穴位埋線對(duì)實(shí)驗(yàn)自身免疫性葡萄膜炎大鼠眼部炎癥影響的研究

趙建英 郝小波 鄭鳳鳴 黃素珍 吳含青 郭大東

穴位埋線對(duì)實(shí)驗(yàn)自身免疫性葡萄膜炎大鼠眼部炎癥影響的研究

趙建英1郝小波1鄭鳳鳴2黃素珍3吳含青4郭大東5

目的探討穴位埋線療法對(duì)治療EAU大鼠眼部炎癥情況的影響變化。方法Lewis大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組3只、EAU組24只和穴位埋線(ACE)組24只。除對(duì)照組外,均使用光感受器間維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)免疫造模形成EAU組,ACE組為造模成功后次日進(jìn)行穴位埋線,分別觀察眼前段炎癥變化并記錄免疫后9d、13d、18d及23d不同時(shí)間段的眼部房水蛋白量。結(jié)果造模后13d是炎癥的高峰期,該時(shí)段模型鼠眼前段炎癥及房水蛋白量均達(dá)到高峰,EAU組房水蛋白濃度為41.15±3.91mg/ml,ACE組13d房水蛋白濃度為21.85±1.70mg/m;不僅如此,在觀察的4個(gè)時(shí)間段中,ACE組房水蛋白量均低于EAU組(P<0.01)。結(jié)論穴位埋線療法能減輕EAU大鼠眼前段炎癥反應(yīng),同時(shí)還可以減輕由于眼前段炎癥導(dǎo)致的房水蛋白量的急劇升高,因此該療法在調(diào)節(jié)免疫狀態(tài)方面是一種有積極有效的綠色療法。

穴位埋線; 自身免疫性葡萄膜炎; 實(shí)驗(yàn); 大鼠; 房水蛋白

葡萄膜炎是一種多發(fā)于青壯年的眼病,在致盲眼病中占有重要地位,已引起世界范圍內(nèi)的重視[1]。由于該病是一種自身免疫性眼病,治療上以免疫抑制療法為主,包括激素和激素替代治療,長期使用副作用明顯[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥觀點(diǎn)認(rèn)為,免疫系統(tǒng)是機(jī)體陰陽平衡的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。臨床發(fā)現(xiàn)運(yùn)用穴位埋線療法對(duì)葡萄膜炎免疫調(diào)節(jié)有一定的治療作用[3,4],因此借助于廣泛應(yīng)用于人類自身免疫性葡萄膜炎發(fā)病機(jī)理及藥物治療的研究[5,6]的動(dòng)物模型——視網(wǎng)膜蛋白作為抗原誘發(fā)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(Experimental autoimmune uveitis,EAU)來進(jìn)行試驗(yàn)研究,本研究旨在研究穴位埋線(Acupoint catgut embedding,ACE)對(duì)EAU大鼠眼部炎癥的影響,為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及喂養(yǎng)

6～8周齡雌性SPF級(jí)Lewis大鼠,體重140～160g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,大鼠許可證號(hào):SCXK(京)2017-0001)。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院試驗(yàn)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)研究方案、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的應(yīng)用及喂養(yǎng)均得到廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有動(dòng)物均按照視覺與眼科學(xué)研究學(xué)會(huì)中對(duì)動(dòng)物進(jìn)行眼科與視覺研究實(shí)驗(yàn)的要求飼養(yǎng)與處理。

1.2 主要試劑及儀器

埋線材料及主要實(shí)驗(yàn)試劑、儀器:埋線材料由北京任曉艷穴位埋線醫(yī)療研究中心提供(專利號(hào):2004200665990,京藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2005第2270643號(hào),京藥管械生產(chǎn)許20040062號(hào));光感受器間維生素A結(jié)合蛋白[IRBP,1177-1191,氨基酸序列:ADGSSWEGVGVVPDV,(上海生工生物工程股份有限公司合成)];結(jié)核菌素[tuberculin,TB(美國Difco公司)];CFA[完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)];數(shù)碼眼前節(jié)照相(日本TOPCON公司);K5600超微量分光光度計(jì)(北京凱奧科技發(fā)展有限公司)。

1.3 方法

動(dòng)物分組與造膜 分組: 將51只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表將隨機(jī)分為空白對(duì)照組3只(注射生理鹽水),模型組(造模后無任何干預(yù)措施),穴位埋線組(造模后第2天經(jīng)行穴位埋線),每組各24只。造模: Lewis大鼠在裂隙燈下排除其他眼部疾病,在動(dòng)物房飼養(yǎng)1周后進(jìn)行造模。參照文獻(xiàn)[7-9]方法按每只IRBP(光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白)100ug,TB(結(jié)核桿菌)100ug,CFA(完全弗氏佐劑)150ul,PBS(磷酸緩沖鹽溶液)150ul制備乳糜液。注射麻醉后分別于大鼠雙后足墊及脊柱正中兩旁皮下,共4個(gè)部位建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎動(dòng)物模型(EAU)。②穴位埋線 大鼠穴位的選擇依據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》及華興邦等所著大鼠穴位圖譜[10,11]。分別選取脾俞:第12胸椎下兩旁,肋間,左右側(cè)各一穴;腎俞:第2腰椎下兩旁,左右側(cè)各一穴。③選穴 首先對(duì)照大鼠解剖圖譜選取相應(yīng)穴位,尓后將大鼠麻醉后處死進(jìn)行解剖學(xué)上進(jìn)一步確認(rèn)的前期準(zhǔn)備,最終選取穴位后標(biāo)記。④消毒 進(jìn)針前該區(qū)域備皮及碘伏消毒。⑤進(jìn)針 將1cm左右羊腸線推入相應(yīng)穴位皮下至肌層,線頭不外露,無菌棉簽按壓針孔處止血。每穴1 針。⑥注意事項(xiàng) 埋線后立即更換干燥清潔墊料。⑦EAU大鼠眼部炎癥觀察及組織病理學(xué)檢查 免疫后每天定時(shí)通過數(shù)碼眼前節(jié)照相機(jī)觀并記錄察EAU組和埋線組大鼠眼部炎癥情況。參照文獻(xiàn)[12]方法對(duì)眼部炎癥進(jìn)行分級(jí)。⑧EAU大鼠房水蛋白測量及血清白蛋白、球蛋白檢驗(yàn) 大鼠均在第9d、13d、18d、23d分別給予前房穿刺,虹吸管收集房水,分別注入無菌EP管中,使用K5600超微量分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白濃度檢測;同時(shí)經(jīng)心臟取血,保存于肝素涂抹的EP管,收集外周血樣本,以3000 r/min,4°離心3min,取上清液,-80°保存待測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 EAU大鼠眼部炎癥變化(圖1)

通過數(shù)碼眼前節(jié)照相機(jī)觀察發(fā)現(xiàn),免疫后5d EAU組和ACE組大鼠開始出現(xiàn)虹膜血管輕度擴(kuò)張、充血,造模成功后次日進(jìn)行穴位埋線治療。免疫后5d兩組大鼠眼部均出現(xiàn)明顯的炎癥表現(xiàn),如虹膜血管輕、中度擴(kuò)張充血、瞳孔縮小及前房混濁,9dEAU組大鼠炎癥評(píng)分為2.667±0.577,ACE組大鼠炎癥評(píng)分為1±0.5774;12d兩實(shí)驗(yàn)組大鼠均出現(xiàn)最嚴(yán)重眼部炎癥表現(xiàn),如虹膜嚴(yán)重充血、前房大量纖維蛋白滲出、瞳孔膜閉等,EAU組大鼠炎癥評(píng)分為3.667±0.5774,ACE組大鼠炎癥評(píng)分為1.333±0.5774,隨后炎癥反應(yīng)逐漸減輕,至免疫后20d炎癥基本消退。

圖1 同一時(shí)間段與埋線組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.2 EAU大鼠房水蛋白變化

房水蛋白定量分析顯示,空白對(duì)照組大鼠房水蛋白濃度為2.03±0.33 mg/ml,免疫后9d,EAU組房水蛋白濃度為12.97±2.86mg/ml,ACE組為7.63±0.35mg/ml;免疫后13d房水蛋白量相對(duì)達(dá)到高峰,EAU組房水蛋白濃度為41.15±3.91mg/ml,埋線組為21.85±1.70mg/ml,隨后房水蛋白濃度開始下降,免疫后18dEAU組房水蛋白濃度為19.03±6.20mg/ml,ACE組為11.69±4.34mg/ml;免疫后23dEAU組房水蛋白濃度為8.34±0.38mg/ml,ACE為6.68±1.64mg/ml。EAU組與ACE組組間各個(gè)時(shí)間段房水蛋白量均高于空白對(duì)照組(P<0.01),不同時(shí)間段房水蛋白濃度EAU組均高于ACE組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。EAU組及ACE組在觀察的4個(gè)階段中(F=47.12～81.62),兩組房水蛋白量均顯著高于對(duì)照組(P=0.00),組內(nèi)觀察兩組分別在第13d、18d與9d比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01～0.05),第23d與9d比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖2

3 討論

通過對(duì)EAU大鼠眼部炎癥觀察發(fā)現(xiàn),免疫后13d為炎癥高峰期,該階段可以從眼前段表現(xiàn)及房水蛋白來相互驗(yàn)證。眼前段表現(xiàn)為前房積膿、重度纖維蛋白滲出、虹膜血管充血嚴(yán)重甚至瞳孔膜閉等癥狀;房水蛋白也顯示免疫后13d,前房穿刺取房水較其它階段均困難,分析原因,考慮該階段房水處于相對(duì)凝固狀態(tài)、量少[13],EAU組、ACE組房水蛋白濃度不僅高于正常組,而且明顯高于其它觀察階段。

從治療療效分析,通過穴位埋線治療后13d穴位埋線組大鼠眼部炎癥比EAU組減輕,測量大鼠房水蛋白濃度進(jìn)一步可以證實(shí)。免疫后13d、18d及23dACE組均明顯低于EAU組,說明穴位埋線法在減輕大鼠EAU眼部癥狀[14]、減少房水蛋白生成,加速減輕眼部炎癥反應(yīng)方面有一定的治療作用。

穴位埋線療法是經(jīng)絡(luò)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物,使用可降解生物線體這種異物組織對(duì)穴位產(chǎn)生持久而柔和的生理、物理和生物化學(xué)的刺激,從而達(dá)到協(xié)調(diào)臟腑,平衡陰陽,疏通經(jīng)絡(luò),調(diào)和氣血,補(bǔ)虛瀉實(shí),扶正祛邪及免疫調(diào)節(jié)雙向作用。郝小波提出穴位埋線可適宜用與慢性、頑固性眼病的治療[15]。雖然穴位埋線可以在EAU動(dòng)物模型中減輕眼部炎癥方面有一定的治療作用,但是查閱相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,運(yùn)用某些中藥[13]可以在造模后20d將造模鼠房水蛋白降低至正常,相比之下穴位埋線暫未發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)效的抗炎效果。考慮到免疫調(diào)節(jié)紊亂是導(dǎo)致該病發(fā)生的直接原因,穴位埋線應(yīng)該是通過多種途徑改善機(jī)體自身免疫反應(yīng),為此我們應(yīng)該探尋更多的在調(diào)節(jié)自身免疫方面有效的綠色療法,以便臨床上可以在多種有效的療法上相應(yīng)的自由選擇組合,力求更大效益的為病人服務(wù),進(jìn)而為自身免疫性葡萄膜炎的治療提供了新的思路,但其發(fā)揮作用的具體相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

感謝:山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科研究所老師給予實(shí)驗(yàn)的幫助和指導(dǎo)。

表1

組間不同時(shí)間段資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),與EAU組比較#P<0.01;組內(nèi)資料比較采用單因素方差分析ANOVA,各組間的兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),與9d比較,@P<0.01,*P<0.05

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Effectofacupointcatgutembeddingonocularinflammationinexperimentalautoimmuneuveitisrats

ZHAOJian-ying1,HAOXiao-bo1,ZHENGFeng-ming2,HUANGSu-zhen3,WUHan-qing4，GUODa-dong5

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning,Guangxi,530023;2.ChineseMedicineHospitalShangyuShaoxing,Shaoxing,Zhejiang,312300;3.DongguanHumenZhongYiyuan,Dongguan,Guangdong,523902;4.GuangxiInternationalZhuangHospital,Nanning,Guangxi,530001;5.EyeInstituteofShandongUniversityofTCM,Jinan,Shandong,250002)

ObjectiveTo explore the effect of acupoint catgut embedding therapy on ocular inflammation in EAU rats.MethodsLewis rats were randomly divided into control group(n=3),EAU group(n=24)and acupoint catgut embedding(ACE)group(n=24).(IRBP)was used to form EAU group.The ACE group was treated with acupoint catgutation after the success of the model.The changes of the anterior segmental inflammation were observed and 9 days after the immunization.13d,18d and 23d at different times of eye aqueous protein.ResultsT The peak of inflammation and the amount of aqueous protein in the model group were 41.15 ± 3.91mg / ml,and the aqueous protein concentration in the ACE group was 21.85 ± 1.70mg / m;not only that,in the observation of the four time periods,ACE group of aqueous protein levels were lower than EAU group(P<0.01).ConclusionAcupoint catgut embedding therapy can reduce the anterior segment of the EAU rat inflammatory response,but also can reduce the anterior segment of the inflammation caused by the rapid increase in the amount of aqueous humor protein,so the regulation of immune status is a positive and effective green therapy.

Acupoint catgut embedding; Autoimmune uveitis; Experiment; Rat; Aqueous protein

1. 廣西衛(wèi)生自籌計(jì)劃課題(Z20170279)2. 2017廣西中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)面上項(xiàng)目(2017MS029) 3. 國家自然科學(xué)基金(81360558)；4. 廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2010GXNSFA013208)；5. 廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(0342042)；6. 廣西科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(12300020)7. 廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(KY2015YB157)8.山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2013ZDZK-083)

1.530023,廣西南寧,廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；2.312300,浙江紹興,紹興市上虞中醫(yī)醫(yī)院；3.523902,廣東東莞,東莞市虎門中醫(yī)院；4.530001,廣西南寧,廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院；5.,250002,山東濟(jì)南,山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科研究所

郝小波，E-mail：562695922@qq.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.04.003

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