低溫保存對(duì)生物樣本及其生物大分子的影響

梁 瑋 王美霞 劉寶林?

1（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所，上海 200093）

2（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院環(huán)境與兒童健康教育部和上海市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200092）

低溫保存對(duì)生物樣本及其生物大分子的影響

梁 瑋1，2王美霞1劉寶林1?

1（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所，上海 200093）

2（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院環(huán)境與兒童健康教育部和上海市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200092）

生物樣本庫(kù)在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中的作用日趨重要，基于生物樣本庫(kù)的研究成果層出不窮，極大地推動(dòng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展。生物樣本庫(kù)中樣本保存的質(zhì)量對(duì)研究結(jié)果的可靠性有較大影響，如何保存高質(zhì)量的樣本是生物樣本庫(kù)研究的關(guān)鍵問題之一。低溫保存技術(shù)可以保持樣本的活性，若將其用于生物樣本庫(kù)，不僅能夠保存樣本完整的分子信息，還能保持樣本的活性，對(duì)生物樣本庫(kù)的發(fā)展具有里程碑式的意義。綜述低溫保存方法對(duì)樣本的損傷（尤其是生物大分子的損傷）以及減小這些損傷的技術(shù)與方法，為提高生物樣本的保存質(zhì)量提供指導(dǎo)性建議。

生物樣本庫(kù)；低溫保存技術(shù)；低溫?fù)p傷

引言

生物樣本庫(kù)主要是指收集和應(yīng)用健康及疾病生物體的生物分子、細(xì)胞、組織和器官等，包括人體器官、組織、體液或處理過(guò)的樣本（DNA、RNA、蛋白等），以及與這些樣本相關(guān)的臨床資料、質(zhì)控、管理等生物應(yīng)用系統(tǒng)［1］。

在醫(yī)學(xué)研究中，生物樣本是聯(lián)系分子信息與疾病的橋梁。根據(jù)使用目的的區(qū)別，樣本的保存要求也會(huì)有所差別。用于分子標(biāo)記物提取的樣本需要RNA、DNA、蛋白質(zhì)等分子信息保存完好，保存過(guò)程中未發(fā)生降解。例如RNA的RIN值是評(píng)判RNA質(zhì)量的黃金標(biāo)準(zhǔn)，代表了RNA的完整性，一般需要RNA的RIN值大于7才可以用于表達(dá)譜測(cè)序和芯片分析。組織切片樣本一般對(duì)生物大分子的保存效果不及冷凍，但是可以用于制備組織芯片，進(jìn)行高通量的免疫組化、原位雜交、DNA、RNA和蛋白質(zhì)的定位分析及檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)研究。此外，病人的病史、病理記錄還有術(shù)后的隨訪記錄，都是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的寶貴資源，為研究結(jié)果的分析提供合理必要的參考。保存使用記錄，可以讓使用者了解樣本質(zhì)量變化的可能誘因，有助于實(shí)現(xiàn)樣本研究資源共享。生物樣本庫(kù)就是儲(chǔ)存了各種樣本及臨床信息的一個(gè)機(jī)構(gòu)或組織，為藥物研發(fā)、個(gè)性化醫(yī)療等轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究提供高質(zhì)量的病理、保存和使用記錄都完整的樣本［2］。樣本的質(zhì)量直接決定了研究結(jié)果的可靠性［3］，樣本保存和使用的每一個(gè)環(huán)節(jié)都直接影響樣本的質(zhì)量，如組織的冷缺血時(shí)間、樣本的保存條件、保存時(shí)間、保存方法和使用管理等。本研究主要從保存溫度和保存方法的角度來(lái)進(jìn)行綜述。

目前應(yīng)用于生物樣本庫(kù)的保存溫度有室溫、4℃、-20℃、-80℃和液氮。

1）室溫：一般室溫可以保存固定的組織切片，但若要長(zhǎng)期保存也應(yīng)放入-20℃；用于提取RNA的樣本也可以用RNAlater?在室溫下保存。

2）4℃：可以短時(shí)間保存一些待處理的血液、DNA等樣本。

3）-20℃：較長(zhǎng)時(shí)間保存提取的DNA樣本。

4）RNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞和組織樣本需要保存在-80℃或者液氮中。

通常所講的生物樣本庫(kù)主要保存的都是生物分子信息，并不要求樣本保持活性。廣義來(lái)講，永生細(xì)胞庫(kù)、臍血庫(kù)、精子庫(kù)等也可列入生物樣本庫(kù)的范疇，但是它們要求保存的樣本能夠用于再生或疾病治療等目的，因此保存的樣本要求具有活性，其所采用的技術(shù)叫做低溫保存技術(shù)。下面將對(duì)低溫保存技術(shù)用于生物樣本庫(kù)的理論基礎(chǔ)和相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 低溫保存技術(shù)簡(jiǎn)介

1.1 低溫保存的原理

在生物和醫(yī)學(xué)范疇內(nèi)，低溫指從稍低于正常體溫（37℃）到-196℃。低溫能抑制生物體的生化活動(dòng)，在此范圍內(nèi)，生命活動(dòng)代謝速度隨著溫度的降低而降低，到達(dá)-196℃幾乎完全停止［4］。

生物體雖然在低溫下可以長(zhǎng)時(shí)間保存，卻極容易在降溫和復(fù)溫過(guò)程中受溶液凍結(jié)、融化和溶液滲透壓變化的影響而損傷［4］。這種低溫?fù)p傷主要發(fā)生在-60℃ ～0℃這段溫度范圍。為了避免這些損傷，使樣本存活，需要在降溫前加入適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑，如甘油、二甲亞砜（Me2SO）等，并針對(duì)不同的保存對(duì)象設(shè)計(jì)特定的降溫和復(fù)溫程序。

1972年，Mazur等首先從中國(guó)倉(cāng)鼠組織培養(yǎng)細(xì)胞的低溫試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析中提出冷凍損傷的兩因素假說(shuō)［5］。他的理論認(rèn)為，有兩個(gè)獨(dú)立因素導(dǎo)致冷凍損傷：一是胞內(nèi)冰的形成，冷卻速度越快，此損傷越大；另一是溶質(zhì)損傷，細(xì)胞在高濃度的溶液中暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而遭損傷，冷卻速度越慢，此損傷越大。Mazur還導(dǎo)出了一系列的方程來(lái)計(jì)算冷卻過(guò)程細(xì)胞內(nèi)水含量。經(jīng)過(guò)后續(xù)研究者的不斷發(fā)展完善，這些方程已經(jīng)成為細(xì)胞低溫保存的基礎(chǔ)理論。兩因素?fù)p傷說(shuō)至今仍是理解細(xì)胞損傷的重要理論基礎(chǔ)，然而多年的研究表明，細(xì)胞損傷并不只是這兩個(gè)因素造成的。有研究表明，冰、基質(zhì)和細(xì)胞的熱膨脹性差異及其機(jī)械應(yīng)力也很可能是細(xì)胞損傷的原因［6-7］，而且細(xì)胞損傷還牽涉到很多生物分子層面的因素。

1.2 低溫保存技術(shù)的種類

所有的低于體溫（37℃）的保存都可稱為低溫保存，如各種生物樣本在4℃冰箱和冰上的冷藏，直接將樣本凍存到-20℃或-80℃冰箱或直接投入液氮。而通常所講的低溫保存技術(shù)主要指為了保存活的細(xì)胞、組織和器官等，通過(guò)添加保護(hù)劑進(jìn)行凍存的方法。主要有兩種方法，一種是慢速冷凍低溫保存法，另一種是玻璃化凍存法［8-9］。

慢速冷凍低溫保存法［10］的具體步驟是：先將細(xì)胞放在冷凍保護(hù)劑溶液中進(jìn)行預(yù)處理，然后用程序降溫儀以較慢的速度降溫。細(xì)胞外溶液中水分結(jié)冰使溶液的濃度升高，胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞膜，細(xì)胞體積收縮，胞內(nèi)溶液濃度升高；隨著溫度的降低，上述過(guò)程持續(xù)進(jìn)行，到達(dá)一定的低溫后，再快速降到液氮溫度，并長(zhǎng)期保存在此溫度。此過(guò)程是傳熱和滲透兩個(gè)因素相互作用的過(guò)程，因此對(duì)于每一個(gè)冷凍對(duì)象，都有一個(gè)最佳冷卻速率使二者達(dá)到最好的配合。

玻璃化凍存法［11］研究的重點(diǎn)是尋求容易實(shí)現(xiàn)玻璃化，并且對(duì)細(xì)胞損害較小的溶液和提高冷卻速率。該法的具體步驟一般是將細(xì)胞置于高濃度保護(hù)劑溶液，然后迅速投入液氮。保護(hù)劑溶液的配方、投入液氮前的平衡程序及復(fù)溫洗脫程序是研究的關(guān)鍵。

1.3 低溫保存技術(shù)的應(yīng)用

目前，低溫保存技術(shù)主要應(yīng)用于細(xì)胞、組織和器官的低溫保存，如干細(xì)胞、血紅細(xì)胞的保存，精子、卵母細(xì)胞的保存，胚胎、皮膚等組織的保存等。器官目前還很難實(shí)現(xiàn)在低溫下長(zhǎng)期凍存，但是器官移植時(shí)也需要將待植入的器官用特殊的保存液（如HTK、UW）［12-16］進(jìn)行短時(shí)間的保存，以對(duì)抗低溫帶來(lái)的器官損傷。目前樣本庫(kù)以保存分子標(biāo)記物為目的，還是使用直接凍存法保存樣本，本課題組正在試驗(yàn)研究低溫保存技術(shù)在生物樣本庫(kù)的應(yīng)用。

1.4 低溫保存技術(shù)存在的問題

低溫保存技術(shù)雖然可以使細(xì)胞、某些組織和器官等保存成活，但是仍然存在一些亟待解決的問題：主要是低溫保存引起的結(jié)構(gòu)及功能上的損傷和改變，還有其蘊(yùn)含的生物分子信息也有可能發(fā)生改變；其次低溫保存對(duì)場(chǎng)地、設(shè)備、資金和管理方面的要求比較高等也是該技術(shù)應(yīng)用面臨的問題。

2 低溫保存對(duì)樣本的影響

生物樣本庫(kù)中用于提取生物大分子的組織樣本一般直接投入液氮，并儲(chǔ)藏在液氮或者-80℃冰箱。目前認(rèn)為低溫下基本不會(huì)發(fā)生生物大分子的降解，樣品可以用于各種分子檢測(cè)。但是，由于RNA與蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性，長(zhǎng)時(shí)間保存也可能帶來(lái)不同程度的降解。

添加低溫保護(hù)劑保存可以使細(xì)胞保持活性，但是由于冰晶損傷、滲透壓損傷及保護(hù)劑等外來(lái)物質(zhì)的添加，不可避免會(huì)給細(xì)胞帶來(lái)一定程度的損傷。這些損傷可以是形態(tài)上的，也可以是功能上的，還可以是細(xì)胞內(nèi)生物大分子的降解或突變等。

本研究中，將目前樣本庫(kù)不添加保護(hù)劑直接凍存的方法稱為直接凍存法，將可以保存細(xì)胞組織活性的兩種方法分別稱為慢速冷凍法與玻璃化法。

2.1 低溫對(duì)細(xì)胞、組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能的影響

在低溫保存過(guò)程中，由于冰晶的形成和滲透壓的改變，會(huì)引起細(xì)胞膜的受損和皺縮，進(jìn)而也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞、組織形態(tài)和功能發(fā)生改變。大量實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞膜和細(xì)胞器的受損與胞內(nèi)冰晶的形成具有很大關(guān)系［17］。而樣本庫(kù)目前采用的直接凍存法會(huì)破壞細(xì)胞膜，使細(xì)胞和組織喪失正常的功能，此處不再加以探討。

陳若平等以二甲亞砜為抗凍劑，在液氮中超低溫保存兔、狗、人的膽道組織［18］，以37℃體外培養(yǎng)作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)保存3個(gè)月、1年病理檢查膽道各組織及細(xì)胞的結(jié)構(gòu)良好，無(wú)變性、壞死，膽道黏膜上皮細(xì)胞存活、無(wú)脫落。Martínez-Burgos等比較了玻璃化和慢速冷凍保存卵母細(xì)胞的效果，認(rèn)為玻璃化冷凍可以讓卵母細(xì)胞更快恢復(fù)體積，并使紡錘體結(jié)構(gòu)保存得更完好［19］。總之，通過(guò)改進(jìn)保護(hù)液的配方和冷凍保存的方法，可以減少低溫帶來(lái)的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能上的損傷。

2.2 低溫對(duì)生物大分子的影響

低溫保存技術(shù)對(duì)生物大分子的影響直接決定了該技術(shù)能否應(yīng)用于生物樣本庫(kù)。只要生物樣本置于低于正常生理溫度的環(huán)境下，都會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生寒冷刺激，這種來(lái)自外界的刺激會(huì)對(duì)細(xì)胞正常的生理代謝產(chǎn)生影響，從而影響生物大分子的質(zhì)量或表達(dá)，只是由于溫度高低和時(shí)間長(zhǎng)短的不同，影響大小會(huì)有差異。從分子水平來(lái)看，冷凍對(duì)膜磷脂、蛋白質(zhì)和核酸的影響是通過(guò)改變疏水和親水反應(yīng)決定的結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的［20］。

2.2.1 低溫對(duì)DNA的影響

對(duì)生物樣本中DNA的關(guān)注集中在基因信息的完整性與突變，目前認(rèn)為直接凍存法能比較好地保存DNA信息。張佳年等的研究表明，生物樣本庫(kù)中保存的腫瘤組織保存5年之內(nèi)，DNA分子的完整性與質(zhì)量均未受影響［21］。宋博等采用改進(jìn)后的單細(xì)胞凝膠電泳（SCGE），對(duì)-80℃條件下保存不同時(shí)間的精子DNA進(jìn)行分析，認(rèn)為冰凍對(duì)精子質(zhì)量無(wú)顯著影響［22］。而Fairbairn等的研究認(rèn)為，直接冰凍會(huì)使組織DNA受損，但是儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)并不會(huì)引起損傷加?。?3］。Ross等的研究則認(rèn)為，血液樣本直接凍存在-70℃后再提取DNA比提取DNA后再凍存產(chǎn)量要減少25%［24］。因此，根據(jù)儲(chǔ)藏對(duì)象的不同，直接凍存法對(duì)DNA的影響還是存在差異的。

關(guān)于玻璃化和慢速冷凍法對(duì)DNA帶來(lái)的影響研究較多的是精子的DNA完整性。雖然多數(shù)研究都認(rèn)為在冷凍過(guò)程中精子的DNA完整性受到了損傷，并且這一損傷與細(xì)胞膜的完整性和活性損傷有很大關(guān)聯(lián)［25］，但是可以通過(guò)保存方法的改進(jìn)來(lái)減小損傷。

2.2.2 低溫對(duì)RNA的影響

直接凍存法與凍存時(shí)間對(duì)RNA的影響研究也是主要集中在完整性上，普遍認(rèn)為保存較長(zhǎng)時(shí)間后會(huì)發(fā)生降解，并且和保存對(duì)象的特征有關(guān)。張佳年等認(rèn)為，RNA與蛋白質(zhì)分子在低溫保存1～2年內(nèi)尚不影響癌基因表達(dá)的分析結(jié)果，但低溫保存3年或以上的標(biāo)本中RNA及蛋白質(zhì)均有不同程度降解［21］。路俊鋒等的研究認(rèn)為，直接凍存法（離體30min內(nèi)直接放入-80℃冰箱）保存的腦膠質(zhì)瘤組織比瘤周組織RNA的降解程度?。?6］，這說(shuō)明同樣的保存方法對(duì)不同組織RNA具有不同的保存效果。Olivier等研究表明，RNA儲(chǔ)存在-140℃，RIN值變化與時(shí)間長(zhǎng)短之間無(wú)顯著關(guān)系［27］。而在-80℃儲(chǔ)藏8個(gè)月后，濃度為250 ng/μL時(shí)RNA的完整性完好，而濃度為25 ng/μL時(shí)顯著降解。Botling等評(píng)估了復(fù)溫對(duì)直接凍存的組織樣本中RNA的完整性和基因表達(dá)的影響，認(rèn)為RNAlater能更有效地阻止RNA的降解，而冷凍組織復(fù)溫后30min以上會(huì)發(fā)生較大程度的降解，并伴有FOS和BCL-2基因表達(dá)的變化［28］。

Terry等用含10%Me2SO的UW慢速冷凍原代肝細(xì)胞，-140℃儲(chǔ)存2周，采用基因芯片分析96個(gè)細(xì)胞黏附相關(guān)的基因表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)有22個(gè)RNA冷凍后降解，包括整合素、鈣粘素、連環(huán)素、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等［29］。Riesco等研究了玻璃化法凍存的斑馬魚精子和人類精子的RNA損傷，發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白基因（hsp70、hsp90）表達(dá)的上調(diào)和cxcr4b、pou5f1、vasa、sox2 等基因表達(dá)的下調(diào)［30］。Karimi-Busheri等比較了肺癌和乳腺癌的3種細(xì)胞系在長(zhǎng)時(shí)間凍存后分子完整性的變化，發(fā)現(xiàn)凍存復(fù)溫后的細(xì)胞周期、分裂等相關(guān)通路的基因表達(dá)有所改變［31］，這與細(xì)胞類型有關(guān)。

2.2.3 低溫對(duì)蛋白質(zhì)的影響

低溫對(duì)蛋白質(zhì)的影響比較大，有針對(duì)酶功能、二級(jí)結(jié)構(gòu)、表達(dá)量等多方面的研究，多數(shù)認(rèn)為低溫會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)帶來(lái)一定的影響。

MMP-9（基質(zhì)金屬蛋白酶-9），是一種在臨床研究中用于檢測(cè)心血管風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志物，Rouy等發(fā)現(xiàn)血漿儲(chǔ)藏在-80℃，MMP-9會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生降解，24個(gè)月后下降到 65%，43個(gè)月后下降到 1%［32］。

王尚乾通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫印跡兩種方法，驗(yàn)證了慢速冷凍法凍存復(fù)蘇后人精子的烏頭酸水合酶（ACO2）表達(dá)下降，發(fā)生了降解，使得下游產(chǎn)物異檸檬酸的產(chǎn)量下降，三羧酸循環(huán)受抑制導(dǎo)致ATP的產(chǎn)生下降，精子活力受損［33］。Wolkers 等［34］用傅里葉紅外光譜技術(shù)（FTIR）對(duì)紅細(xì)胞冷藏后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，認(rèn)為血紅蛋白在冷藏過(guò)程中二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，未發(fā)生改變。他們隨后又用該技術(shù)對(duì)前列腺腫瘤細(xì)胞LNCaP進(jìn)行了冷凍過(guò)程的研究，認(rèn)為蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的損傷是可逆的，在復(fù)溫后又恢復(fù)原來(lái)的結(jié)構(gòu)［20］。而Mazur等認(rèn)為，冷凍時(shí)細(xì)胞內(nèi)的蛋白由于暴露在高濃度的溶液中會(huì)發(fā)生不可逆的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變［35］。蛋白會(huì)由于ROS的產(chǎn)生受到自由基影響，還會(huì)由于在冷凍復(fù)溫過(guò)程中溶酶體膜破裂釋放出的蛋白酶而降解［36］。Feridoun等的研究結(jié)果也表明，凍存后的肺癌和乳腺癌細(xì)胞表面蛋白表達(dá)量下調(diào)［31］。

一些蛋白質(zhì)可能會(huì)在很低的溫度下（小于-80℃）保持活性。因此，當(dāng)生物樣本貯存在水還具有流動(dòng)性且蛋白也具有活性的溫度下時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致其降解［37］。

2.2.4 低溫對(duì)脂類的影響

脂類物質(zhì)作為生物標(biāo)記物用于分子診斷等檢測(cè)的主要是游離脂肪酸，侯文華等的研究認(rèn)為，血清樣本4℃下放置4 h血清游離脂肪酸濃度與即刻結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而放置8、24、48 h后均明顯升高，-20℃冷凍條件下放置24 h后血清游離脂肪酸濃度與即時(shí)結(jié)果之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而放置48 h后與即時(shí)濃度之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［38］。

細(xì)胞膜主要是由雙層磷脂膜構(gòu)成，當(dāng)希望保存完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)時(shí)就必須考慮低溫對(duì)脂肪帶來(lái)的影響，并且冷凍造成的脂類物質(zhì)的變化可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生存環(huán)境的變化。

冷凍會(huì)改變脂肪的物理狀態(tài)，從而改變其組織結(jié)構(gòu)和流動(dòng)性，因此細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化。Wolkers的團(tuán)隊(duì)對(duì)冷凍和冷藏時(shí)細(xì)胞磷脂膜的損傷做了深入的研究，發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞在4℃冷藏5天后，會(huì)出現(xiàn)多重急劇的膜相轉(zhuǎn)移，這說(shuō)明膜磷脂發(fā)生了相分離［34］。圖1簡(jiǎn)單描述了在冷卻過(guò)程中膜相位變化的過(guò)程：膜由磷脂雙分子層組成，包括親水性頭基和疏水性?；湣Ｔ谡Ｉ?xiàng)l件下，膜處于流體液晶相中，雙糖類的溶質(zhì)不能滲透，而水可以自由通過(guò)細(xì)胞膜。冷卻會(huì)導(dǎo)致膜的流動(dòng)性降低，這可能與胞內(nèi)溶質(zhì)的流失和膜構(gòu)象不可逆的改變有關(guān)，從而削弱細(xì)胞的功能。當(dāng)細(xì)胞外形成冰晶，未凍區(qū)域的溶質(zhì)濃度增加，水按照滲透壓梯度傳輸，從而導(dǎo)致細(xì)胞脫水。由于磷脂頭基水的缺失，并隨著CH基團(tuán)與?；溨g范德華相互作用力的增長(zhǎng)，磷脂被緊緊包埋在一個(gè)所謂的凝膠相中，此時(shí)具有OH基團(tuán)的糖類就可以取代脫水細(xì)胞膜上的水，當(dāng)滿足特定的水含量和溫度就能夠?qū)崿F(xiàn)玻璃化。Brouwers等認(rèn)為，由于冷凍會(huì)導(dǎo)致酶活性降低，無(wú)法啟動(dòng)活性氧的清除反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和脂肪都暴露于活性氧當(dāng)中，活性氧會(huì)導(dǎo)致脂肪發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，而磷脂發(fā)生去酯化反應(yīng)［40］。Bischof等對(duì)AT-1 Dunning前列腺腫瘤細(xì)胞冷凍殺傷進(jìn)行了研究，表明冷凍對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)膜帶來(lái)了損傷，會(huì)造成游離脂肪酸的累積［36］。

圖1 冷卻過(guò)程中發(fā)生的膜相位變化［39］Fig.1 Schematic illustration of membrane phase changes that occur during cooling.

3 低溫保護(hù)劑的保護(hù)作用

3.1 低溫保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞、組織、器官結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)作用

在冷凍保存時(shí)加入低溫保護(hù)劑可以抑制冰晶的生成，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，維持細(xì)胞的正常功能。Sar??zkan 等［41］的研究認(rèn)為，在小鼠精子經(jīng)受寒冷損傷時(shí)，添加棉籽糖、海藻糖和果糖有助于維持精子能動(dòng)性和完整形態(tài)，并且棉籽糖在保護(hù)精子能動(dòng)性方面作用更為明顯。雙糖和三糖可能比單糖更有效，是因?yàn)樗鼈冊(cè)黾訚B透脫水的能力更強(qiáng)。Sandhya等的研究表明，低濃度（0.2M）的海藻糖對(duì)干細(xì)胞的保護(hù)效果非常好，但是要在細(xì)胞內(nèi)外共同作用，使用海藻糖與Me2SO凍存TF-1細(xì)胞，細(xì)胞的形狀、表型特征都沒有明顯改變［42］。用海藻糖冷凍線粒體可以保留其大部分結(jié)構(gòu)和功能，包括超微結(jié)構(gòu)、外膜的完整性、ATP的合成能力、鈣介導(dǎo)的腫脹、跨膜電勢(shì)、蛋白質(zhì)前體的輸入與合成等［43-44］。

3.2 低溫保護(hù)劑對(duì)生物大分子的保護(hù)作用

低溫保護(hù)劑的加入不僅可以保障生物樣本的存活，也對(duì)生物大分子具有一定的保護(hù)作用。Sar??zkan等對(duì)棉籽糖、海藻糖和果糖在小鼠精子4℃冷藏時(shí)的作用進(jìn)行了研究，認(rèn)為3種糖都有助于保護(hù)DNA的完整性［41］。還有一些研究者對(duì)冷凍保護(hù)劑中添加抗氧化劑的效果進(jìn)行了研究，認(rèn)為添加適量的VE、Vc、白藜蘆醇等抗氧化劑，可以減少精子在深低溫保存過(guò)程中發(fā)生的 DNA損傷［45-46］。Chong等的研究認(rèn)為，玻璃化凍存人腦膠質(zhì)瘤腫瘤起始細(xì)胞，不僅可以保留細(xì)胞的生物表型，還能保留腫瘤細(xì)胞基因特性［47］，他們用基因芯片、qPCR、染色體表型分析、流式細(xì)胞術(shù)等方法證明了這一觀點(diǎn)。本課題組對(duì)比了使用海藻糖和Me2SO做聯(lián)合保護(hù)劑、Me2SO做保護(hù)劑和直接凍存的細(xì)胞中若干凋亡基因表達(dá)的變化，認(rèn)為海藻糖能夠起到保護(hù)某些凋亡基因表達(dá)水平的作用。

4 其他保存方法對(duì)生物樣本質(zhì)量的影響

實(shí)現(xiàn)保存生物樣本的目的，不僅有低溫保存這一方法，所要考慮的也不僅是保存這一過(guò)程，學(xué)者們從不同的角度出發(fā)，對(duì)可應(yīng)用于保存樣本的各種方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

近幾年還有一種新興的保存方法叫做等溫玻璃化，是將樣品置于高濃度的糖、多元醇及有機(jī)聚合物中，在室溫下進(jìn)行干燥處理，過(guò)程中不會(huì)結(jié)冰，但生化反應(yīng)停止，作為標(biāo)記物的蛋白質(zhì)可以免受低溫?fù)p傷，二級(jí)結(jié)構(gòu)保存完好［48］。Solivio等報(bào)道了一種靜電紡絲低溫保護(hù)劑基質(zhì)，可用于液體樣本的等溫玻璃化儲(chǔ)藏，5種腫瘤標(biāo)記物的保存效果表明，LDH、CRP和PSA的表達(dá)水平在復(fù)水后完全恢復(fù)，而MMP-7和C3a能夠恢復(fù)90%［49］。

組織從手術(shù)切割下來(lái)到冷凍期間的冷缺血時(shí)間，對(duì)樣本質(zhì)量的影響很大。Condelli等評(píng)估了一種真空冷卻系統(tǒng)的效果，對(duì)存儲(chǔ)在4℃真空下的隨機(jī)篩選組織的形態(tài)、抗原決定基穩(wěn)定性和RNA完整性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，認(rèn)為真空冷卻系統(tǒng)是一種行之有效的組織轉(zhuǎn)運(yùn)方法［50］。

5 小結(jié)

樣本的采集、處理和保存都對(duì)樣本的質(zhì)量有著重要的影響，在本文中，對(duì)冷凍保存這一過(guò)程對(duì)樣本的影響進(jìn)行了綜述，期望能夠?yàn)榈蜏乇４婕夹g(shù)在生物樣本庫(kù)的應(yīng)用提供理論參考。細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的生命體系，冷凍對(duì)其功能與結(jié)構(gòu)造成的影響是相互關(guān)聯(lián)的，也與各種生物大分子的結(jié)構(gòu)和含量變化有著不可分割的聯(lián)系。在生物樣本庫(kù)中合理使用冷凍保存技術(shù)，并對(duì)保護(hù)劑配方及保存方法進(jìn)行優(yōu)化，將對(duì)保證樣本質(zhì)量、推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展起到重要作用。

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The Effect of Cryopreservation on Biospecimens and Biomacromolecules

Liang Wei1，2Wang Meixia1Liu Baolin1?

1（Institute of Biothermal Science and Technology，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai200093，China）

2（Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine，MOE-Shanghai Key Laboratory of Children’s Environmental Health，Shanghai200092，China）

The role of biobanking in modern medical research is becoming more and more important with the endless achievements based on biobanks，which greatly promotes the development of translational medicine.The qualities of the specimens from biobanks have a great effect on the reliability of the researches.So how to guarantee the qualities of the samples is the key of the research on biobanks.Cryopreservation technology can maintain the viability of the specimens，which will play a significant role in the development of biobanks if preserving the complete molecular information and maintaining the viabilities of the specimens.The damage which freezing or cold brings to the specimens（especially to the biological macromolecules of the samples）and how to reduce these damages are reviewed in this article.

biobank；cryopreservation；cold injury

R318 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0258-8021（2017）05-0615-07

10.3969 /j.issn.0258-8021.2017.05.015

2016-10-25，錄用日期：2017-02-09

（國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目51076108）

?通信作者（Corresponding author），E-mail：blliuk@163.com