不同致病力松材線蟲的繁殖能力和移動(dòng)能力比較1)

朱麗華 林麗 蔣鵬 王立超 徐武 葉建仁

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037) (南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心(南京林業(yè)大學(xué)))

不同致病力松材線蟲的繁殖能力和移動(dòng)能力比較1)

朱麗華 林麗 蔣鵬 王立超 徐武 葉建仁

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037) (南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心(南京林業(yè)大學(xué)))

通過黑松和馬尾松接種明確不同松材線蟲蟲株的致病力，進(jìn)而對(duì)不同致病力蟲株的繁殖力、移動(dòng)能力等生物學(xué)特性進(jìn)行了比較。研究結(jié)果表明，蟲株AMA3C28和USA的致病力顯著強(qiáng)于C14-5和OKD-1，AMA3C28和USA接種35 d后，黑松枯萎率均達(dá)100%，而馬尾松枯萎率分別為75%和20%；C14-5和OKD-1對(duì)黑松和馬尾松無致病作用或有極弱的致病作用。接種35 d后，AMA3C28和USA在黑松苗內(nèi)的增殖能力顯著強(qiáng)于C14-5和OKD-1。在灰葡萄孢培養(yǎng)條件下，AMA3C28和USA的繁殖力、雌雄性別比例顯著高于OKD-1；強(qiáng)致病力蟲株AMA3C28和USA雌成蟲尾部均為指狀鈍圓，而弱致病力蟲株OKD-1和C14-5雌成蟲中分別28%和2%尾部具有尾尖突。AMA3C28和USA在黑松莖段內(nèi)遷移能力顯著強(qiáng)于C14-5和OKD-1。因此，松材線蟲在樹體內(nèi)的繁殖力及移動(dòng)能力可能與其致病力有關(guān)。

松材線蟲；松樹；致病力；繁殖力；移動(dòng)能力

松材線蟲病是松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)引起的一種毀滅性森林病害[1]。1905年，松材線蟲病首次于日本發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)80年代，該病害傳入中國(guó)和韓國(guó)，隨后傳入葡萄牙和西班牙，逐漸成為最具危險(xiǎn)性的全球性病害之一[2]。松材線蟲病自1982年傳入我國(guó)后不斷擴(kuò)散蔓延，現(xiàn)已擴(kuò)散至江蘇、安徽、浙江、云南、陜西、遼寧等17個(gè)省市[國(guó)家林業(yè)公告(2017年第4號(hào))]，導(dǎo)致了嚴(yán)重的生態(tài)破壞和巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。松材線蟲病涉及松材線蟲、傳播媒介、寄主松樹等多個(gè)因素相互作用，迄今，其致病機(jī)理尚未十分明晰。病原物的致病力是影響病害流行的關(guān)鍵因子之一。在過去幾十年中，許多松材線蟲蟲株被收集，不同松材線蟲蟲株間致病力分化明顯[4-5]，有些蟲株致病力甚至喪失，被歸為“無毒”蟲株。松材線蟲蟲株間的致病力差異可能與寄主、地理來源或環(huán)境因素有關(guān)[4-5]，也可能與其伴生細(xì)菌種類有關(guān)[6]，或與其分泌的纖維素酶活力[7]，或與其繁殖力有關(guān)[8-9]，但也有研究認(rèn)為，松材線蟲的致病力與其繁殖力無關(guān)[10]，甚至呈負(fù)相關(guān)[11]。本研究首先對(duì)不同松材線蟲蟲株的致病力進(jìn)行測(cè)定，在明確不同蟲株致病力的基礎(chǔ)上，對(duì)不同致病力蟲株的生物學(xué)特性，包括雌成蟲形態(tài)特征、性別比例、繁殖力、移動(dòng)能力等進(jìn)行了比較，旨在更全面地認(rèn)識(shí)松材線蟲致病力分化的原因，為進(jìn)一步闡明松材線蟲致病機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲株和松苗

來自松材線蟲原產(chǎn)地以及兩個(gè)松材線蟲病嚴(yán)重發(fā)生國(guó)的4株松材線蟲蟲株被用于比較研究，其中，AMA3C28為來自中國(guó)強(qiáng)致病力蟲株AMA3的近交系后代(近交20代)，OKD-1和C14-5為由日本引進(jìn)的弱致病力蟲株，USA蟲株分離自松材線蟲原產(chǎn)地美國(guó)的木質(zhì)包裝箱，其致病力未知。所有蟲株來源詳見表1。所有蟲株使用前培養(yǎng)于灰葡萄孢(Botrytiscinerea)上，于冰箱4 ℃保存。

表1 供試松材線蟲及擬松材線蟲蟲株來源

致病力測(cè)定用松苗為3年生盆栽黑松(Pinusthunbergii)和馬尾松(P.massoniana)，使用前培養(yǎng)于南京林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)系溫室。

1.2 松材線蟲的培養(yǎng)

將實(shí)驗(yàn)室保存的上述蟲株在超凈臺(tái)下接入灰葡萄孢培養(yǎng)基上，封口后放入恒溫箱中25 ℃培養(yǎng)。5～7 d后，待灰葡萄孢快要吃盡時(shí)，用貝爾曼漏斗法分離線蟲。

1.3 松材線蟲致病力測(cè)定

取上述4株松材線蟲，采用皮接法對(duì)3年生黑松和3年生馬尾松盆栽苗進(jìn)行接種，每蟲株接種松苗6～26株，接種線蟲數(shù)量為4 500條/株，以無菌水接種為對(duì)照。接種后的幼苗放置于28 ℃，光照18 h的溫室中培養(yǎng)，隔日澆水。觀察松苗的發(fā)病情況，記錄萎蔫癥狀出現(xiàn)的最早時(shí)間(針葉出現(xiàn)失水褪綠癥狀開始記錄)和各蟲株致萎蔫松苗數(shù)量，計(jì)算枯萎率((萎蔫數(shù)量/接種數(shù)量)×100%)。接種35 d后，采用貝爾曼漏斗法對(duì)黑松體內(nèi)線蟲進(jìn)行再分離，24 h后，收集橡膠管底部液體，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)線蟲數(shù)量。

1.4 松材線蟲在灰葡萄孢上的繁殖力及性別比例測(cè)定

在超凈臺(tái)中，將上述蟲株接入長(zhǎng)滿灰葡萄孢的PDA培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。1周后，采用貝爾曼漏斗分離法分離線蟲。24 h后，將松材線蟲收集于無菌離心管中，3 500 r/min，離心3 min，棄上清液，無菌重懸，顯微鏡下計(jì)數(shù)線蟲的數(shù)量，調(diào)節(jié)濃度至5 000條/mL。用移液槍取20 μL線蟲懸浮液(約100條線蟲)接種于新鮮灰葡萄孢上，25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每蟲株4皿，重復(fù)3次。1周后分離灰葡萄孢上的松材線蟲，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)線蟲數(shù)量和性別比例，并觀察雌成蟲尾部形態(tài)。

1.5 松材線蟲的移動(dòng)能力測(cè)定

取3年生黑松當(dāng)年生枝條，切成5 cm長(zhǎng)莖段，用挑針在每個(gè)莖段頂部挖一小孔，每個(gè)孔的深度保持一致，立即用于試驗(yàn)。將松枝下端插到盛有4 mL無菌水的15 mL錐形離心管中(離心管上部事先已剪去，保留約4 cm高度)，將20 μL混合齡的松材線蟲(約2 000條)懸浮液接種于莖段頂部小孔中。將接種過的莖段置于帶蓋的大塑料盒中，于培養(yǎng)箱中25 ℃保濕培養(yǎng)。分別于接種2、4、6、8、10、24、48、72 h后從離心管底部取水樣，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)線蟲數(shù)量。每蟲株接種3根莖段，重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPadPrism分析軟件對(duì)各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同松材線蟲蟲株對(duì)黑松和馬尾松的致病力

將松材線蟲蟲株AMA3C28、USA、C14-5和OKD-1接種于3年生盆栽黑松苗，結(jié)果表明，不同松材線蟲蟲株對(duì)黑松的致病力不同。松材線蟲AMA3C28和USA接種的黑松苗于接種后第12天首先觀察到萎蔫癥狀，并且發(fā)病松苗數(shù)量逐日增加，35 d后發(fā)病率達(dá)100%；蟲株OKD-1和C14-5接種35 d后針葉與對(duì)照一樣依然保持健康嫩綠，無任何植株出現(xiàn)萎蔫癥狀，發(fā)病率為0(表2)。

表2 黑松苗和馬尾松苗接種不同松材線蟲蟲株后的結(jié)果

蟲株編號(hào)馬尾松接種數(shù)量/株最早出現(xiàn)萎蔫癥狀時(shí)間/d42d后枯萎率/%AMA3C28161575．0USA103520．0C14-526383．8OKD-124—0CK(無菌水)10—0

注：“—”表示沒有觀察到。

4個(gè)蟲株接種3年生盆栽馬尾松的試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同松材線蟲蟲株對(duì)馬尾松的致病力差異較大。AMA3C28和USA接種的馬尾松苗分別于接種后第15天和第35天首先觀察到萎蔫癥狀，42 d后發(fā)病率分別為75%和20%；C14-5接種的26株松苗中，有1株發(fā)病，發(fā)病率為3.8%，而OKD-1接種的松苗均無任何植株表現(xiàn)萎蔫癥狀(表2)。

2.2 不同松材線蟲蟲株在黑松體內(nèi)的繁殖力

接種35 d后，對(duì)黑松體內(nèi)線蟲進(jìn)行再分離。結(jié)果顯示，蟲株AMA3C28和USA均在黑松體內(nèi)大量繁殖，線蟲數(shù)量平均分別達(dá)16 024條和41 173條；而OKD-1和C14-5未能在黑松體內(nèi)建立種群，僅分離到極其少量的線蟲(表3)。

表3接種35 d后不同松材線蟲蟲株在黑松苗體內(nèi)的繁殖數(shù)量

蟲株編號(hào)分離數(shù)量/株再分離線蟲數(shù)量/條AMA3C28316024±5780USA341173±20480C14-5311±17OKD-130±1CK——

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；—表示沒有分離。

2.3 不同致病力松材線蟲蟲株在黑松莖段內(nèi)的移動(dòng)能力

將不同致病力松材線蟲接種黑松莖段，結(jié)果表明，不同致病力蟲株在黑松莖段內(nèi)的移動(dòng)能力不同。強(qiáng)致病力蟲株AMA3C28和USA在接種后2 h分別有5和2條線蟲通過黑松莖段，72 h后累計(jì)通過黑松莖段的線蟲數(shù)量分別為203和98條；而弱致病力蟲株C14-5和OKD-1在接種6 h后分別有1和3條線蟲穿過黑松莖段，72 h后累計(jì)通過莖段的線蟲分別為29和20條。因此，可以看出強(qiáng)致病力線蟲AMA3C28和USA在黑松體內(nèi)移動(dòng)的能力明顯強(qiáng)于弱致病力蟲株C14-5和OKD-1。

2.4 不同致病力松材線蟲蟲株雌成蟲尾部形態(tài)

通過對(duì)不同致病力松材線蟲蟲株雌成蟲尾部的觀察，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)致病力蟲株AMA3C28和USA雌成蟲尾部均為指狀鈍圓。弱致病力蟲株OKD-1和C14-5大部分雌成蟲尾部形態(tài)為指狀鈍圓形，小部分雌成蟲尾部具有2～3 μm的尾尖突。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，OKD-1中具尾尖突的雌成蟲數(shù)量占28.8%，C14-5中具尾尖突的雌成蟲數(shù)量占2.16%。

2.5 不同致病力松材線蟲蟲株在灰葡萄孢上的繁殖力和性別比例

取AMA3C28、USA、OKD-1和C14-5混齡線蟲接種在灰葡萄孢上，100條每皿，1周后分離線蟲，顯微鏡觀察并統(tǒng)計(jì)線蟲數(shù)量。結(jié)果表明，強(qiáng)致病力蟲株AMA3C28和USA在灰葡萄孢上的繁殖力大于弱致病力蟲株OKD-1，差異顯著(P<0.05)；AMA3C28和USA的繁殖力高于C14-5，但差異不顯著；兩株弱致病力蟲株OKD-1和C14-5繁殖量差異不顯著。繁殖1周后，蟲株AMA3C28平均線蟲量為(20 781±4 541)條，USA為(21 450±4 687)，C14-5為(12 428+1 883)條，OKD-1為(5 411±1 182)條。

對(duì)上述于灰葡萄孢上繁殖1周后的松材線蟲蟲株的雌雄成蟲比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，2株強(qiáng)致病力蟲株AMA3C28和USA的雌雄比例顯著大于2株弱致病力蟲株OKD-1和C14-5，差異顯著(P<0.05)。2株強(qiáng)致病力蟲株雌雄成蟲比例大于1，其中，AMA3C28和USA雌雄比例分別為(1.29±0.25)和(1.27±0.24)；2株弱致病力蟲株雌雄比例小于1，其中C14-5為(0.86±0.10)，OKD-1為(0.84±0.16)；而2株強(qiáng)致病力蟲株之間雌雄比例差異不顯著，2株弱致病力蟲株之間差異亦不顯著(表4)。

表4不同致病力松材線蟲蟲株在灰葡萄孢上的繁殖力和性別比例

蟲株編號(hào)繁殖力/條性別比例AMA3C28(20781±4541)a(1．29±0．25)aUSA(21450±4687)a(1．27±0．24)aC14-5(12428±1883)ab(0．86±0．10)bOKD-1(5411±1182)b(0．84±0．16)b

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同一列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

本研究比較了4株松材線蟲的致病力，并探討了不同致病力松材線蟲蟲株之間生物學(xué)特性的差異。通過對(duì)不對(duì)寄主松樹的接種試驗(yàn)表明，試驗(yàn)選取的4株松材線蟲致病力分化明顯。其中，AMA3C28和USA對(duì)黑松的致萎蔫率均達(dá)100%，而OKD-1和C14-5均未能導(dǎo)致黑松萎蔫。對(duì)馬尾松的接種試驗(yàn)顯示，AMA3C28的致病力強(qiáng)于USA，C14-5致病力稍強(qiáng)于OKD-1。通過對(duì)兩種寄主的致病力測(cè)定，4株松材線蟲致病力從強(qiáng)到弱分別為AMA3C28、USA、C14-5、OKD-1。該試驗(yàn)結(jié)果與Aikawa等[8]以及Mota等[12]的結(jié)果相似。Aikawa等的接種結(jié)果顯示，C14-5和OKD-1的致病力顯著低于其他測(cè)試蟲株，其中C14-5對(duì)黑松的致病力為5%，而OKD-1未能使黑松發(fā)病。Mota等[12]亦報(bào)道，C14-5對(duì)黑松的致病力明顯弱于葡萄牙蟲株。

關(guān)于松材線蟲繁殖力和移動(dòng)能力與其致病力的關(guān)系，目前尚未十分明晰。有研究認(rèn)為松材線蟲的繁殖力是影響松樹萎蔫病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子，松材線蟲通常在侵染后10 d內(nèi)在松樹體內(nèi)大量繁殖，最終導(dǎo)致松樹死亡[13]，因此，較強(qiáng)的繁殖能力對(duì)其致病力有很大貢獻(xiàn)。Kiyohara和Bolla[4]的研究顯示，強(qiáng)致病力蟲株在灰葡萄孢上培養(yǎng)6 d后，其繁殖量是弱致病力蟲株的4倍。Wang et al.[14]發(fā)現(xiàn)強(qiáng)致病力蟲株的代時(shí)短于弱致病力蟲株，強(qiáng)致病力蟲株的種群增長(zhǎng)速率快于弱致病力蟲株。朱麗華等[15]通過不同致病力蟲株雜交后代的致病力測(cè)定亦發(fā)現(xiàn)，松材線蟲致病力與其在松樹體內(nèi)的繁殖力存在正相關(guān)性。Mota et al.[12]的研究亦表明，弱致病力蟲株在樹體內(nèi)的繁殖力顯著低于強(qiáng)致病力蟲株(平均僅6條/g干質(zhì)量)。Aikawa和Kikuchi[8]認(rèn)為，松材線蟲的致病力可以通過其在灰葡萄孢上或松樹枝段中的繁殖力進(jìn)行初步判斷，松樹枝段可能比灰葡萄孢更適合于作為致病力評(píng)價(jià)的材料，因?yàn)榫€蟲取食活的松樹組織細(xì)胞并在松樹組織中建立種群的能力是確定其毒力水平的重要因素。但也有研究認(rèn)為，松材線蟲的致病力與其繁殖力無關(guān)[10]，而Eo et al.[11]發(fā)現(xiàn)，松材線蟲的繁殖力與其致病力呈負(fù)相關(guān)。本研究中，強(qiáng)致病力蟲株在黑松苗內(nèi)增殖的線蟲平均數(shù)量顯著高于弱致病力蟲株。在灰葡萄孢上，強(qiáng)致病力蟲株產(chǎn)生的后代數(shù)量也比弱致病力蟲株更多，雌雄比例顯著大于弱致病力蟲株雌雄性別比例。

本研究中，與弱致病力蟲株相比，強(qiáng)致病力蟲株以更快的速度和更大的種群數(shù)量通過松樹莖段。Odani et al.[16]的研究表明，松材線蟲和擬松材線蟲的遷移擴(kuò)散能力與線蟲毒力強(qiáng)弱之間有正相關(guān)性，Ichihara et al.[13]亦報(bào)道，強(qiáng)致病力蟲株較弱致病力蟲株在木質(zhì)部樹脂道和皮層組織中的擴(kuò)散速度更快。但是，Togashi et al.[17]和Eo et al.[11]的研究結(jié)果與此相反，認(rèn)為線蟲的致病力與其遷移能力無相關(guān)性。馬海賓等[18]認(rèn)為，評(píng)價(jià)松材線蟲遷移運(yùn)動(dòng)能力與松材線蟲致病力的關(guān)系，應(yīng)該綜合考慮松材線蟲分泌的致病性相關(guān)酶、群體遷移數(shù)量、繁殖力以及種源地等一系列因素。松材線蟲在樹體內(nèi)移動(dòng)的能力與其致病力可能存在一定關(guān)系。

已有研究表明，松材線蟲可分為圓尾型(R型)和尖尾型(M型)。R型松材線蟲雌成蟲一般尾部末端鈍圓，無尾尖突，并且該類群中大部分個(gè)體無尾尖突。M型松材線蟲的雌成蟲均具有明顯的尾尖突，且該尾尖突經(jīng)灰葡萄孢人工培養(yǎng)也不消失。有關(guān)松材線蟲形態(tài)分化與致病性分化之間相互關(guān)系方面的研究未見報(bào)道。本研究觀察結(jié)果顯示，在灰葡萄孢培養(yǎng)條件下下，2株強(qiáng)致病力蟲株雌成蟲的尾部均為指狀鈍圓，而2株弱致病力蟲株中，小部分雌成蟲尾部具有尾尖突。

綜上所述，松材線蟲不同蟲株致病力不同，不同致病力蟲株在繁殖力、移動(dòng)能力等方面差異較大，引起上述差異的本質(zhì)原因有待進(jìn)一步深入研究。

致謝：感謝日本京都大學(xué)Yuko Takeuchi副教授友情贈(zèng)送弱致病力松材線蟲蟲株。

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ComparisononFecundityandMigrationAbilityofBursaphelenchusxylophiluswithDifferentVirulence

Zhu Lihua, Lin Li, Jiang Peng, Wang Lichao

(Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, P. R. China); Xu Wu, Ye Jianren(Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University)Journal of Northeast Forestry University，2017,45(12)：76-79.

Bursaphelenchusxylophilus；Pinusthunbergii； Virulence； Proliferation； Migration

1)江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(15KJA220003)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)。

朱麗華，女，1970年10月生，南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，副教授。E-mail:lhzhu@njfu.edu.cn。

葉建仁，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心(南京林業(yè)大學(xué))，教授。E-mail:jrye@njfu.edu.cn。

2017年7月20日。

潘 華。

S763

The virulence of different strains ofBursaphelenchusxylophiluswas determined by challenging withPinusthunbergiiandP.massoniana. The strains with different virulence were screened and their biological characteristics were compared. Strains AMA3C28 and USA were more virulent than C14-5 and OKD-1. The wilting ratio onP.thunbergiiwas 100% for 35 d after inoculation with AMA3C28 and USA, while onP.massonianawere 75% and 20%, respectively. C14-5 and OKD-1 had no or very weak pathogenicity on bothP.thunbergiiandP.massoniana. AMA3C28 and USA proliferated rapidly inP.thunbergiiseedlings 35 d after inoculation, which was significantly higher than that of C14-5 and OKD-1. The fecundity of AMA3C28 and USA was significantly higher than that of OKD-1 and C14-5 when feeding onB.cinerea. The sex ratio of male and female in AMA3C28 and USA was significantly higher than that in C14-5 and OKD-1. Difference was also observed in tail morphology of adult female between virulent and avirulent strains when feeding on Botrytis cinerea. For strong virulent strains (AMA3C28 and USA), 100% adult females had no terminal mucro. However, about 28% of adult females of OKD-1 had terminal mucro and 2% of adult females of C14-5 had terminal mucro. The migration ability of AMA3C28 and USA in the stem segment ofP.thunbergiiwas higher than that of C14-5 and OKD-1.