一種新的基于微透析技術(shù)研究靶器官藥代動(dòng)力學(xué)方法

， ，，，

(皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,安徽 蕪湖 241002)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

一種新的基于微透析技術(shù)研究靶器官藥代動(dòng)力學(xué)方法

費(fèi)佳麗，朱岳，馬張慶，年四輝，洪宗元

(皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,安徽 蕪湖 241002)

目的：采用微透析技術(shù)結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)研究金剛烷胺在大鼠紋狀體細(xì)胞外液中的藥代動(dòng)力學(xué)(藥動(dòng)學(xué))過程，探討靶器官藥動(dòng)學(xué)研究方法。方法SD大鼠(雄性，8～10周齡)行烏拉坦麻醉(1.0 g/kg)后，手術(shù)植入微透析探針于大鼠紋狀體，以人工腦脊液恒速(2 μL/min)灌注探針。灌注1 h后，腹腔注射鹽酸金剛烷胺(1.0 mg/kg)，注射后立即收集透析液樣本，樣本收集間隔時(shí)間為12 min，連續(xù) 6 h。用LC-MS/MS法檢測透析樣本中金剛烷胺濃度，藥物濃度-時(shí)間曲線及計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)用DAS軟件擬合。結(jié)果金剛烷胺在大鼠紋狀體細(xì)胞外液中濃度-時(shí)間變化呈一室開放模型，其主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tmax、Cmax、t1/2和 AUC0-∞為(1.78±0.59)h、(38.56±9.10)μg/L、(2.07±0.35)h和(591.84±278.39)μg/(L·h)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)建立了一種基于微透析采樣結(jié)合LC-MS/MS法研究金剛烷胺在大鼠紋狀體細(xì)胞外液中藥代動(dòng)力學(xué)過程的實(shí)驗(yàn)方法，該方法操作簡單、靈敏度高，為研究藥物在靶器官中的藥動(dòng)學(xué)過程提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。

金剛烷胺；微透析；靶器官；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；藥代動(dòng)力學(xué)

帕金森病[1](Parkinson′s disease,PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，目前藥物是主要的治療手段[2]，金剛烷胺是治療PD的經(jīng)典藥物之一。據(jù)報(bào)道，金剛烷胺可促進(jìn)腦內(nèi)紋狀體中多巴胺能神經(jīng)元合成、釋放和減少多巴胺重?cái)z取，并加強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺與兒茶酚胺的作用而發(fā)揮抗PD作用[3]。與此同時(shí)，金剛烷胺可引起精神不安、失眠和運(yùn)動(dòng)失調(diào)等不良反應(yīng)[4]，這些不良反應(yīng)的發(fā)生與其用量和(或)給藥間隔時(shí)間不當(dāng)相關(guān)聯(lián)，其原因?yàn)槟壳芭R床制定給藥方案的依據(jù)是金剛烷胺在血液中的藥代動(dòng)力動(dòng)學(xué)參數(shù)。研究表明，合理的臨床給藥方案應(yīng)以靶器官內(nèi)藥物濃度為基礎(chǔ)，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并制訂給藥方案。但是，由于方法學(xué)的限制，目前金剛烷胺在其靶器官紋狀體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究尚未見報(bào)道。

在體微透析(invivomicrodialysis，MD)是一種新型的生物采樣技術(shù)，可對(duì)動(dòng)物靶器官或靶組織進(jìn)行在體采樣，借助于現(xiàn)代高靈敏度的檢測技術(shù)可檢測樣本中的藥物濃度，研究藥物在靶器官或靶組織中的藥動(dòng)學(xué)過程。由于微透析探針具有截留大分子的特點(diǎn)，所采集的透析液中只含有具有藥理活性的游離藥物(不包含蛋白結(jié)合藥物)，且所得樣本干凈，不需特殊處理即可直接進(jìn)樣分析等優(yōu)點(diǎn)[5-6]，故此目前該技術(shù)已被應(yīng)用于藥動(dòng)學(xué)研究。

本實(shí)驗(yàn)將采用MD技術(shù)結(jié)合LC-MS/MS檢測方法，研究金剛烷胺在大鼠紋狀體中的藥動(dòng)學(xué)過程，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并以此為基礎(chǔ)制訂合理的金剛烷胺臨床給藥方案。同時(shí)，也為研究藥物在靶器官中的藥動(dòng)學(xué)過程提供新的實(shí)驗(yàn)方法學(xué)。

1 材料與方法

1.2 藥品與試劑 鹽酸金剛烷胺(含量為99%，批號(hào)：A1508047，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，烏拉坦(上?；瘜W(xué)試劑廠)，甲醇、乙腈和甲酸(均為色譜純，德國默克股份有限公司)。

1.3 主要儀器 色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)：Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent 6460三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；色譜柱(ZORBAX SB-C18 2.1 mm×50 mm，Agilent)，預(yù)柱(ZORBAX SB-C18 2.1 mm×50 mm，Agilent)。微透析系統(tǒng)：微透析探針(瑞典CMA12 Elite 14型長探針，半透膜長4 mm，日本)，注射器(型號(hào)Hamilton，規(guī)格5.0 mL，美國)，微量注射泵(型號(hào)RS232,KD Scientific，美國)，微量樣本自動(dòng)收樣器(型號(hào) MAB85，瑞典)。腦立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。

1.4 色譜條件及質(zhì)譜條件 色譜條件：流動(dòng)相，乙腈∶0.05%甲酸=12∶88(v∶v)；流速0.2 mL/min；柱溫25℃；進(jìn)樣量17 μL。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，在正離子模式下以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)的質(zhì)譜掃描方式進(jìn)行檢測，金剛烷胺的選擇監(jiān)測離子反應(yīng)為m/z152.1→m/z134.8和m/z152.1→m/z92.8。干燥氣溫度為325℃，干燥氣流量為10 L/min，霧化氣壓力為20 psi，鞘氣溫度為400℃，鞘氣流量為11 L/min，毛細(xì)管電壓3500 V，噴嘴電壓1000 V，碰撞電壓18 eV。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及線性范圍 精密稱取一定量的鹽酸金剛烷胺，依次加入按1.6方法收集的空白透析液稀釋成0.3125、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0 ng/mL系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液17 μL，依次進(jìn)樣分析。以金剛烷胺濃度(x)對(duì)峰面積(y)進(jìn)行回歸計(jì)算，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 微透析采樣與藥物濃度測定 在麻醉狀態(tài)下(烏拉坦，1.0 g/kg，腹腔注射)，將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上，消毒、手術(shù)，植入微透析探針于大腦一側(cè)紋狀體，定位坐標(biāo)[7]為前囟前1.7 mm，深度1.4 mm，旁開5.4 mm。以恒定速度2 μL/min向微透析探針灌流aCSF。1 h后，腹腔注射1.0 mg/kg鹽酸金剛烷胺，連續(xù)收集透析樣本6 h，樣本收集間隔時(shí)間為12 min。透析液樣本離心后進(jìn)樣測定金剛烷胺濃度。

1.7 微透析探針回收率測定 采用增量法[8]測定微透析探針的回收率。將探針分別浸入3種不同濃度(0.25、2.0、8.0 ng/mL)的鹽酸金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液中，用aCSF灌流微透析探針(灌流速度為2 μL/min)，每種濃度下分別收集5個(gè)透析液樣本，測定樣本中金剛烷胺濃度(C測)，計(jì)算探針回收率R=C測/C標(biāo)，C標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品中金剛烷胺濃度。

1.8 細(xì)胞外液中藥物實(shí)際濃度計(jì)算 紋狀體細(xì)胞外液中金剛烷胺實(shí)際濃度C實(shí)際=C透析液/R，C透析液為透析液樣本中檢測濃度。

2 結(jié)果

2.1 色譜行為與回歸方程 圖1為按1.4方法測得的金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品和腦紋狀體透析液樣本的LC-MS/MS色譜圖。由圖可見，基線噪音小，金剛烷胺分離完全，不受溶劑和透析液中雜質(zhì)干擾，峰形良好，保留時(shí)間約為2.31 min。金剛烷胺在0.3125～10.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=45.439x+11.07(r2=0.9987，n=6)，檢測限為0.5 ng/mL(S/N=3)。

A：人工腦積液；B：空白微透析液 + 金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品(1.25 ng/mL)；C：紋狀體透析液樣本(注射金剛烷胺1.0 mg/kg后)；1：金剛烷胺。

圖1 金剛烷胺LC-MS/MS色譜圖

2.2 精密度與回收率 用aCSF配制高、中、低(5.0、2.5、0.625 ng/mL)3種濃度的金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，取17 μL進(jìn)樣檢測分析。于一天內(nèi)平行進(jìn)行5次測定計(jì)算日內(nèi)精密度，連續(xù)5 d重復(fù)操作計(jì)算日間精密度(n=5)。結(jié)果見表1，金剛烷胺樣品日內(nèi)RSD和日間RSD分別為1.19%～7.83%和1.68%～8.28%，均<10%，相對(duì)回收率為96.83%～104.98%，均滿足方法學(xué)驗(yàn)證要求。

標(biāo)記濃度(ng/mL)檢測濃度(ng/mL)相對(duì)回收率/%精密度(RSD,%)日內(nèi)日間5.05.25±0.09104.98±0.091.191.682.52.42±0.0896.74±0.081.983.190.6250.61±0.0596.83±0.067.838.28

2.3 探針回收率的計(jì)算 配制3種不同濃度的金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.7方法測定微透析探針的回收率約為20.1%，見表2。

Cmark/(ng/mL)Cdetection/(ng/mL)R/%0.250.04±0.0119.04±0.042.000.42±0.0620.78±0.038.001.64±0.0820.52±0.01

2.4 金剛烷胺在大鼠紋狀體細(xì)胞外液中的藥動(dòng)學(xué)

2.4.1 金剛烷胺濃度-時(shí)間曲線 大鼠腹腔注射1.0 mg/kg鹽酸金剛烷胺后，紋狀體中金剛烷胺算術(shù)濃度-時(shí)間曲線及對(duì)數(shù)濃度-時(shí)間曲線(C-T)分別見圖2A和2B。DAS3.0軟件計(jì)算結(jié)果顯示，金剛烷胺在紋狀體細(xì)胞外液中的濃度變化過程呈一室開放模型，達(dá)峰時(shí)間藥為1.78 h。

2.4.2 藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 用DAS3.0軟件計(jì)算金剛烷胺在紋狀體細(xì)胞外液中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表3。

A.算術(shù)C-T曲線；B.對(duì)數(shù)C-T曲線。

參數(shù)數(shù)值t1/2/h2.07±0.35Ke/(1/h)0.34±0.06V1/F/(L/kg)6.26±3.28CL/F/[L/(h·kg)]2.19±1.34AUC(0-t)/[μg/(L·h)]560.00±289.55AUC(0-∞)/[μg/(L·h)]591.84±278.39Ka/(1/h)1.52±0.84t1/2Ka/h0.61±0.40Cmax/(μg/L)38.56±9.10Tmax/h1.78±0.59

3 討論

本文采用MD技術(shù)結(jié)合LC-MS/MS檢測方法研究了金剛烷胺在大鼠紋狀體中的藥動(dòng)學(xué)過程。結(jié)果顯示金剛烷胺在大鼠紋狀體中呈一室開放模型變化，Tmax、Cmax、t1/2等主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分別為(1.78±0.59)h、(38.56±9.10)μ/L、(2.07±0.35)h。與以傳統(tǒng)給藥后采集血液，分離血漿并檢測血漿中藥物濃度計(jì)算的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(數(shù)據(jù)未列)比較，大鼠紋狀體細(xì)胞外液中金剛烷胺t1/2長于血漿(血漿t1/2為1.77 h，P<0.05)，表明金剛烷胺在腦紋狀體內(nèi)的消除速度比血漿慢；紋狀體細(xì)胞外液中金剛烷胺的達(dá)峰時(shí)間Tmax也顯著延長(血漿Tmax為0.5 h，P<0.01)，導(dǎo)致這種差異的原因可能與血腦屏障有關(guān)；紋狀體細(xì)胞外液中金剛烷胺的達(dá)峰濃度Cmax則顯著降低(血漿Cmax為100.84 μg/L，P< 0.01)，這是因?yàn)檠獫{中金剛烷胺濃度為混合濃度(即游離濃度和與血漿蛋白結(jié)果濃度之和)，而用MD技術(shù)采樣測得的僅為游離藥物濃度所致。

以上數(shù)據(jù)間的差異表明，金剛烷胺在大鼠紋狀體細(xì)胞外液中的藥動(dòng)學(xué)過程與其在血液中不同，因此以血漿藥物濃度代替非靶器官內(nèi)藥物濃度進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究，結(jié)果不夠準(zhǔn)確，以該藥動(dòng)學(xué)參數(shù)制訂的給藥方案也不夠合理。首先血漿中的藥物濃度是一種混合濃度，既包括了發(fā)揮藥效作用的游離型藥物濃度，也包括了暫時(shí)不發(fā)揮藥效的結(jié)合型藥物濃度；其次對(duì)于靶器官為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，也存在血腦屏障而對(duì)藥物吸收入腦的影響[9-10]。臨床資料顯示，金剛烷胺在發(fā)揮抗PD作用時(shí)，會(huì)引起精神不安、失眠和運(yùn)動(dòng)失調(diào)等不良反應(yīng)[4]，并認(rèn)為這些不良反應(yīng)的發(fā)生為其用量過大致靶器官濃度過高所致。因此，最優(yōu)的臨床用藥方案應(yīng)該根據(jù)藥物在其作用的靶器官中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)來制定。

應(yīng)用MD采樣技術(shù)研究藥物藥動(dòng)學(xué)過程除了以上優(yōu)點(diǎn)外，尚具有以下特點(diǎn)[11-13]：①取樣量小，連續(xù)長時(shí)間取樣不引起取樣部位的容積變化，對(duì)生物體內(nèi)的平衡干擾小，所得數(shù)據(jù)更加可靠；②樣品純凈，不含大分子物質(zhì)，不需進(jìn)行樣本處理而直接進(jìn)樣檢測；③可與多種分析儀器如HPLC、LC-MS/MS等聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)連續(xù)在線檢測；④可在動(dòng)物清醒狀態(tài)(生理狀態(tài))或麻醉狀態(tài)下進(jìn)行采樣，達(dá)到研究藥物在動(dòng)物生理和病理狀態(tài)下的藥動(dòng)學(xué)特征。

總之，本實(shí)驗(yàn)建立了一種基于在體MD采樣技術(shù)，結(jié)合LC-MS/MS檢測方法測定金剛烷胺在靶器官紋狀體中藥物濃度的方法。該方法操作簡單，所測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為臨床合理應(yīng)用金剛烷胺提供了藥動(dòng)學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為研究藥物在靶器官中的藥動(dòng)學(xué)過程提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。

[1] CAPRIOTTI T,TERZAKIS K. Parkinson Disease[J]. Home Healthc Now,2016，34(6):300-307.

[2] QUINN N. Drug Treatment Of Parkinson′s Disease[J]. BMJ,2015,310(6979):575.

[3] PAHWA R,TANNER CM,HAUSER RA,etal. Amantadine extended release for levodopa-induced dyskinesia in Parkinson′s disease (EASED Study)[J]. Movement Disorders Official Journal of the Movement Disorder Society,2015,30(6):788-795.

[4] 楊寶峰. 藥理學(xué)[M].8版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2013：135.

[5] LINDQVIST A,JANSSON B,HAMMARLUND-UDENAES M. Quantitative analysis of the opioid peptide DAMGO in rat plasma and microdialysis samples using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2012,900:11-17.

[6] BARKER SA,BORJIGIN J,LOMMICKA I,etal. LC/MS/MS analysis of the endogenous dimethyltryptamine hallucinogens,their precursors,and major metabolites in rat pineal gland microdialysate[J]. Biomed Chromatogr,2013,27(12):1690-700.

[7] YONG Z,YAN L,ZHOU P,etal. Effects of thienorphine on release of dopamine and noradrenalin:An in vivo microdialysis study in rats[J]. Neuroscience Letters,2012,513(2):132-136.

[8] 馬博，孫桂波，李明，等. 鉤藤堿微透析探針回收率測定及影響因素研究[J]. 中國新藥雜志，2012,21(20):2371-2375.

[9] 馬張慶，陶芳，方浩，等. 應(yīng)用微透析技術(shù)研究鹽酸曲馬多在小鼠額葉皮質(zhì)細(xì)胞外液中的藥動(dòng)學(xué)[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2013,48(3):406-410.

[10] 馬愛梅，趙永波，陳英輝. 苯妥英鈉在大鼠血液和腦細(xì)胞外液藥動(dòng)學(xué)研究[J]. 中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2005,13(2):118-122.

[11] 李范珠，馮健. 腦微透析技術(shù)及其在腦內(nèi)藥動(dòng)學(xué)中的應(yīng)用[J]. 中國藥學(xué)雜志，2006,41(6):405-407.

[12] 趙寧，程巧鴛，俞文英，等. 微透析技術(shù)在藥動(dòng)-藥效學(xué)結(jié)合研究中的應(yīng)用[J].國際藥學(xué)研究雜志，2008,35(2):100-106.

[13] LIU X,VAN NATTA K,YEO H,etal. Unbound Drug Concentration in Brain Homogenate and Cerebral Spinal Fluid at Steady State as a Surrogate for Unbound Concentration in Brain Interstitial Fluid [J]. Drug Metabol Disp,2009,37(4):787-793.

Aninnovationexperimentalmethodforstudyingpharmacokineticsofdrugsintargetorgansusinginvivomicrodialysis

FEIJiali,ZHUYue,MAZhangqing,NianSihui,HONGZongyuan

School of Pharmacy,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Objective： To explore the research method for pharmacokinetics of drugs in target organs via examining the pharmacokinetic process of amantadine in the extracellular fluid of striatum of rats usinginvivomicrodialysis and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technique.Methods:Male SD rats,aged 8-10 weeks were anaesthetized with urethane in dosage of 1.0 g/kg. A microdialysis probe was implanted into the striatum and artificial cerebrospinal fluid (aCSF) was injected at flow rate of 2 μL/min. After 1 h of aCSF perfusion,amantadine was intraperitoneally administered in dose of 1.0 mg/kg,and dialysate was instantly collected in 6 h by interval of 12 min. Amantadine concentration in the dialysate was measured using LC- MS/MS. The concentration-time profile and pharmacokinetic parameters of amantadine were calculated by DAS software.Results:The concentration-time profile of amantadine in the striatum of rats was fitted to one-compartment open model. The main pharmacokinetic parameters Tmax,Cmax,t1/2and AUC0-∞were (1.78±0.59)h,(38.56±9.10)μg/L,(2.07±0.35)h and (591.84±278.39)μg/(L·h) in the striatum extracellular fluid,respectively.Conclusion:We have successfully created the experimental method for studying pharmacokinetic process of amantadine in the striatum of rats usinginvivomicrodialysis with LC-MS/MS. This technique may provide methodology basis for research pharmacokinetics of drugs in target organs due to its simple performance and higher sensitivity.

amantadine;microdialysis;target organ;LC-MS/MS;pharmacokinetics

1002-0217(2017)05-0409-04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81671318，81171255)；安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目(1501041157)

2017-03-06

費(fèi)佳麗(1990-)，女，2014級(jí)碩士研究生，(電話)15156319032，(電子信箱)535865611@qq.com；洪宗元，男，教授，(電子信箱)zyhongwnmc@aliyun.com，通信作者。

R 96

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2017.05.001