山東省各地市蜜蜂黑蜂王臺病毒抽樣檢測分析

李桂林 王 穎 馬蘭婷 郭恒俊 胥保華 郭興啟

（1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271018；2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安 271018）

山東省各地市蜜蜂黑蜂王臺病毒抽樣檢測分析

李桂林1 王 穎2 馬蘭婷2 郭恒俊1 胥保華2 郭興啟1

（1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271018；2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安 271018）

蜜蜂黑蜂王臺病是由蜜蜂黑蜂王臺病毒（Black queen cell virus, BQCV）引起的蜜蜂疾病，目前在世界范圍內(nèi)均有分布。為檢測山東省蜜蜂黑蜂王臺病毒在蜂群中的攜帶情況，本研究對山東省17地市部分蜂場蜜蜂攜帶BQCV的情況進行抽樣調(diào)查，并首次通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）方法初步對17地市的蜜蜂樣本進行了快速病原學(xué)檢測。檢測結(jié)果顯示，山東省17地市的62個蜂場中有來自7個地市的13個蜂場的蜂群攜帶BQCV，檢出率為4.769%。結(jié)合調(diào)研情況及鑒定結(jié)果，我們還提供了5條可能防御蜜蜂黑蜂王臺病發(fā)生的措施。希望本研究為有效預(yù)防山東省蜜蜂黑蜂王臺病的發(fā)生提供參考。

蜜蜂黑蜂王臺病毒；RT-PCR；山東省

1 前言

蜜蜂作為自然界中最重要的授粉者[1]，極具社會效益及經(jīng)濟價值。然而，近年來由于受到各種不利環(huán)境脅迫及各種蜜蜂疾病的影響，全球范圍內(nèi)蜜蜂的數(shù)量正逐漸減少[2-4]。蜜蜂病毒病是一種特殊的蜜蜂疾病，不僅與弱勢蜂群的死亡相關(guān)，還影響蜜蜂的行為、生理及形態(tài)多個方面，其在多個國家都有分布，并在世界范圍內(nèi)快速擴散，現(xiàn)已成為世界上引起蜂群損失的主要原因[5-7]。近年來，蜜蜂病毒病不僅成為養(yǎng)蜂行業(yè)的熱點話題，也成為養(yǎng)蜂研究的重要課題之一。

蜜蜂黑蜂王臺病是蜜蜂病毒病的一種，由蜜蜂黑蜂王臺病毒（Black queen cell virus，BQCV）引起。自2000年完成BQCV的南非株（GenBank:AF183905.1）全基因組測序以來，目前NCBI上已收藏7株BQCV的全基因組序列。近年來蜂產(chǎn)品貿(mào)易的全球化，使BQCV在世界范圍內(nèi)廣泛流行。在分類上，BQCV屬于類小核糖核酸病毒、雙順反子病毒科、蟋蟀麻痹病毒屬[8-10]；在形態(tài)上，BQCV是呈球形的、無囊膜的、直徑為30 nm的病毒粒子。BQCV傳播廣泛，可感染蜜蜂（蜂王、工蜂、雄蜂）的卵、幼蟲、蛹及成蜂，也可以感染不同蜂種甚至非膜翅類昆蟲。BQCV的傳播方式分為水平傳播及垂直傳播[11]。感染方式為隱性感染[12]，看似健康的蜂群里的蜜蜂可能攜帶BQCV，在各種不利環(huán)境條件下（高溫、低溫、營養(yǎng)不良及外敵入侵等），蜜蜂體內(nèi)的BQCV可被激活并快速復(fù)制，最終導(dǎo)致蜂群大量死亡[3,13]。蜂群的大量死亡不僅給蜂農(nóng)帶來不可估量的損失，也將影響?zhàn)B蜂相關(guān)的產(chǎn)業(yè)。蜜蜂體內(nèi)攜帶BQCV并不可怕，可怕的是各種環(huán)境壓力導(dǎo)致蜜蜂體內(nèi)BQCV的激活，繼而導(dǎo)致BQCV被大量復(fù)制，最終導(dǎo)致蜂群崩潰。由于蜜蜂黑蜂王臺病給蜂群帶來嚴(yán)重危害，近年來針對BQCV的研究與日俱增[14-19]。

鑒于蜜蜂黑蜂王臺病的發(fā)病特點及流行性，提前檢測出蜂群中是否攜帶BQCV，做好預(yù)防措施，及時切斷BQCV的傳播途徑是必要的。本研究參照Benjeddou 等人設(shè)計的引物[20]，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR），對山東省17地市蜂群攜帶BQCV的狀況進行調(diào)查，首次報道了山東省17地市部分蜂場蜜蜂攜帶BQCV的情況，為有效預(yù)防山東省蜜蜂黑蜂王臺病的發(fā)生提供參考。

2 材料與方法

2.1 樣品的采集

2016年7 月至2016年11月，我們先后調(diào)研了山東省17個地市的62個蜂場，并從蜂場采集蜜蜂樣品，保存在-80℃超低溫冰箱內(nèi)備用。蜂種包括意大利蜜蜂（Apis mellifera）和中華蜜蜂 (Apis cerana cerana)，多數(shù)蜜蜂樣品是意大利蜜蜂，部分是中華蜜蜂。

2.2 試劑

RNAiso plus由TAKARA公司生產(chǎn)；氯仿、異丙醇、無水乙醇由天津市凱通化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；5× All-In-One RT MasterMix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)由ABM公司生產(chǎn)；EasyTaq?DNA Polymerase、pEASY?-T1 Simple Cloning Vector 及Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell由北京全式金生物生產(chǎn)；Plasmid Mini Kit I由上海拜力生物科技有限公司生產(chǎn)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。10mm dNTP mixture由生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)。

2.3 引物的設(shè)計與合成

在本研究中用到的擴增BQCV的引物借鑒于Benjeddou 等人設(shè)計的引物，上游引物（BQCVup）為：5'-TGGTCAGCTCCCACTACCTTAAA-3'，下游引物（BQCVdown）為：5'-TGGTCAGCTCCCACTAC CTTAAAC-3'[20]，該對引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.4 樣品 RNA的提取

利用Trizol法提取樣品總RNA。具體步驟如下：液氮研磨采集的蜜蜂樣品至粉末狀，稱取0.05~0.1 g粉末至無RNA酶的1.5 ml離心管里（離心管里事先被分裝了1 ml的RNAiso plus），立即旋渦震蕩1 min，室溫放置5 min；12000 g，4℃離心10 min；取上清至新的1.5 ml離心管里，加入200 μl的氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min用來沉淀蛋白；12000 g，4℃離心15 min；取上清至新的1.5 ml離心管里，加入500 μl異丙醇用來沉淀RNA，輕輕地顛倒混勻，室溫放置10 min；12000 g，4℃離心10 min；去上清，加入1 ml預(yù)冷的75%的無水乙醇，漂洗RNA；7500 g，4℃離心5 min；用真空泵抽去75%的無水乙醇，室溫放置3 min，使殘留的無水乙醇盡量揮發(fā)完；加入30 μl的無RNA酶的水，吸打數(shù)次，溶解RNA，稍離心，保存在-80℃超低溫冰箱內(nèi)備用。

2.5 cDNA第一鏈的合成

用 5× All-In-One RT MasterMix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)合 成cDNA第 一 鏈。RNA模板加入2 μg，再加入AccuRT Reaction Mix(4X)至兩者的總體積為8 μl；42℃孵育2 min；分別加入 AccRT Rection Stopper (5X) 2 μl，5X All-In-One RT MasterMix 4 μl，Nuclease-free H2O 6 μl，吸打混勻，25℃孵育10 min，42℃孵育15 min，85℃孵育5 min；適當(dāng)離心后，放-20℃冰箱內(nèi)備用。

2.6 PCR擴增體系及擴增程序

以合成的第一鏈cDNA為模板，建立以下25 μl的反應(yīng)體系：模板1 μl，上游引物1 μl，下游引物 1 μl，10XEasyTaq?Buffer 2.5 μl，10mm dNTP mixture 溶 液 1 μl，EasyTaq?DNA Polymerase 0.25 μl，雙蒸水18.25 μl。反應(yīng)條件為：94℃ 10 min；94℃ 40 s，48℃ 40 s，72℃ 50 s，共35個循環(huán)；72℃后延伸10 min。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的制備

采集山東農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)殖的中華蜜蜂，按上述方法提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一條鏈，以此為模板，以BQCVup、BQCVdown為引物進行PCR的擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用凝膠成像系統(tǒng)（產(chǎn)自北京賽智科技有限公司）成像，把含目的條帶的凝膠切下，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行膠回收。膠回收產(chǎn)物連pEASY?-T1 Simple Cloning Vector。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell。次日挑選陽性單克隆菌送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。目的基因的測序結(jié)果在NCBI上進行Nucleotide BLAST，以檢測目的基因擴增的正確性。選取測序正確的陽性單克隆菌的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。

2.8 檢測采集的山東省17地市的蜜蜂樣本中BQCV的攜帶情況

首先對采集的蜜蜂樣本按上面提到的RNA提取方法進行RNA的提取，并制備cDNA第一條鏈。用來檢測的各蜂場的每個樣品均由20只蜜蜂組成，用液氮研磨至粉末狀，稱取0.05~0.1 g粉末用來提取RNA，剩余的粉末放-80℃超低溫冰箱備用。在進行PCR檢測時，每個樣品做兩個平行。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，然后用全自動凝膠成像儀拍照。陽性對照中模板是質(zhì)粒（上面提到的標(biāo)準(zhǔn)陽性模板），陰性對照的模板是雙蒸水，其他反應(yīng)體系及反應(yīng)條件不變。

3 結(jié)果與分析

3.1 體系調(diào)研的基本情況

本研究對山東省17個地市（濟南、青島、淄博、德州、煙臺、濰坊、日照、萊蕪、菏澤、濱州、濟寧、泰安、臨沂、聊城、威海、棗莊及東營等）的蜂場進行抽樣調(diào)查。調(diào)查發(fā)現(xiàn)蜂農(nóng)主要養(yǎng)殖意大利蜜蜂，大部分蜂場有爬蜂現(xiàn)象，多數(shù)蜂場的蜜蜂被感染蜂螨。采集的樣品被帶回實驗室后，先用液氮冷凍，然后立即放入-80℃超低溫冰箱保存。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的獲得

首先將從疑似患有BQCV的蜜蜂中得到的cDNA作為PCR擴增的模板，并采用Benjeddou 等人設(shè)計的引物[20]（該引物已在世界范圍內(nèi)被多人用來篩選BQCV[21-23]），進行PCR擴增。PCR擴增結(jié)果如圖1所示，在選取的7個模板中，有六個模板可擴出條帶，條帶大小與理論擴增片段大小一致。1、3及7號目的條帶分別被用來切膠、膠回收，膠回收產(chǎn)物進一步被用來做連接轉(zhuǎn)化，挑選陽性單克隆菌測序。測序獲得的目的序列在NCBI上Blast，結(jié)果顯示與之同源的核苷酸序列全來自BQCV。以上結(jié)果表明，我們擴出來的片段就是BQCV的序列。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)飼養(yǎng)的中華蜜蜂蜂群購自臨沂的某蜂場，在2016年9月份我們從這家蜂場采集的樣品中也檢測到了BQCV，初步說明該蜂場的蜜蜂攜帶BQCV，也進一步證實了我們擴出的序列是BQCV的。選取1號樣品的菌進行搖菌，用Plasmid Mini Kit I抽提質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒作為檢測山東省17地市BQCV存在情況的陽性對照模板。

圖1 BQCV基因PCR擴增結(jié)果電泳圖

3.3 山東省17地市蜂群攜帶BQCV的抽樣調(diào)查結(jié)果

采用RT-PCR初步檢測采集的蜜蜂樣品中是否含有BQCV。本研究共調(diào)研山東省17地市的62個蜂場，采集了128份樣品。在山東省17個地市的62個蜂場中，有7個地市（日照、泰安、臨沂、棗莊、濱州、威海和淄博），13個蜂場的蜂群初步被檢測到攜帶BQCV，檢出率為4.769%。其中3家蜂場的樣品來自日照，3家蜂場的樣品來自泰安，2家蜂場的樣品來自臨沂，2家蜂場的樣品來自棗莊，1家蜂場的樣品來自濱州，1家蜂場的樣品來自威海，1家蜂場的樣品來自淄博（表1）。

表1 山東省檢出BQCV的地市的情況

4 討論

蜜蜂黑蜂王臺病毒的感染方式為隱性感染，這種感染方式不易被觀察到，直到蜂王幼蟲及蛹變黑，巢房房壁變黑時，才能呈現(xiàn)出可觀察的現(xiàn)象[19,24]。RT-PCR方法具有快速、特異性強、敏感性高等特點，可用于快速檢測BQCV的存在，也為快速診斷蜜蜂黑蜂王臺病提供一種新的途徑。本研究用分子生物學(xué)的手段，用RT-PCR方法初步檢測了BQCV在山東省17地市的蜂群中攜帶情況。

實驗結(jié)果顯示，在山東省17地市，62個蜂場中，有來自泰安、淄博、日照、臨沂、棗莊、濱州、煙臺和威海等7個地市的13個蜂場的蜜蜂初步被檢測到攜帶BQCV（檢出率為4.769%），在青島、東營、濰坊、德州、聊城、萊蕪、濟南、煙臺、菏澤及濟寧的蜂場未檢測到BQCV的存在。此結(jié)果初步說明BQCV在山東省分布并不廣泛。通過本研究，可以通知被檢測出BQCV存在的蜂場的蜂農(nóng)加強防御BQCV增殖的意識，以免造成不必要的損失。值得提出的是，日照嵐山區(qū)部分蜂場的蜜蜂于2016年11月初出現(xiàn)大量死亡的現(xiàn)象，我們在當(dāng)?shù)厝曳鋱霾杉瞬。ㄋ溃┓錁悠?，?jīng)RT-PCR鑒定顯示：三家蜂場的蜜蜂均攜帶BQCV，相對于本實驗室所鑒定的其他蜜蜂病原，BQCV的含量還是較強的（數(shù)據(jù)未顯示）。經(jīng)調(diào)研這三家蜂場，發(fā)現(xiàn)蜂農(nóng)對蜂群飼養(yǎng)管理不規(guī)范，蜂群群勢弱。本地區(qū)蜜蜂突發(fā)性大量死亡可能原因之一是：這三家蜂場的蜂群本身就攜帶BQCV，只是BQCV的滴度低，不足以引起蜜蜂患病。在各種不利環(huán)境（寒流來襲及飼料不足等）的影響下，蜜蜂體內(nèi)的BQCV被激活，再加上與其他蜜蜂病原（蜂螨、慢性麻痹病毒、克什米爾病毒及殘翅病毒等）的混合感染，導(dǎo)致蜂群出現(xiàn)大規(guī)模病死現(xiàn)象。蜂群的大量死亡給蜂農(nóng)造成大量損失，也間接影響?zhàn)B蜂行業(yè)，通過這一事件，我們覺得有必要加強蜂農(nóng)防御蜜蜂病毒病的意識。

蜜蜂給我國帶來巨大的經(jīng)濟效益，然而BQCV導(dǎo)致的蜜蜂急劇死亡也給國家造成極大經(jīng)濟損失。鑒于目前還沒有針對BQCV的徹底治療方法，因此保持蜂群健康，預(yù)防蜜蜂黑蜂王臺病的發(fā)生顯得尤為重要。為減少蜜蜂黑蜂王臺病的發(fā)生，以下防御措施可供參考：（1）有效治理狄斯瓦螨（這是保證蜂群健康的最有效的措施）。Chantawannakul等首次報道了瓦螨可攜帶BQCV[25]。瓦螨的刺吸行為可使寄生在瓦螨身上的病毒粒子進入蜜蜂血淋巴，如果瓦螨寄生的是被病毒感染的蜜蜂，那么蜜蜂血淋巴里存在的病毒顆粒也可被瓦螨一塊吸取，繼而造成病毒在不同蜜蜂個體間傳播。此外，由于生物免疫抑制作用，隱藏在蜜蜂體內(nèi)潛在的病毒可被激活[26,27]。通過與多位蜂農(nóng)的交談發(fā)現(xiàn)，如果在養(yǎng)蜂的過程中對螨防治的好，基本上可以獲得強群，蜂群一般不會出現(xiàn)不明原因的死亡現(xiàn)象。目前針對瓦螨的防治已有比較成熟的辦法，因此，可以通過控制蜂群中的瓦螨來間接控制蜜蜂黑蜂王臺病的發(fā)生。（2） 蜜蜂黑蜂王臺病的發(fā)生可能與蜜蜂微孢子蟲病有一定的聯(lián)系，當(dāng)與蜜蜂微孢子蟲合并感染時導(dǎo)致極強的致病性，給養(yǎng)蜂業(yè)帶來巨大損失。蜜蜂微孢子蟲病爆發(fā)的高峰期是春季和初夏，因此在春季及初夏可以通過嚴(yán)格控制蜜蜂微孢子蟲病的發(fā)生來間接防治蜜蜂黑蜂王臺病的爆發(fā)[23,28,29]。（3）及時切斷其他蜜蜂病毒的傳播途徑。由于蜜蜂病毒的多重感染對蜂群帶來的損失遠(yuǎn)高于單一感染，勢必會導(dǎo)致弱勢蜂群的產(chǎn)生，再加上不利環(huán)境的刺激，勢必使蜜蜂病毒被激活并大量復(fù)制的概率增加[24,30,31]。因此，我們可以定期對蜂場及蜂場所使用的各種蜂具進行消毒，減少各種病毒的增殖，進而減少BQCV與其他蜜蜂病毒混合感染的機會。切斷各種蜜蜂病毒的傳播途徑，防止蜜蜂受到病毒的多重感染，減少弱勢蜂群的產(chǎn)生，有利于蜂群抵抗BQCV的侵染。（4）飼養(yǎng)強群，選用年輕的優(yōu)質(zhì)蜂王[4,11]。相比弱群，強群里的蜜蜂有較強的免疫力及抗病性[19,24,30]。在各種不利環(huán)境因子的應(yīng)激壓力下，強群的蜜蜂有更強的適應(yīng)性，潛伏在蜜蜂體內(nèi)的BQCV不易被激活。另外，因蜜蜂病毒可通過垂直傳播途徑傳給后代，因此選用健康的、不攜帶蜜蜂病毒及抗病能力強的優(yōu)質(zhì)蜂王來繁育后代，就減少了蜜蜂病毒通過垂直傳播途徑傳給后代的機會。（5）加快研究抗BQCV藥物的步伐。Aurori等提出月桂可做為潛在的治療受BQCV感染的蜂群的抗病毒藥物[16]，這當(dāng)然還要進一步試驗驗證。此外，隨著科技的發(fā)展，可利用RNA干擾的原理及技術(shù)，制造抗BQCV的藥物用于防治蜜蜂黑蜂王臺病的發(fā)生也是可行的。

總之，通過抽樣調(diào)查及RT-PCR方法，本研究發(fā)現(xiàn)山東省17地市蜂群攜帶BQCV的現(xiàn)象不普遍，此結(jié)果為下一步預(yù)防蜜蜂黑蜂王臺病的發(fā)生提供了參考。另外，希望本研究根據(jù)調(diào)研情況及對查閱文獻(xiàn)的總結(jié)提出的可能預(yù)防蜜蜂黑蜂王臺病的方法，能對蜂農(nóng)了解防治蜜蜂黑蜂王臺病的方法提供幫助。

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The sampling inspection analysis of black queen cell virus in various cities of Shandong province

Li Guilin1, Wang Ying2, Ma Lanting2, Guo Hengjun1, Xu Baohua2, Guo Xingqi1
(1 State Key Laboratory of Crop Biology, College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Taian 271018,China; 2 College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China)

Black queen cell disease is one of the honeybee diseases that is caused by black queen cell virus (BQCV),which is spread around the world at present. In this paper, some apiaries of seventeen cities in Shandong province was chosen to perform sampling inspection analysis to detect the carrying situation of BQCV in the honeybee of Shandong province, and the selected samples were carried out preliminary rapid pathogen detection by reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) for the fi rst time. The results showed that the honeybee from thirteen apiaries of seven cities was detected carrying BQCV in sixty-two apiaries of seventeen cities in Shandong province. The detection rate was 4.769%. Furthermore, we provide five possible measures to prevent black queen cell disease in this study through combining investigation situation and detection result. We hope that the fi ndings in this paper can provide a reference for the effective prevention of black queen cell disease in Shandong province.

Black queen cell virus; RT-PCR; Shandong province

山東省現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊專項基金（No. SDAIT-24-04）

李桂林（1990-），女，碩士研究生，主要從事蜜蜂抗病抗逆分子生物學(xué)研究，E-mail: guilinli1@163.com

郭興啟（1963-），男，教授，博導(dǎo)，E-mail: xqguo@sdau.edu.cn