大鼠慢傳輸型便秘發(fā)病的Cajal間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白c-kit-SCF調(diào)控機制研究

劉志昊, 李曙光, 虞向陽, 陳建立, 曹文斌, 趙永魁, 張國志

(1. 河北省唐山市開灤總醫(yī)院范各莊醫(yī)院 普通外科, 河北 唐山, 063108; 2. 華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 普通外科, 河北 唐山, 063108)

大鼠慢傳輸型便秘發(fā)病的Cajal間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白c-kit-SCF調(diào)控機制研究

劉志昊1, 李曙光2, 虞向陽2, 陳建立2, 曹文斌2, 趙永魁2, 張國志2

(1. 河北省唐山市開灤總醫(yī)院范各莊醫(yī)院 普通外科, 河北 唐山, 063108; 2. 華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 普通外科, 河北 唐山, 063108)

目的分析大鼠慢傳輸型便秘發(fā)病的Cajal間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白c-kit的調(diào)控機制。方法成年雄性SD大鼠皮下注射嗎啡25 mg/kg, 共45 d, 誘導(dǎo)大鼠慢傳輸型便秘發(fā)病模型。分析便秘大鼠日均糞便粒數(shù)和質(zhì)量及首粒黑便排出時間, Real-time PCR及Western blot法檢測便秘大鼠SCF及c-kit蛋白表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附測定法分析便秘大鼠體內(nèi)炎癥因子水平變化。結(jié)果便秘組大鼠日均糞便粒數(shù)明顯降低，便粒質(zhì)量明顯升高，首粒黑便排出時間明顯延長，且與對照組相比存在顯著差異(P<0.05); 便秘組大鼠SCF及c-kitmRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低，炎癥因子IL-1β、IL-2及IL-10水平明顯升高，且與對照組相比存在顯著差異(P<0.05)。結(jié)論SCF及c-kit蛋白調(diào)控了大鼠慢傳輸型便秘發(fā)病過程，且此過程與炎癥反應(yīng)有關(guān)。

慢性傳輸型便秘; 熒光定量PCR; 炎癥反應(yīng); 干細(xì)胞因子配體

便秘的發(fā)病原因有多方面，如生活方式的改變、遺傳因素、精神心理因素、器官動力因素等[1]。Cajal間質(zhì)細(xì)胞是腸道內(nèi)的慢波起搏細(xì)胞，參與調(diào)控了腸神經(jīng)信號的傳遞過程[2]。c-kit蛋白及其配體干細(xì)胞因子(SCF)結(jié)合后激活的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是Cajal表型發(fā)生變化的重要原因[3]。本研究分析大鼠慢傳輸型便秘發(fā)病的Cajal間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白c-kit的調(diào)控機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

清潔級SD大鼠購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，許可證號為SYXK(滬)2013-0060。所有大鼠體質(zhì)量220～240 g, 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。自由飲食，維持飼養(yǎng)環(huán)境溫度20 ℃～22 ℃, 濕度55%～65%, 光照12 h/d。復(fù)方苯乙哌啶購自常州康普藥業(yè)有限公司; 引物由上海生工合成; c-kit及SCF檢測試劑盒購自Abcam公司; β-actin蛋白檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司; IL-1β、IL-2及IL-10蛋白檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所; 7500熒光定量PCR購自ABI公司; 熒光定量PCR檢測試劑盒購自O(shè)mega公司。其余試劑為市售分析純。

1.2 分組及模型復(fù)制

24只SD大鼠隨機分為對照組和慢傳輸型便秘發(fā)病組。慢傳輸型便秘組大鼠每日皮下注射嗎啡25 mg/kg, 共45 d, 誘導(dǎo)大鼠慢傳輸型便秘發(fā)病。對照組大鼠給予等量的生理鹽水皮下注射，共45 d。

1.3 Real-time PCR檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

采用SYBR GreenI法按照Omega試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系為20 μL, 擴增程序為: 95 ℃、30 s, 93 ℃、5 s, 60 ℃、20 s, 共36個循環(huán)。SCF引物: 5′-CATGCTTTAAGGCCTTTGTCACGAG-3′, 5′-GGAGATGGCAGTTGTGCAGCTA-3′; c-kti引物: 5′-AGATGACGAGCTGGCTCTGGA-3′, 5′-CTGGCTGCCAAATCTXTGTGAA-3′; β-actin: 5′-GGCACAG TCAAGGC TGAGAATG-3′, 5′-A TGG TGG TGAAGACGCCAGTA-3′。

1.4 Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

根據(jù)待檢測蛋白質(zhì)的大小選擇合適濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳(40 μg/泳道); 電泳后剝離SDS-PAGE膠進(jìn)行半干法轉(zhuǎn)膜(PVDF膜, 100 V, 1.5 h); 轉(zhuǎn)膜后用5.0%脫脂牛奶封閉1 h; 一抗(1∶200)孵育2 h; 將PVDF膜轉(zhuǎn)入裝有磷酸鹽緩沖液的洗膜盒中，加入適量的TBST, 洗滌3次(10 min/次); 二抗(1∶200)孵育2 h; 轉(zhuǎn)入裝有磷酸鹽緩沖液的洗膜盒中洗滌3次(10 min/次); 顯影并拍照。以β-actin為內(nèi)參。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測定

IL-1β蛋白檢測試劑盒購自R&D公司; IL-2蛋白檢測試劑盒購自Abcam公司; IL-10蛋白檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。所有的檢測操作過程均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 便秘大鼠日均糞便粒數(shù)和質(zhì)量及首粒黑便排出時間分析

研究發(fā)現(xiàn)，便秘組大鼠日均糞便粒數(shù)明顯降低，便粒質(zhì)量明顯升高，首粒黑便排出時間明顯延長，與對照組相比有顯著差異(P<0.05)，見表1。

表1 便秘大鼠日均糞便粒數(shù)和質(zhì)量及首粒黑便排出時間分析

與對照組比較, *P<0.05。

2.2 Real-time PCR分析便秘大鼠SCF及c-kit蛋白表達(dá)水平

Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)便秘組大鼠SCF及c-kit的水平明顯降低，且與對照組相比有顯著差異(P<0.05), 見表2。

表2 Real-time PCR分析便秘大鼠SCF及c-kit蛋白表達(dá)水平

與對照組比較, *P<0.05。

2.3 Western blot分析便秘大鼠SCF及c-kit蛋白表達(dá)水平

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)便秘組大鼠SCF及c-kit的水平明顯降低，且與對照組相比存在顯著差異(P<0.05), 見表3、圖1。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附測定法分析便秘大鼠體內(nèi)炎癥因子水平變化

酶聯(lián)免疫吸附測定檢測發(fā)現(xiàn)，便秘組大鼠炎癥因子IL-1β、IL-2及IL-10水平明顯升高，且與對照組相比存在顯著差異(P<0.05), 見表4。

表3 Western blot分析便秘大鼠SCF及c-kit蛋白表達(dá)水平

與對照組比較, *P<0.05。

圖1 Western blot 分析便秘大鼠SCF 及c-kit 蛋白表達(dá)水平

表4 酶聯(lián)免疫吸附測定法分析便秘大鼠體內(nèi)炎癥因子水平變化

與對照組比較, *P<0.05。

3 討 論

Cajal間質(zhì)細(xì)胞是腸道慢波信號起搏細(xì)胞，參與調(diào)控了腸神經(jīng)信號傳遞過程。Cajal間質(zhì)細(xì)胞的缺失可能會引起胃腸功能的異常。便秘是臨床上常見的胃腸功能紊亂性疾病，其發(fā)病過程可能與Cajal間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)調(diào)控蛋白表達(dá)異常有關(guān)。本研究分析大鼠慢傳輸型便秘發(fā)病的Cajal間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白c-kit的調(diào)控機制時發(fā)現(xiàn)，便秘組大鼠日均糞便粒數(shù)明顯降低，便粒質(zhì)量明顯升高，首粒黑便排出時間明顯延長，且與對照組相比存在顯著差異; 便秘組大鼠SCF及c-kitmRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低，炎癥因子IL-1β、IL-2及IL-10水平明顯升高，且與對照組相比存在顯著差異。因此, SCF及c-kit蛋白調(diào)控了大鼠慢傳輸型便秘發(fā)病過程，且此過程與炎癥反應(yīng)有關(guān)。

c-kit是細(xì)胞內(nèi)典型的III型受體酪氨酸激酶，在細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等過程中均有參與。證據(jù)[4]顯示c-kit蛋白的異常表達(dá)與胃腸道功能的紊亂密切相關(guān)。在分析針刺對肝硬化大鼠胃腸動力及胃腸Cajal細(xì)胞c-kit表達(dá)影響的研究[5]中發(fā)現(xiàn)，針刺足三針能明顯改善肝硬化大鼠的小腸運動功能，增加大鼠胃腸道c-kit的含量從而改善消化道癥狀。在分析c-kit在蒽醌類瀉劑所致腸動力減退發(fā)病機制中作用的研究[6]中也證實，蒽醌類瀉劑所致腸動力減退可能與結(jié)腸組織中c-kit蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。張靜瑜等[7]也發(fā)現(xiàn)SCF/c-kit的過度激活導(dǎo)致的ICC發(fā)生變化可能是IBS的內(nèi)臟敏化發(fā)生的最為重要的基礎(chǔ)。以往的研究[8]也發(fā)現(xiàn)SCF過度激活c-kit導(dǎo)致的ICC異常電活動的重要原因。

本研究發(fā)現(xiàn)，便秘組大鼠SCF及c-kitmRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低，且與對照組相比存在顯著差異，提示二者表達(dá)異常也與便秘大鼠的發(fā)病過程密切相關(guān)。炎癥反應(yīng)是細(xì)胞內(nèi)幾乎所有病理過程的共同表現(xiàn)，其也與胃腸功能紊亂密切相關(guān)[9]。以往的研究[10]也發(fā)現(xiàn)胃腸道紊亂也與炎癥過程有明顯的相關(guān)性。在對加味六磨湯治療結(jié)直腸癌術(shù)后早期炎癥性腸梗阻的臨床研究[11]中也發(fā)現(xiàn)，加味六磨湯治療腹腔鏡結(jié)直腸癌切除術(shù)后早期炎癥性腸梗阻療效確切，可顯著改善患者便秘情況，提高臨床療效，降低不良反應(yīng)的發(fā)生，提高生存質(zhì)量。因此, SCF及c-kit蛋白調(diào)控了大鼠慢傳輸型便秘發(fā)病過程，且此過程與炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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Studyontheregulationmechanismofspecificproteinsc-kitofinterstitialcellsofCajalinthepathogenesisofslowtransitconstipationinrats

LIUZhihao1,LIShuguang2,YUXiangyang2,CHENJianli2,CAOWenbin2,ZHAOYongkui2,ZHANGGuozhi2

(1.DepartmentofGeneralSurgery,Fan′gezhuangHospitalofTangshanKailuanGeneralHospital,Tangshan,Hebei, 063108; 2.DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Hebei, 063108)

ObjectiveThe explore regulation mechanism of specific proteins c-kit of interstitial cells of Cajal in the pathogenesis of slow transit constipation in rats.MethodsSlow transit constipation in rat model was duplicated by injections of morphine (25 mg/kg, 45 d). The number and weight of fecal granule were assayed. Daily average number of fecal particles, quality, and the time for first black discharge were analyzed. At the same time, the c-kit and SCF expression were detected by Real-time PCR and Western blot. The changes of inflammatory factors such as IL-1β, IL-2 and IL-10 were also detected by ELISA.ResultsDaily average number of fecal particles in constipation group was decreased, quality was higher, and the first time for first black discharge was prolonged, which showed significant differences (P<0.05). The expression levels of c-kit and SCF were decreased significantly, and levels of inflammatory factors IL-1β, IL-2 and IL-10 were higher in constipation rats than the controls (P<0.05).ConclusionThe pathogenic progress of slow transit constipation rats are regulated, which is also related with inflammatory reactions.

slow transit constipation rats; fluorescent quantitative PCR; inflammatory reaction; stem cell factor ligands

2017-06-22

河北省衛(wèi)生廳項目(20150517)

張國志

R 442.2

A

1672-2353(2017)23-043-03

10.7619/jcmp.201723013