(lái)，建立一種快捷、高效、廣泛使用的家蠶微孢子蟲(chóng)的檢驗(yàn)方法[14]。但由于靈敏度較高，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果導(dǎo)致誤判，目前該技術(shù)還處于實(shí)驗(yàn)室階段，尚未實(shí)現(xiàn)大規(guī)模用于生產(chǎn)中的家蠶微粒子病檢驗(yàn)。

[1] 農(nóng)業(yè)部種植業(yè)管理司經(jīng)濟(jì)作物處.家蠶微粒子病綜合防控技術(shù)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2015：99-100.

[2] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部，桑蠶一代雜交種檢驗(yàn)規(guī)程：NY/T 327—1997[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1998：1-6.

[3] 魯興萌，邵勇奇.家蠶微粒子病檢驗(yàn)技術(shù)綜述[J].蠶業(yè)科學(xué)，2016，42(4)：717-721.

[4] 鄒邦興，周安蓮，肖文福，等.家蠶微粒子檢測(cè)新方法的探索[J].四川蠶業(yè)，2017，45(1)：45-47.

[5] 唐順明，張志芳，李奕仁，等.一種家蠶微孢子蟲(chóng)孢子快速染色鑒定的方法[J].中國(guó)蠶業(yè)，2002，23(2)：27-28.

[6] 劉吉平，曾玲.Calcofluor White M2R熒光染色法識(shí)別家蠶微孢子蟲(chóng)[J].昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2007，50(11)：1185-1186.

[7] 劉吉平，盧鏗明，徐興耀，等.單抗免疫金銀染色法診斷家蠶微孢子蟲(chóng)的研究[J].廣東蠶業(yè)，1995，29(3)：30-35.

[8] 陳祖佩，潘敏慧，馮麗春，等.家蠶微粒子病血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究Ⅲ——炭素凝集反應(yīng)法與常規(guī)鏡檢檢微法對(duì)比試驗(yàn)[J].蠶學(xué)通訊，1994(3)：2-6.

[9] 萬(wàn)嘉群.用酶標(biāo)抗體法檢測(cè)蠶微粒子孢子[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，1998，15(1)：6-7.

[10] 蘆琨.家蠶微粒子病免疫學(xué)快速檢測(cè)試紙條的研制[D].重慶：西南大學(xué)，2009.

[11] HATAKEYAMA Y，HAYASAKA S.A new method of pebrine inspection of silkworm egg using multiprimer PCR[J].J Invertebr Pathol，2003，82(3)：148-151.

[12] 何永強(qiáng)，吳姍，魯興萌，等.家蠶微孢子蟲(chóng)熒光定量PCR檢測(cè)方法及診斷試劑盒[J].蠶業(yè)科學(xué)，2011，37(2)：260-265.

[13] 韋亞?wèn)|，張國(guó)政，陸長(zhǎng)德.家蠶微孢子蟲(chóng)原位雜交診斷技術(shù)研究[J].蠶業(yè)科學(xué)，2005，31(1)：64-68.

[14] 燕薇.家蠶微孢子蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)研究及藍(lán)葉蟲(chóng)微孢子蟲(chóng) RPB1基因克隆與分析[D].鎮(zhèn)江：江蘇科技大學(xué)，2014.