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    沙利度胺抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV-3體外生長的研究

    2017-12-27 08:46:40,,,,
    關(guān)鍵詞:沙利度胺抑制率卵巢癌

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    (1.皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科,安徽 蕪湖 241000;2.皖南醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室,安徽 蕪湖 241002)

    ·臨床醫(yī)學(xué)·

    沙利度胺抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV-3體外生長的研究

    張玲1,高紅亮2,吳超2,程倩2,虞樂2,李曙2

    (1.皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科,安徽 蕪湖 241000;2.皖南醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室,安徽 蕪湖 241002)

    目的:探討沙利度胺對卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3的增殖抑制以及凋亡的影響,為后續(xù)臨床治療及基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。方法采用MTT法測定不同濃度沙利度胺作用于SKOV-3細(xì)胞株24 h后的吸光度,測定其對SKOV-3的增殖抑制率,Tunel染色法鑒定細(xì)胞凋亡,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,Q-PCR法檢測caspase3 mRNA表達(dá)水平,Western Blot法檢測caspase3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果沙利度胺的濃度從31 μg/mL增加至500 μg/mL時,對于SKOV-3的增殖抑制率從6.22%上升至86%;300 μg/mL沙利度胺處理SKOV-3 24 h后,流式細(xì)胞術(shù)檢測其凋亡率上升為52.66%,明顯高于空白對照(P<0.01)。Tunel法在熒光顯微鏡下觀察,沙利度胺組可見大片綠色熒光。同時,沙利度胺處理后的SKOV-3的caspase3 mRNA及蛋白表達(dá)量與空白對照組相比也明顯上升(P<0.01)。結(jié)論沙利度胺能夠抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的增殖并且能夠誘導(dǎo)其凋亡。

    沙利度胺;卵巢癌細(xì)胞;凋亡

    卵巢癌作為一種惡性的生殖腫瘤,已經(jīng)成為發(fā)達(dá)國家婦女腫瘤致死率第五的疾病。在過去的40年,對于卵巢癌的治愈率并沒有顯著的改善[1]。目前的治療手段主要以手術(shù)及化療為主[2-3]。沙利度胺是一種消旋體谷氨酸衍生物,具有鎮(zhèn)靜、止吐作用,起初用于治療妊娠嘔吐,因嚴(yán)重致畸事件在1961年被禁用[4-5]。目前,歐洲藥品管理局(European Medicines Agency,EMA)批準(zhǔn)其適應(yīng)證僅限于治療多發(fā)性骨髓瘤,中國SFDA所批準(zhǔn)的適應(yīng)證僅限于控制瘤型麻風(fēng)反應(yīng)癥。但臨床實踐中沙利度胺的應(yīng)用范圍已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了FDA、EMA、SFDA所批準(zhǔn)的適應(yīng)證,在如腎癌、惡性黑素瘤、膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、結(jié)直腸癌、肝癌、前列腺癌等實體瘤中的治療中有一定效果[6-7]。同時,近年的研究發(fā)現(xiàn),沙利度胺具有調(diào)節(jié)免疫及抗血管生成等作用[8]。這使得沙利度胺再次成為研究的熱點。本研究希望通過分子生物學(xué)手段來觀察沙利度胺對于卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3增殖凋亡的影響。

    1 材料和方法

    1.1 材料 人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3購于中科院上海細(xì)胞庫。沙利度胺購于常州制藥廠,為純品原料藥,溶于二甲基亞砜(DMSO)后得終濃度為50mg/mL的溶液。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒,TUNEL凋亡檢測試劑盒購于碧云天生物有限公司。凋亡試劑盒購于美國Sigma公司。caspase3一抗購于CST公司,二抗購于碧云天生物有限公司。caspase3引物購于上海生工生物工程有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SKOV-3細(xì)胞株于含有10%小牛血清的RPMI-1640的培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng),同時加入雙抗(1%青霉素和鏈霉素),置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.2.2 增殖抑制率檢測 采用MTT 法檢測不同濃度沙利度胺處理SKOV-3 24 h后的增殖抑制率。將處于對數(shù)生長期的SKOV-3細(xì)胞消化,種于96孔板中,保持細(xì)胞濃度5×103/孔,培養(yǎng)24 h后,換液,加入沙利度胺終濃度分別為500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62 μg/mL、31 μg/mL的無血清培養(yǎng)基,每個濃度設(shè)3個副孔,培養(yǎng)24 h,加入MTT( 5g /L) 各20 μL,4 h 后,吸出培養(yǎng)液,再在每孔加入DMSO150 μL,避光輕微振蕩5min使結(jié)晶充分溶解,在酶標(biāo)儀570 nm 波長下測吸光度(C)值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對照組C值-實驗組C值)/對照組C值×100%。并計算出沙利度胺的IC50。

    1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率 運用Annexin V- FITC /PI 雙染檢測沙利度胺作用于SKOV-3 24 h的凋亡率,沙利度胺作用SKOV-3,24 h后,PBS洗兩遍,收集上清液離心,然后用0.25%不含EDTA的胰酶消化,制備單細(xì)胞懸液濃度1×106個細(xì)胞 /mL,離心2000 r/min,5min,PBS洗滌兩次,收集細(xì)胞,用200 μL緩沖液重懸,分別加入5 μL FITC和10 μL PI,4℃避光孵育15min。用PBS將懸液補充至700 μL,上機檢測。

    1.2.4 Tunel檢測細(xì)胞凋亡 采用一步法Tunel細(xì)胞凋亡試劑盒檢測細(xì)胞凋亡,取用處于生長對數(shù)期的SKOV-3細(xì)胞,消化,種于6孔板中,貼壁培養(yǎng)24 h后,加入沙利度胺作用24 h后,按照試劑盒使用說明完成檢測。

    1.2.5 Q-pcr檢測caspase3表達(dá)水平 用300 μg/mL沙利度胺作用處理SKOV-3 24 h,后用Trizol提取藥物組與正常對照組細(xì)胞RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,條件為:25℃ 10 min, 50℃ 30 min, 85℃5 min。以cDNA作為模板完成實時熒光定量PCR?;虻囊锊捎肞rimer5.0軟件設(shè)計。caspase3的上游引物:5′-GCAAACCTCAGGGAAACATT-3′;下游引物:5′-ACCTGGACAACTGGACTTTT-3′。β-actin:的上游引物:5′-GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC-3′;下游引物:5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3′。

    1.2.6 Western blot檢測caspase3蛋白表達(dá)水平 沙利度胺處理SKOV-3 24 h后,用含有蛋白酶抑制劑的RIPA 1640強裂解液來提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度,并將蛋白于-80℃冰箱保存。運用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離所提蛋白,并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%BSA封閉2 h后,孵以一抗,4℃搖床過夜。次日,TBST清洗3次,每次5 min。二抗孵育2 h。用冷CCD成像系統(tǒng)觀察蛋白表達(dá)。結(jié)果運用Image J軟件分析。

    2 結(jié)果

    2.1 沙利度胺處理后增殖抑制率的比較 通過計算得出沙利度胺的IC50約為300 μg/mL 。MTT實驗結(jié)果顯示:通過與空白組比較,沙利度胺處理后的SKOV-3的增殖能力減弱,并呈濃度依賴關(guān)系,其中200 μg/mL與500 μg/mL沙利度胺處理組與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。說明沙利度胺能夠有效抑制SKOV-3的增殖,見表1。

    表1 沙利度胺不同濃度組細(xì)胞增殖抑制率的比較

    組別OD值(x±s)抑制率/%沙利度胺組 500μg/mL0.1880±0.05544*86 250μg/mL0.7882±0.11743*42.5 125μg/mL1.1616±0.14238*15.2 62μg/mL1.2696±0.118747.42 31μg/mL1.2860±1.178316.22空白對照組1.3714±0.081330.00F68.406P<0.001

    *為與空白對照組比較,P<0.05。

    2.2 沙利度胺處理后對SKOV-3細(xì)胞凋亡的影響 采用一步法Tunel凋亡染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測沙利度胺處理后的SKOV-3的凋亡率。在熒光顯微鏡下觀察,沙利度胺處理組在鏡下可見大量綠色熒光,說明凋亡率增加(圖1A)。結(jié)果顯現(xiàn)沙利度胺處理24 h后的凋亡率可達(dá)到52.66%,高于空白對照組(圖1B),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

    A.空白對照與沙利度胺處理組Tunel法凋亡檢測的比較;B、C.流式細(xì)胞術(shù)檢測空白對照與沙利度胺處理組的凋亡率。*P<0.01vscontrol。

    圖1 沙利度胺處理后對SKOV-3細(xì)胞凋亡的影響

    2.3 沙利度胺處理后caspase3表達(dá)水平的比較 采用Q-PCR法分析沙利度胺處理組與空白對照組之間caspase3 mRNA的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)沙利度胺處理組的SKOV-3細(xì)胞的caspase3的表達(dá)水平要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞(圖2A)。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。沙利度胺處理組與空白對照組的caspase3表達(dá)量,通過Western Blot結(jié)果顯示,沙利度胺處理組的caspase3的表達(dá)量明顯高于空白對照組(圖2B、C)。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。說明沙利度胺能夠促進(jìn)SKOV-3的凋亡。

    A.沙利度胺處理組與空白對照組caspase3 mRNA表達(dá)水平的比較;B、C.沙利度胺處理組與空白對照組caspase3蛋白表達(dá)水平的比較。

    *P<0.01vscontrol。

    圖2 沙利度胺處理后caspase3表達(dá)水平的比較

    3 討論

    卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率位居所有生殖器官惡性腫瘤的第三位。早期卵巢癌無明顯典型癥狀,發(fā)現(xiàn)時,基本已屬晚期,對婦女的生命健康造成了巨大的威脅[9-10]。沙利度胺最初作為鎮(zhèn)靜劑治療妊娠嘔吐,因有致畸作用(嬰兒海豹肢)而被禁用。腫瘤患者多有免疫機能的異常, 正常情況下腫瘤與宿主的免疫防御之間處于動態(tài)平衡。這種平衡遭到破壞,可使腫瘤處于優(yōu)勢地位而得以發(fā)生增殖、擴散和轉(zhuǎn)移。研究顯示,沙利度胺對淋巴細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用,能誘導(dǎo)細(xì)胞毒T 細(xì)胞的增殖,降低CD4+和CD8+細(xì)胞的比例,從而增加IFN-γ和IL-2 的分泌,IFN-γ和IL-2 本身具有直接抗腫瘤的作用。此外,通過增強NK 細(xì)胞活性還可以達(dá)到間接抗腫瘤的效果。另一方面,臨床前和臨床的證據(jù)顯示,沙利度胺能夠誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞分泌IL-2 和IFN-γ,它們又會反饋刺激T 細(xì)胞增殖,進(jìn)而增強機體的抗腫瘤免疫作用[11-13]。故我們希望通過了解沙利度胺在處理卵巢癌細(xì)胞SKOV-3后對其的增殖與凋亡的影響,從而為沙利度胺更好地用于臨床抗腫瘤應(yīng)用以及基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn),沙利度胺處理SKOV-3 24 h后,細(xì)胞的增殖抑制率隨沙利度胺濃度的上升而上升,在沙利度胺的濃度達(dá)到250 μg/mL時,增殖抑制率即可達(dá)到42%,說明沙利度胺對SKOV-3細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用。另外通過流式檢測,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過沙利度胺處理后的SKOV-3的凋亡率與空白對照組比較明顯上升。表明沙利度胺能夠有效地誘導(dǎo)SKOV-3的凋亡。經(jīng)典的凋亡途徑分為兩條,分別為胞外途徑以及胞內(nèi)途徑,死亡受體與配體的結(jié)合最終導(dǎo)致死亡信號的傳遞,死亡受體的死亡結(jié)構(gòu)域(death domain,DD)與信號傳導(dǎo)分子結(jié)合,形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物,最終導(dǎo)致了caspase3及下游的caspase的活化。同時有大量研究表明,在多種細(xì)胞及各種因素的刺激下,caspase3是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者。故我們通過Western Blot及Q-PCR檢測caspase3在沙利度胺處理組中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過沙利度胺處理后的SKOV-3,caspase3的表達(dá)量明顯升高,說明通過沙利度胺的處理,能有效地激活caspase3,引起SKOV-3的凋亡。但是其中具體的分子機制尚不清楚,有待于后續(xù)研究證實。通過本實驗,希望能夠為以后沙利度胺更好地應(yīng)用于臨床提供研究基礎(chǔ)。

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    InvitroinhibitingtheproliferationofhumanovarycancercelllineSKOV-3usingthalidomide

    ZHANGLing,GAOHongliang,WUChao,CHENGQian,YULe,LIShu

    Department of Gynecology & Obstetrics, The Second Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241000, China

    Objective:To investigate the effects of thalidomide on inhibiting proliferation and promoting apoptosis of human ovarian cancer cell line SKOV-3 for evidence in clinical use and fundamental research of this drug.Methods: MTT assay was performed to detect the absorbance value of different concentration of thalidomide acting on SKOV-3 24 h after administration for measurement of the inhibition rate. TTUNEL apoptosis detecting kit and flow cytometry were used to detect the cell apoptosis, and Q-PCR to detect the level of caspase-3 mRNA expression. Caspase-3 protein level was determined using Western blot.Results: MTT results showed that the inhibition rate rose up to 86% from 6.22% with thalidomide concentration of 500 μg/mL from 31 μg/mL. Apoptosis rate of SKOV-3 was up to 52.66% after thalidomide treatment by final concentration of 300 μg/mL, which was significantly higher compared to the control group(P<0.05). Large areas of the green fluorescence were observed under fluorescent microscope, and the mRNA and protein levels of caspase-3 in SKOV-3 after thalidomide administration were significantly increased as compared with the blank control group(P<0.01).Conclusion: Thalidomide is able to inhibit the proliferation and promote apoptosis of ovarian cancer cell line SKOV-3.

    thalidomide; ovarian cancer; cell apoptosis

    1002-0217(2017)05-0433-04

    安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃重點項目(gxyqZD2016172);大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃(201510368038; 201610368116 )

    2017-06-02

    張 玲(1978-),女,主治醫(yī)師,(電話)13855308893,(電子信箱)71926023@qq.com;李 曙,男,副教授,(電子信箱) yxx2003@126.com,通信作者。

    R 737.31

    A

    10.3969/j.issn.1002-0217.2017.05.007

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