基于原子力顯微鏡的不同固化液對腎細(xì)胞固化狀態(tài)的影響

摘 要：細(xì)胞固化技術(shù)是利用介質(zhì)將活細(xì)胞固定在反映溶液中，且盡可能完整的保存細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)。針對細(xì)胞固定過程中遇到的細(xì)胞破裂、細(xì)胞過渡收縮、細(xì)胞核固定性差等問題，本文采用原子力顯微鏡對甲醇、戊二醛、丙酮固定的腎細(xì)胞進(jìn)行形貌測量。經(jīng)對比分析發(fā)現(xiàn)戊二醛對腎細(xì)胞的固化能夠更完整的保存細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞固化；原子力顯微鏡；細(xì)胞測量

DOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2017.24.251

1 引言

原子力顯微鏡是通過檢測待測樣品表面和一個微型力敏感元件之間的極微弱的原子間相互作用力來研究物質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)及性質(zhì)。它可以實(shí)現(xiàn)對樣品的“推”、“拉”、“刻劃”、“切割”、“搬運(yùn)”等操作功能[1]。還可以實(shí)現(xiàn)樣品的表面成像、粗糙度測量、高度測量等檢測功能。傳統(tǒng)觀測細(xì)胞的儀器為光學(xué)顯微鏡，其分辨率在微米級別，且不能準(zhǔn)確的得出所觀測細(xì)胞的尺寸、粗糙度、高度等信息。而原子力顯微鏡具有納米級分辨率，可在空氣或者各種近生理?xiàng)l件下工作，直接探測生物細(xì)胞的高度、直徑、體積、彈性等信息，能夠在微/納尺度上更加詳細(xì)地了解和掌握生物細(xì)胞的表面形貌、結(jié)構(gòu)特征、功能及特性等。這種優(yōu)勢使其正逐漸發(fā)展為細(xì)胞生物學(xué)研究中的有效工具。但是，因細(xì)胞具有一定的柔性，直接在生理溶液中對細(xì)胞進(jìn)行原子力顯微鏡成像，會有成像分辨率不高、細(xì)胞膜表面蛋白成像不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。因此為獲得較高的細(xì)胞表面成像的分辨率，我們常會利用固化劑對細(xì)胞進(jìn)行固化處理，雖然經(jīng)固化劑處理后，細(xì)胞失去了活性，但對于細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜表面褶皺、細(xì)胞器、微絨毛等研究卻有不可或缺的作用。

2 固化細(xì)胞形貌成像

傳統(tǒng)的細(xì)胞固定劑有95%酒精、乙醚酒精液、甲醇、冰醋酸、無水酒精、丙酮、Carnoy固定液、10%中性緩沖甲醛液等多個種類。但由于乙醚、丙酮等具有揮發(fā)性和毒性，對人身體有害，已很少用于常規(guī)細(xì)胞學(xué)的固定。常用的細(xì)胞固定劑多為醛類固定劑，且以甲醛類和戊二醛最為常用。本文采用最常用的固定劑，丙酮、2.5%戊二醛、甲醇對腎細(xì)胞進(jìn)行固定，并獲得固定后的腎細(xì)胞形貌圖像。

2.1 生理溶液下觀察腎細(xì)胞

正常腎細(xì)胞是在37攝氏度環(huán)境中，貼壁生長于培養(yǎng)液中。本實(shí)驗(yàn)是將貼壁生長兩天的腎細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，并更換新的培養(yǎng)液。更換培養(yǎng)液是不可或缺的重要步驟，可以防止細(xì)胞生長過程中死亡的漂浮細(xì)胞或雜質(zhì)刮到探針針尖上，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖1為正常生理溶液下腎細(xì)胞形貌圖像。可見細(xì)胞伸展?fàn)顟B(tài)良好，細(xì)胞表面較光滑，細(xì)胞之間通過觸角聯(lián)系密切。但掃描過程中會有拉線情況出現(xiàn)，影響成像質(zhì)量。

2.2 觀察2.5%戊二醛固定劑固化的腎細(xì)胞

2.5%戊二醛固定劑是常用的細(xì)胞固定劑，該固定劑固定速度快、穿透性強(qiáng)，可以很好的保存細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)。2.5%戊二醛固定劑配制方法：量取25%的戊二醛溶液10ml，置于三角燒瓶中，加入雙蒸餾水40ml，0.2mol/L磷酸緩沖液50ml，充分混勻[2]。圖2為2.5%戊二醛固定劑固化后的腎細(xì)胞形貌圖像。可見2.5%戊二醛固定劑處理后的腎細(xì)胞，表面相對平滑，沒有明顯的孔洞，細(xì)胞邊緣較清晰。與正常生理溶液下觀察到的腎細(xì)胞形貌圖像差別不大。

2.3 觀察甲醇固定劑固化的腎細(xì)胞

甲醇固定劑具有固定時間快，細(xì)胞收縮小，細(xì)胞核保存較好，結(jié)構(gòu)清晰等優(yōu)點(diǎn)。圖3為甲醇固定劑固定后的腎細(xì)胞形貌圖像。圖4為

（下轉(zhuǎn)第278頁）

（上接第275頁）

甲醇固定劑固定腎細(xì)胞后，腎細(xì)胞的邊緣形貌圖像。由甲醇固定劑處理后的腎細(xì)胞形貌圖可見，細(xì)胞表面侵蝕出許多孔洞樣結(jié)構(gòu)。說明甲醇侵蝕了腎細(xì)胞的細(xì)胞膜，使腎細(xì)胞產(chǎn)生了損傷。從圖4可以清晰的看到細(xì)胞的邊緣細(xì)微結(jié)構(gòu)，說明腎細(xì)胞的微絨毛固化的相當(dāng)清晰完好。

2.4 觀察丙酮固定劑固化的腎細(xì)胞

丙酮處理后的腎細(xì)胞形貌如圖5所示?？汕逦挠^察到細(xì)胞表面有多處皸裂的痕跡，且細(xì)胞邊緣不清晰，說明細(xì)胞脫水嚴(yán)重，在固化的過程中受到極大的損傷。由圖6可見，細(xì)胞邊緣觸角收縮為一團(tuán)。與正常生理溶液中的活細(xì)胞相比，經(jīng)丙酮固化后的腎細(xì)胞形貌結(jié)構(gòu)變化較大。

3 結(jié)論

細(xì)胞形貌、結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的生理狀態(tài)和功能有著重要的聯(lián)系，原子力顯微鏡對細(xì)胞表面形貌學(xué)研究與臨床研究的關(guān)系越來越密切，并具有廣闊的應(yīng)用前景。本文通過原子力顯微鏡對生理溶液下腎細(xì)胞、2.5%戊二醇固定劑固定的腎細(xì)胞、甲醇固定劑固定的腎細(xì)胞、丙酮固定劑固定的腎細(xì)胞進(jìn)行形貌測量。經(jīng)對比分析發(fā)現(xiàn)甲醇固定劑會很好的固定細(xì)胞邊緣的細(xì)微結(jié)構(gòu)，但是卻會侵蝕細(xì)胞表面，使細(xì)胞表面產(chǎn)生孔洞樣結(jié)構(gòu)。丙酮固定劑會使細(xì)胞脫水嚴(yán)重，細(xì)胞表面會發(fā)生皸裂，且細(xì)胞邊緣觸角會收縮成團(tuán)，腎細(xì)胞形貌較生理溶液中的細(xì)胞變化較大。而2.5%戊二醛固定劑對腎細(xì)胞的固化能夠更完整的保存細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞更接近于生理溶液中活細(xì)胞的形貌結(jié)構(gòu)狀態(tài)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對于進(jìn)一步研究細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的褶皺，細(xì)胞表面的層狀脂肪物，微端絲和微絨毛[3]等，2.5%戊二醛固定劑固定細(xì)胞樣品是很好的細(xì)胞樣品制備方式。

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作者簡介：張文曉（1988-），女，滿族，吉林梅河口人，碩士研究生，實(shí)習(xí)研究員，研究方向：納米操縱及測量。endprint