復(fù)方龍芩草微乳提取液有效成分體外抗H1N1流感病毒的藥效研究

劉曉艷，李妍，劉帥，李衛(wèi)飛，顧立剛，劉曉婷，杜紅

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥防治病毒性疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029

復(fù)方龍芩草微乳提取液有效成分體外抗H1N1流感病毒的藥效研究

劉曉艷1，李妍1，劉帥1，李衛(wèi)飛1，顧立剛2，劉曉婷2，杜紅1

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥防治病毒性疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029

目的 研究復(fù)方龍芩草微乳提取液中有效成分體外抗H1N1流感病毒增殖的作用，觀察微乳提取液中有效成分對(duì)流感病毒的抑制率。方法 用均勻設(shè)計(jì)法安排實(shí)驗(yàn)，MTT法檢測(cè)藥物對(duì)H1N1流感病毒致A549細(xì)胞病變的抑制效率（ER），以ER為指標(biāo)，運(yùn)用Minitab17軟件建立數(shù)學(xué)模型得出各因素之間的回歸方程，分析各成分對(duì)ER的作用關(guān)系并優(yōu)選出具有最佳抗H1N1流感病毒效果的有效成分比例。結(jié)果 復(fù)方成分中，黃芩苷發(fā)揮最顯著的抗病毒作用，甘草苷對(duì)細(xì)胞病變有一定的抑制作用，5種成分對(duì)ER存在協(xié)同或制約性的關(guān)系。每毫升藥液含甘草苷、黃芩苷、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸分別為13.94 μg、49.44 μg、0.23 mg、1.25 mg、2.50 mg時(shí)ER值最佳，經(jīng)驗(yàn)證ER值為85.34%±4.72%。結(jié)論 復(fù)方龍芩草微乳提取液有效成分的優(yōu)化組合能較好發(fā)揮抗H1N1流感病毒的作用。

復(fù)方龍芩草；微乳提取液；均勻設(shè)計(jì)；H1N1流感病毒；A549細(xì)胞

甲型H1N1流感是由H1N1流感病毒引起的一種傳染迅速、死亡率高的呼吸道傳染病[1]。復(fù)方龍芩草由黃芩、甘草和地龍3味中藥組成，具有清肺利咽、解毒瀉熱之功效[2-3]，對(duì)甲型H1N1流感具有較好的抵抗效果[4]。復(fù)方龍芩草微乳提取液是以生物相容性微乳為溶劑，運(yùn)用滲漉法對(duì)復(fù)方龍芩草進(jìn)行提取而得，能較好地抑制H1N1流感病毒增殖[5]。近年來(lái)，中藥有效組分或成分配伍研究逐漸受到青睞，復(fù)方中有效成分配伍往往可提高療效，改善復(fù)方成分復(fù)雜、作用機(jī)制不明確的缺陷[6]，均勻設(shè)計(jì)法在復(fù)方有效成分或組方配伍的藥效篩選中具有明顯的優(yōu)勢(shì)[7-8]。本實(shí)驗(yàn)以復(fù)方龍芩草微乳提取液中含量較高的成分黃芩苷、甘草苷及地龍中的氨基酸為基礎(chǔ)，從細(xì)胞水平探討其對(duì)H1N1流感病毒致細(xì)胞病變的抑制作用，擬設(shè)計(jì)出藥效物質(zhì)基礎(chǔ)明確、安全有效的抗H1N1流感病毒的有效成分組方，為后續(xù)研究提供思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 病毒和細(xì)胞

甲型H1N1流感病毒，A1/黔防/166/85株，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院提供，-75 ℃冷藏，血凝滴度為2～7。人肺腺癌細(xì)胞（A549），中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。

1.2 藥物

甘草苷（批號(hào)111610-201106，40 mg/支）、黃芩苷（批號(hào)110715-201318，100 mg/支）、谷氨酸（批號(hào)140690-201203，100 mg/支）、天冬氨酸（批號(hào)140691-200401，100 mg/支）、亮氨酸（批號(hào)140687-201102，100 mg/支），中國(guó)食品藥品檢定研究院；磷酸奧司他韋膠囊（達(dá)菲，75 mg/粒），瑞士巴塞爾豪夫邁羅氏公司，批號(hào)H20044397。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清、McCoy's 5A培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲亞砜（DMSO），Sigma公司；0.25%胰酶-0.02%EDTA，北京普博欣生物科技有限公司；三聯(lián)溶解液（含SDS 10 g、異丁醇5 mL、10 mol/L HCl 0.1mL）；細(xì)胞培養(yǎng)液：McCoy's 5A培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素）；細(xì)胞維持液：McCoy's 5A培養(yǎng)基（含2%胎牛血清和1%青-鏈霉素）。細(xì)胞培養(yǎng)箱（BINDER WMK-02型），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司），超凈工作臺(tái)（北京碧都凈化設(shè)備有限公司），酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司），水浴箱（北京醫(yī)療設(shè)備廠），Astell全自動(dòng)高壓滅菌器（北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

從-75 ℃冰箱取出A549細(xì)胞復(fù)蘇，傳代3～4次，細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)以0.25%胰酶-0.02%EDTA消化細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×108個(gè)/L，充分混勻后將該細(xì)胞液以每孔100 μL加入96孔板中，35 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)數(shù)小時(shí)使細(xì)胞以單層狀態(tài)鋪滿培養(yǎng)瓶底層。用細(xì)胞維持液將黃芩苷、甘草苷、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和達(dá)菲分別連續(xù)對(duì)倍遞次稀釋至不同濃度，加入96孔板中，每孔100 μL，每個(gè)濃度平行設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組。35 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，加入MTT（終濃度為0.5 mg/mL），培養(yǎng)4 h后每孔加100 μL SDS，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定細(xì)胞吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率（實(shí)驗(yàn)組A值÷正常細(xì)胞對(duì)照組A值×100%）。

2.2 病毒致細(xì)胞病變實(shí)驗(yàn)

取已長(zhǎng)成單層細(xì)胞的96孔板，吸出培養(yǎng)液，每孔加PBS清洗2次，每孔接種100 μL 100TCID50病毒液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h后吸出病毒液，加入最大無(wú)毒濃度下6個(gè)相應(yīng)稀釋度的黃芩苷、甘草苷、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸溶液，以達(dá)菲為陽(yáng)性對(duì)照組，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組，每孔100 μL，每濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果，細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）用0%～25%（+）、25%～50%（++）、50%～75%（+++）、75%～100%（++++）表示，當(dāng)病毒對(duì)照組CPE為++++時(shí)記錄結(jié)果。隨后加入MTT（終濃度為0.5 mg/mL），每孔10 μL，4 h后加100 μL/孔SDS，培養(yǎng)8 h，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定A值。計(jì)算藥物抗病毒效率（ER）。ER（%）＝（藥物組平均A值－病毒對(duì)照組平均A值）÷（正常細(xì)胞對(duì)照組平均A值－病毒對(duì)照組平均A值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

2.3 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)每個(gè)有效成分對(duì)流感病毒的ER及對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響情況設(shè)置均勻試驗(yàn)的上下限，根據(jù)均勻設(shè)計(jì)水平數(shù)不得少于2倍因素?cái)?shù)的原則，本試驗(yàn)采用5因素10水平[U10*(105)]設(shè)計(jì)試驗(yàn)，D＝0.241 4，指標(biāo)數(shù)為1，見(jiàn)表1。

表1 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

2.4 細(xì)胞病變抑制率測(cè)定

根據(jù)表1安排的試驗(yàn)進(jìn)行藥物組分對(duì)細(xì)胞病變抑制率檢測(cè)，取已長(zhǎng)成單層細(xì)胞的96孔板，吸出培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 100TCID50病毒液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱吸附2 h后，吸出病毒液，加入表1中的10組藥液，每孔100 μL，以達(dá)菲為陽(yáng)性藥物對(duì)照組，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組，每濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入MTT（終濃度為0.5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加SDS，12 h后于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定A值，計(jì)算ER。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

2.5 組分配比的優(yōu)選

根據(jù)均勻試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Minitab17軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析處理，探討各成分對(duì)抗病毒效率的影響及相互關(guān)系，并優(yōu)選出具有最佳抗H1N1流感病毒效果的5種有效成分的配比。

2.6 最佳抗病毒效果的驗(yàn)證

取已長(zhǎng)成單層細(xì)胞的96孔板，吸出培養(yǎng)液，加入PBS清洗細(xì)胞2次，按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，驗(yàn)證有效成分配比的ER。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 有效成分的細(xì)胞毒性

較高濃度黃芩苷可使A549細(xì)胞變圓、破碎、折光率增加，當(dāng)濃度為50 μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率變化不明顯，細(xì)胞形態(tài)、折光率、數(shù)量與正常細(xì)胞對(duì)照組無(wú)明顯差異，25 μg/mL時(shí)與空白對(duì)照組比較，細(xì)胞形態(tài)幾乎無(wú)變化。甘草苷對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響與黃芩苷相似，濃度為25 μg/mL時(shí)細(xì)胞形態(tài)、貼壁狀態(tài)等與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸濃度均為5 mg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞基本無(wú)毒性，與空白對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。

4.2 有效成分對(duì)病毒致細(xì)胞病變抑制率的影響

當(dāng)黃芩苷濃度為50 μg/mL，ER值為87.810%± 1.905%時(shí)，對(duì)病毒致細(xì)胞病變的抑制作用最明顯，隨黃芩苷濃度降低，ER值逐漸變小。甘草苷濃度在25 μg/mL時(shí)能部分抑制細(xì)胞的病變，ER值也隨濃度的降低而下降，二者ER均呈一定的量效關(guān)系，見(jiàn)表2。天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸抗病毒效果不明顯，但在2.5～0.625 mg/mL濃度范圍內(nèi)，ER值大于空白對(duì)照組。

表2 黃芩苷、甘草苷對(duì)H1N1病毒CPE的影響及ER比較（±s，n＝4）

表2 黃芩苷、甘草苷對(duì)H1N1病毒CPE的影響及ER比較（±s，n＝4）

CPE ER/%組別濃度/（μg/mL）黃芩苷甘草苷 黃芩苷 甘草苷1 100.00 + ++ 70.836±2.410 －2 50.00 + +++ 87.810±1.905 41.423±6.404 3 25.00 + ++ 70.946±2.488 52.959±4.650 4 12.50 ++ +++ 66.273±2.386 43.138±3.525 5 6.25 ++ +++ 61.005±4.749 37.457±2.281 6 3.13 +++ +++ 43.693±3.733 26.691±2.967 7 1.56 +++ ++++ 25.475±3.190 17.118±1.650達(dá)菲組 0.75 + + 86.706±1.482 86.684±1.532

4.3 藥物不同配比對(duì)細(xì)胞病變抑制率的影響

根據(jù)“4.2”項(xiàng)中5個(gè)成分在細(xì)胞安全的劑量范圍內(nèi)ER值的大小，將每毫升藥液中黃芩苷、甘草苷的用量范圍分別設(shè)為50～12.5 μg和25～12.5 μg，結(jié)合氨基酸對(duì)細(xì)胞形態(tài)變化的影響，設(shè)亮氨酸用量范圍為2.5～0.625 mg，天冬氨酸為1.25～0.625 mg，谷氨酸為2.5～1.25 mg。均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)各成分用量及抗H1N1流感病毒效率（±s）

表3 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)各成分用量及抗H1N1流感病毒效率（±s）

試驗(yàn)號(hào)X1/μg X2/μg X3/mg X4/mg X5/mgER/% 1 12.50 20.83 1.249 0.903 2.361 40.82±3.48 2 13.89 33.33 2.082 1.250 2.083 34.66±2.63 3 15.28 45.83 0.625 0.834 1.805 79.06±4.77 4 16.67 12.50 1.457 1.181 1.530 41.40±3.58 5 18.06 25.00 2.290 0.764 1.250 34.08±1.14 6 19.44 37.50 0.832 1.111 2.500 48.50±5.22 7 20.83 50.00 1.665 0.695 2.220 60.72±4.72 8 22.22 16.66 2.500 1.042 1.944 31.48±6.54 9 23.61 29.17 1.040 0.625 1.666 40.15±3.79 10 0.75 41.67 1.873 0.972 1.388 30.74±5.78

4.4 數(shù)學(xué)模型的建立

4.4.1 回歸方程的建立 運(yùn)用Minitab17.0軟件處理均勻試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用逐步回歸分析法，引入對(duì)ER顯著變量，剔除不顯著變量，擬合得到回歸方程Y＝0.357 700－0.003 248X2＋0.025 440X1＋0.000 525X22＋0.001 958X52－0.001 213X1X2－0.086 280X3X4－0.000 418X2X3X5，其系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)和方差分析見(jiàn)表4、表5。從表4可以看出，在回歸方程模型中，除X52項(xiàng)外，其他各項(xiàng)系數(shù)均P＜0.05，表5中回歸方程P＜0.001，說(shuō)明該模型表示的指標(biāo)與各變量間的關(guān)系具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，方程擬合良好?；貧w方程殘差圖見(jiàn)圖1。

參考文獻(xiàn)：

[1] MICHAELIS M, DOERR H W, CINATL J J. An influenza a H1N1 virus revival-pandemic H1N1/09 virus[J]. Infection,2009,37(5)：381-389.

[2] 李海燕.龍芩草、通絡(luò)救腦組方成分的藥學(xué)、藥效學(xué)及作用機(jī)制[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué),2006.

[3] 成麗麗.龍芩草含片的藥學(xué)、藥效學(xué)及作用機(jī)制探討[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué),2007.

[4] 李海燕,牛欣,司銀楚.龍芩草噴霧劑抗流感病毒A1型(H1N1)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)(中醫(yī)臨床版),2006,13(3)：4-6.

[5] 劉曉艷,劉帥,李妍,等.復(fù)方龍芩草微乳提取液體外抗H1N1流感病毒的作用研究[J].天津中醫(yī)藥,2016,33(3)：172-176.

[6] 劉新軍,蘇式兵.中藥及其成分配伍組方的研究方法探析[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào),2009,7(7)：601-606.

[7] 仝欣,陳高峰,陸雁,等.基于均勻設(shè)計(jì)分析黃芪湯活性組分抗二甲基亞硝胺大鼠肝纖維化的配伍作用[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011,31(10)：1389-1393.

[8] 潘菊華,鄭軍,王彥云,等.基于均勻設(shè)計(jì)的開(kāi)心解郁方抗抑郁主效應(yīng)中藥篩選研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2014,21(12)：66-68.

[9] 張愛(ài)麗,章晨峰,邵杰.基于Minitab軟件優(yōu)化天舒膠囊一步制粒工藝[J].中草藥,2013,44(22)：3131-3135.

[10] 王麗,黃菱,李燕兵,等.黃芩苷對(duì)流感病毒性肺炎小鼠肺組織TLR3/ TRIF信號(hào)通路的作用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2014,25(10)：2354-2356.

[11] 程妍,李祥,陳建偉,等.板藍(lán)根有效部位的抗病毒藥效研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,27(2)：155-157.

[12] 傅小達(dá),符翠莉,李貴良.連花清瘟膠囊配合西藥治療甲型H1N1流感疑似患者33例[J].陜西中醫(yī),2011,32(11)：1492-1493.

[13] 張沂,劉曉婷,顧立剛,等.疏風(fēng)宣肺和解表清里方藥體內(nèi)外對(duì)流感病毒的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2015,30(2)：501-503.

[14] LAWRENCE M J, REES G D. Microemulsion-based media as novel drug delivery systems[J]. Advanced Drug Delivery Reviews,2000,45：89-121.

[15] MEHTA S K, KAUR G, BHASIN K K. Entrapment of multiple anti-Tb drugs in microemulsion system：quantitative analysis, stability, and in vitro release studies[J]. J Pharm Sci,2010,99(4)：1896- 1911.

[16] GOMEZ del R J A, HAYES D G. Protein extraction by Winsor-Ⅲmicroemulsion systems[J]. Biotechnol Prog,2011,27(4)：1091-1100.

[17] DING Y, DOU J, TENG Z J, et al. Antiviral activity of baicalin against influenza A (H1N1/H3N2) virus in cell culture and in mice and its inhibition of neuraminidase[J]. Arch Virol,2014, 159(12)：3269-3278.

[18] QIN S, MO Z Y, ZHAO H S, et al. Inhibitory effect of baicalin on influenza A virus PR8 strain in vitro[J]. Chin Med Mat,2012, 35(2)：280-283.

[19] 張春晶,顧立剛,于海濤,等.黃芩苷干預(yù)甲型H1N1流感病毒感染誘導(dǎo)的A549細(xì)胞周期分布及凋亡[J].病毒學(xué)報(bào),2011,27(2)：108-116.

[20] 唐亞軍,孟勝喜,馮琴,等.基于均勻設(shè)計(jì)的防治脂肪肝中藥有效組分復(fù)方篩選與驗(yàn)證[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,27(4)：53-57.

Study on Anti-influenza Virus H1N1 Activity of Main Ingredients from Microemulsion

Extract of Compound Longqincao in Vitro

LIU Xiao-yan1, LI Yan1, LIU Shuai1, LI Wei-fei1, GU Li-gang2,

LIU Xiao-ting2, DU Hong1(1.School of Chinese Pharmacy, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China; 2. Educational Ministry Key Laboratory of Preventing and Treating Viral Diseases with Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

Objective To study the effects of main ingredients from microemulsion extract of Compound Longqincao in vitro on anti-influenza virus H1N1 activity; To analyze effects of main ingredients from microemulsion extract on influenza virus inhibition rate. Methods Uniform design was used to conduct the experiment. MTT method was used to detect the effect rate (ER) of anti-influenza virus H1N1 on A549 cells. Setting ER as the index, Minitab17 software was used to establish mathematical model to come up with regression equations of all factors. The effects of ingredients on ER were analyzed and the efficient composition ratio of the optimum anti-influenza virus H1N1 was chosen. Results In the compound compatibility, baicalin showed the most obvious antivirus activity, and licorice glycosides had certain inhibition effects on pathological changes of cells. Five ingredients had coordinative or controlled relation with ER. When per milliliter liquids containing licorice glycosides, baicalin, leucine, aspartic acid, glutamic acid was 13.94 μg, 49.44 μg, 0.23 mg, 1.25 mg, and 2.50 mg, ER was the best. ER was 85.34%±4.72% after verification. Conclusion The optimized combination of main ingredients from microemulsion extract of Compound Longqincao can better play a role in anti-influenza virus H1N1.

Compound Longqincao; microemulsion extract; uniform design; H1N1 influenza virus; A549 cells

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.013

R285.5

A

1005-5304(2017)01-0049-06

2016-03-29）

（

2016-04-25；編輯：華強(qiáng)）

國(guó)家自然科學(xué)基金(81102815)；教育部博士點(diǎn)新教師基金(20110013120017)；北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生自主課題(2016-JYB-XS069)

杜紅，E-mail：duhong@vip.163.com