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    ‘槜李’果實(shí)軟化相關(guān)基因PsPG的克隆與表達(dá)分析

    2017-12-27 05:25:53賈展慧張計(jì)育賈曉東翁文昕宣繼萍郭忠仁
    關(guān)鍵詞:軟化結(jié)構(gòu)域克隆

    王 剛, 賈展慧, 張計(jì)育, 賈曉東, 王 濤, 翁文昕, 宣繼萍, 郭忠仁

    〔江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園), 江蘇 南京 210014〕

    ‘槜李’果實(shí)軟化相關(guān)基因PsPG的克隆與表達(dá)分析

    王 剛, 賈展慧, 張計(jì)育, 賈曉東, 王 濤, 翁文昕, 宣繼萍①, 郭忠仁①

    〔江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園), 江蘇 南京 210014〕

    研究了室溫〔(25±1) ℃〕貯藏、低溫〔(4±1) ℃〕貯藏、1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)處理和減壓浸鈣處理?xiàng)l件下‘槜李’(Prunussalicina‘Zuili’)果實(shí)硬度的動(dòng)態(tài)變化,進(jìn)一步克隆獲得‘槜李’的多聚半乳糖醛酸酶基因(PsPG),并對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)和表達(dá)分析。結(jié)果表明:低溫貯藏、1-MCP處理和減壓浸鈣處理可有效減緩‘槜李’果實(shí)硬度下降?!畼椑睢疨sPG基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為1 134 bp,編碼377個(gè)氨基酸。PsPG蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由11.14%的α螺旋、31.03%的β折疊和57.82%的無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示:PsPG蛋白含有果膠酸裂解酶3結(jié)構(gòu)域和4個(gè)PbH1結(jié)構(gòu)域;PsPG基因與Prunuspersica(Linn.) Batsch和PrunusarmeniacaLinn.的PG基因編碼的氨基酸序列的親緣關(guān)系較近,相似度達(dá)96%以上。qRT-PCR分析結(jié)果顯示:隨著采后貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),低溫貯藏、1-MCP處理和減壓浸鈣處理?xiàng)l件下PsPG基因的相對(duì)表達(dá)量均呈先升高后降低的趨勢(shì),且分別于貯藏5、3和5 d達(dá)到最高值。研究結(jié)果顯示:‘槜李’PsPG基因與其果實(shí)軟化關(guān)系密切,低溫貯藏是‘槜李’果實(shí)采后保鮮的有效手段,可抑制PsPG基因的表達(dá)以延緩果實(shí)軟化。

    ‘槜李’;PsPG基因; 克??; 基因表達(dá); 果實(shí)軟化

    軟化不僅是果實(shí)成熟的顯著特征,也是影響采后果實(shí)貯藏品質(zhì)和貨架期的重要因子。在果實(shí)軟化過(guò)程中,細(xì)胞壁的降解和細(xì)胞總體結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致細(xì)胞壁松動(dòng)和分離。目前,對(duì)參與果實(shí)軟化過(guò)程細(xì)胞壁降解的多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)已有廣泛研究,雖然研究表明PG可能不是惟一調(diào)節(jié)果實(shí)軟化進(jìn)程的關(guān)鍵酶[1],但在蘋(píng)果(MalusdomesticaBorkh.)[2]、翠冠梨(Pyruspyrifolia‘Cuiguan’)[3]、Prunuspersica(Linn.) Batsch[4]和Prunusdomesticasubsp.insititia(Linn.) C. K. Schneid.[5]的果實(shí)成熟過(guò)程中PG積累并負(fù)責(zé)水解細(xì)胞壁中多聚半乳糖醛酸中的1,4-α-D-半乳糖苷鍵,同時(shí)伴隨mRNA轉(zhuǎn)錄水平和PG活性的上升,說(shuō)明PG在核果類果實(shí)軟化過(guò)程中起著重要作用。

    植物中PGs是一個(gè)大的基因家族[6],不同成員的應(yīng)激反應(yīng)和時(shí)空表達(dá)存在差異。目前,已分離獲得Prunuspersica[4]、Prunusdomesticasubsp.insititia[5]、中華獼猴桃(ActinidiachinensisPlanch.)[7]、甜瓜(CucumismeloLinn.)[8]、葡萄(VitisviniferaLinn.)[9]、西洋梨(PyruscommunisLinn.)[10]和草莓(Fragaria×ananassaDuch.)[11]等植物果實(shí)的PG基因,這些基因在果實(shí)軟化過(guò)程中發(fā)揮不同的作用。

    ‘槜李’(Prunussalicina‘Zuili’)是薔薇科(Rosaceae)李屬(PrunusLinn.)植物,主要分布于浙江嘉興地區(qū),是中國(guó)稀有的李中珍品。其果實(shí)含有豐富的氨基酸、鈣、鐵、維生素和有機(jī)酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分,且‘槜李’果實(shí)成熟時(shí)肉質(zhì)果肉化漿,汁液香如醴、甘如蜜,風(fēng)味獨(dú)特,深受人們喜愛(ài)?!畼椑睢麑?shí)屬于呼吸躍變型果實(shí),采收后迅速進(jìn)入呼吸高峰期,并在3 d內(nèi)快速軟化,達(dá)到后熟化漿狀態(tài),極不耐貯藏,限制了其商品性。闡明‘槜李’果實(shí)軟化的分子機(jī)制對(duì)調(diào)控其采收、貯藏和貨架期有很大幫助,但有關(guān)‘槜李’果實(shí)細(xì)胞壁降解基因的研究極少。

    本研究以‘槜李’果實(shí)為研究材料,克隆并結(jié)合不同采后處理研究了‘槜李’PG基因在采后貯藏期間的表達(dá)特性,以期揭示‘槜李’PG基因在其果實(shí)軟化過(guò)程中的作用,并為采取適宜措施延長(zhǎng)‘槜李’果實(shí)的貨架期提供理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    ‘槜李’果實(shí)采自浙江省桐鄉(xiāng)市桃園村‘槜李’種質(zhì)資源苗圃。2014年6月25日采收八成熟果實(shí),散去田間熱后裝箱運(yùn)回江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所果樹(shù)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室。挑選大小均一、熟度一致、無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí)并隨機(jī)分成4組進(jìn)行處理。共設(shè)置4個(gè)處理組:T1(室溫貯藏,對(duì)照),不做任何采后處理,(25±1) ℃貯藏;T2(低溫貯藏),不做任何采后處理,(4±1) ℃貯藏;T3(減壓浸鈣處理),在80 kPa下采用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)2% CaCl2溶液浸泡5 min后取出晾干,(25±1) ℃貯藏;T4〔1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)處理〕,在含0.5 μL·L-11-MCP氣體的密閉箱中放置24 h后拿出,(25±1) ℃貯藏。每處理組250個(gè)果實(shí)。采后當(dāng)天(記為0 d)開(kāi)始測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。果實(shí)硬度每天測(cè)定1次,共11次。每處理組每2 d取20個(gè)果實(shí)的果肉組織,去除外果皮和內(nèi)果皮后,將中果皮在液氮中速凍后,于-80 ℃冰箱中保存、備用。

    1.2 方法

    1.2.1 果實(shí)硬度測(cè)定 采用探頭直徑8 mm的GY-3型果實(shí)硬度計(jì)(浙江托普儀器有限公司)檢測(cè)‘槜李’去皮果實(shí)硬度。各處理組隨機(jī)抽取5個(gè)果實(shí),去掉果實(shí)縫合線兩側(cè)最大橫徑處的外果皮,在該區(qū)域測(cè)量硬度值。單果重復(fù)檢測(cè)4次。

    1.2.2 基因克隆 采用CTAB法[12]提取各處理組‘槜李’果肉組織總RNA,經(jīng)質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳和Onedrop OD-1000分光光度計(jì)(南京五義科技有限公司)檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度合格后,采用PrimeScriptTMReverse Transcriptase〔寶生物工程(大連)有限公司〕逆轉(zhuǎn)錄cDNA分別用于‘槜李’PsPG基因的克隆和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。具體操作見(jiàn)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。

    以GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)登錄的多種植物PG基因的核苷酸序列為基礎(chǔ),搜索并提取‘槜李’PG基因的可能序列,采用Primer Premier 5.0程序分別在序列的上游和下游設(shè)計(jì)并合成開(kāi)放閱讀框(ORF)驗(yàn)證引物。PsPG-F 的序列為 5′-TGGCGAACCGTAG AAGCCT-3′;PsPG-R 的序列為 5′-CTACAAACAA CTTGTAGGCTGAACC-3′。反應(yīng)體系包括10×PCR buffer 2.5 μL、25 mmol·L-1dNTPs mixture 2.0 μL、25 mmol·L-1MgCl21.5 μL、5 U·μL-1rTaq酶0.2 μL、10 μmol·L-1上游和下游引物各1.0 μL及模板cDNA 1.5 ng·μL-1,用ddH2O補(bǔ)足至終體積25.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s、56 ℃退火45 s、72 ℃延伸90 s,35個(gè)循環(huán);最后于72 ℃延伸10 min。采用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物,然后利用AxyPrep DNA凝膠試劑盒〔愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司〕回收PCR產(chǎn)物,再將回收產(chǎn)物與pMD19-T Vector〔寶生物工程(大連)有限公司〕連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中做TA克隆,挑取單克隆菌落經(jīng)PCR(反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同上)驗(yàn)證后送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。其中,MgCl2、dNTPs mixture和rTaq酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司,大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2.3 生物信息學(xué)分析 將克隆的‘槜李’果實(shí)細(xì)胞壁降解相關(guān)基因的cDNA或氨基酸序列使用不同的網(wǎng)絡(luò)程序或本地軟件進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析,即在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中提交克隆序列,并運(yùn)行BLASTn查找同源序列(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi);再利用BioXM查找序列的最大開(kāi)放閱讀框并推導(dǎo)氨基酸序列;而后用pI/Mw tool(http:∥www.expasy.org/tools/pi_tool.html)、ProtParam(http:∥expasy.org/tools/protparam.html)和Kyte-Doolittle(http:∥fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì);同時(shí),用SMART預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域,用GOR在線程序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(http:∥smart.embl-heidelberg.de/);利用DNAman 7.0進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì),利用MEGA 4.1[13]并運(yùn)用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),均用500次重復(fù)進(jìn)行bootstrap檢驗(yàn),采用默認(rèn)的Poisson correction模型和Complete deletion選項(xiàng)。

    1.2.4 基因表達(dá)分析 分別取各處理組‘槜李’果肉組織總RNA 1 μg,采用消除殘留DNA的試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser〔寶生物工程(大連)有限公司〕合成cDNA。

    根據(jù)qRT-PCR引物設(shè)計(jì)原則及克隆獲得的‘槜李’PG基因,采用Beacon Designer 7.0設(shè)計(jì)并合成熒光定量特異引物;選取蛋白延伸因子(EF-2)作為看家基因。根據(jù)NCBI上已登錄的EF-2設(shè)計(jì)引物。PsPG-qF 的序列為 5′-ATCTGGTGTCACAATCCTC AACTC-3′,PsPG-qR的序列為5′-GCCTCTTCTTG CTCCTTGCC-3′;EF-2-qF的序列為5′-GGTGTGA CGATGAAGAGTGATG-3′,EF-2-qR的序列為5′-TGAAGGAGAGGGAAGGTGAAAG-3′。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

    qRT-PCR反應(yīng)在Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System上進(jìn)行,反應(yīng)體系包括SYBR? Green qPCR Master Mix 10.0 μL、10 μmol·L-1上游和下游引物各0.3 μL及模板cDNA 1.0 μL,用ddH2O補(bǔ)足至終體積20.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸43 s,40個(gè)循環(huán);最后于72 ℃延伸5 min。溶解溫度設(shè)置為63 ℃~95 ℃?;虻南鄬?duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法[14]進(jìn)行計(jì)算。為了使結(jié)果更直接化,將室溫貯藏條件下各采后貯藏時(shí)間‘槜李’PG基因的相對(duì)表達(dá)量作為其他3個(gè)處理組對(duì)應(yīng)采后貯藏時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量的參照,并將每個(gè)處理組“0”點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量設(shè)為“1”,高于或低于“1”分別表示上調(diào)或下調(diào)。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    采用EXCEL 2007、SPSS 22.0和Origin v10.2.1統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表制作。

    2 結(jié)果和分析

    2.1 不同采后處理和貯藏條件下‘槜李’果實(shí)硬度的動(dòng)態(tài)變化

    不同采后處理和貯藏條件下‘槜李’果實(shí)硬度的動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖1。由圖1可以看出:4個(gè)處理組‘槜李’果實(shí)的硬度均呈持續(xù)下降趨勢(shì),且與采后貯藏時(shí)間呈線性負(fù)相關(guān)。其中,室溫貯藏(對(duì)照)條件下果實(shí)硬度下降最快,低溫貯藏條件下果實(shí)硬度下降較慢,1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)處理和減壓浸鈣處理?xiàng)l件下果實(shí)硬度下降速度居中。室溫貯藏條件下‘槜李’果實(shí)貯藏2 d,果實(shí)硬度急劇下降至0 kg·cm-2,即果實(shí)完全軟化;減壓浸鈣處理?xiàng)l件下果實(shí)貯藏4 d完全軟化;1-MCP處理和低溫貯藏條件下果實(shí)貯藏5 d完全軟化。

    —●—: 室溫貯藏Room temperature storage; —○—: 低溫貯藏Low temperature storage; —▲—: 1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)處理1-methylcyclopropene (1-MCP) treatment; —△—: 減壓浸鈣處理 Immersed in Ca2+ solution with decompression treatment.圖1 不同采后處理和貯藏條件下‘槜李’果實(shí)硬度的動(dòng)態(tài)變化Fig. 1 Dynamic change in fruit firmness of Prunus salicina ‘Zuili’ in different postharvest treatments and storage conditions

    2.2 ‘槜李’PsPG基因的克隆及生物信息學(xué)分析

    2.2.1PsPG基因的克隆 以GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)登錄的多種植物PG基因的核苷酸序列為基礎(chǔ),克隆‘槜李’PG基因的cDNA序列,獲得該基因開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為1 134 bp,編碼377個(gè)氨基酸,起始密碼子為ATG,終止密碼子為T(mén)AG。NCBI比對(duì)結(jié)果顯示:該基因與Prunuspersica和PrunusarmeniacaLinn.的PG基因的相似度分別達(dá)到98%和97%,說(shuō)明獲得的cDNA序列為‘槜李’PsPG基因,GenBank登錄號(hào)KX149044。

    2.2.2PsPG基因的生物信息學(xué)分析 運(yùn)用生物信息學(xué)在線軟件分析得出,‘槜李’PsPG蛋白的氨基酸總數(shù)為377。推導(dǎo)該蛋白質(zhì)的理論相對(duì)分子質(zhì)量為39 550,理論等電點(diǎn)pI 5.62。

    應(yīng)用GOR在線程序預(yù)測(cè)PsPG蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由11.14%的α螺旋、31.03%的β折疊和57.82%的無(wú)規(guī)則卷曲組成,其中,無(wú)規(guī)則卷曲是該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組分。

    ‘槜李’PsPG基因與其他4種植物PG基因編碼的氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可以看出:PsPG基因編碼的氨基酸序列含有果膠酸裂解酶3結(jié)構(gòu)域(pectate lyase 3 domain)和4個(gè)PbH1保守結(jié)構(gòu)域,其編碼的氨基酸序列與Prunuspersica、Prunusarmeniaca和西洋梨等果樹(shù)PG基因編碼的氨基酸序列相似度較高。

    1: ‘槜李’Prunus salicina ‘Zuili’; 2: Prunus persica (Linn.) Batsch; 3: Prunus armeniaca Linn.; 4: 西洋梨Pyrus communis Linn.; 5: Solanum lycopersicum Linn.圖2 ‘槜李’PsPG基因與其他4種植物PG基因編碼的氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果Fig. 2 Alignment result of amino acid sequences encoded by PsPG gene from Prunus salicina ‘Zuili’ and PG genes from other four species

    PsPG基因編碼的氨基酸序列與Prunuspersica的3個(gè)PG基因編碼的氨基酸序列(AAC64184、AAP21999和ABV32553)的相似度高達(dá)98%,與Prunusarmeniaca的2個(gè)PG基因編碼的氨基酸序列(ADT82706和AFD62267)的相似度在96%以上,與西洋梨的3個(gè)PG基因編碼的氨基酸序列(CAH18935、BAF42034和BAC22689)以及沙梨〔Pyruspyrifolia(Burm. f.) Nakai〕(AER27668)、Pyrus×bretschneideriRehd.(AGR44470)、甜橙〔Citrussinensis(Linn.) Osbeck〕(KDO51591)和葡萄(CAN78679)的PG基因編碼的氨基酸序列的相似度介于72%~79%之間。

    基于‘槜李’PsPG基因與其他8種植物PG基因編碼的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù),結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可以看出:所選大部分植物的PG基因編碼的氨基酸序列具有較高的同源性?!畼椑睢疨sPG基因編碼的氨基酸序列與Prunuspersica(AAC64184)和Prunusarmeniaca(ADT82706)的PG基因編碼的氨基酸序列的親緣關(guān)系最近,與西洋梨(CAH18935)、沙梨(AER276668)和Pyrus×bretschneideri(AGR44470)的PG基因編碼的氨基酸序列的親緣關(guān)系也較近,與甜橙(KDO51591)、葡萄(CAN78679)和大桉(EucalyptusgrandisW. Hill ex Maiden)(KCW57484)的PG基因編碼的氨基酸序列的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

    節(jié)點(diǎn)處數(shù)據(jù)表示自展值 Datums on the nodes indicate the bootstrap values. 1: ‘槜李’Prunus salicina ‘Zuili’; 2: Prunus persica (Linn.) Batsch; 3: 西洋梨Pyrus communis Linn.; 4: 沙梨Pyrus pyrifolia (Burm. f.) Nakai; 5: Prunus armeniaca Linn.; 6: Pyrus×bretschneideri Rehd.; 7: 甜橙Citrus sinensis (Linn.) Osbeck; 8: 大桉Eucalyptus grandis W. Hill ex Maiden; 9: 葡萄Vitis vinifera Linn.圖3 基于‘槜李’PsPG基因與其他8種植物PG基因編碼的氨基酸序列的系統(tǒng)樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of PsPG gene from Prunus salicina ‘Zuili’ and PG genes from other eight species

    2.3 不同采后處理和貯藏條件下‘槜李’PsPG基因的表達(dá)模式分析

    不同采后處理和貯藏條件下‘槜李’PsPG基因的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示:低溫貯藏和減壓浸鈣處理?xiàng)l件下,‘槜李’PsPG基因的相對(duì)表達(dá)量緩慢升高,貯藏5 d時(shí)達(dá)到最高值,隨后急劇降低(圖4-A,C),且貯藏5 d時(shí)果實(shí)完全軟化,PsPG基因的相對(duì)表達(dá)量分別約為同時(shí)期室溫貯藏條件下的30和60倍。1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)處理?xiàng)l件下,貯藏3 d時(shí)PsPG基因的相對(duì)表達(dá)量急劇升高至最高值,隨后迅速降低(圖4-B)。

    A: 低溫貯藏Low temperature storage; B: 1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)處理1-methylcyclopropene (1-MCP) treatment; C: 減壓浸鈣處理Immersed in Ca2+ solution with decompression treatment.圖4 不同采后處理和貯藏條件下‘槜李’PsPG基因的相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 Relative expression of PsPG gene from Prunus salicina ‘Zuili’ in different postharvest treatments and storage conditions

    3 討論和結(jié)論

    3.1 PsPG蛋白的結(jié)構(gòu)域與果實(shí)軟化關(guān)系密切

    ‘槜李’PsPG基因中的果膠酸裂解酶3結(jié)構(gòu)域具有類果膠酸裂解酶的β螺旋,其與糖苷水解酶第28家族(glycoside hydrolase,family 28,GH28)密切相關(guān),這些酶對(duì)細(xì)胞壁的代謝與降解具有重要作用。此外,在果膠酸裂解酶3結(jié)構(gòu)域內(nèi)還含有4個(gè)平行β螺旋重復(fù)(parallelβhelix repeats,PbH1)結(jié)構(gòu)域,該區(qū)域是β片層垛疊區(qū),可以形成較大的螺旋結(jié)構(gòu),具有催化多糖水解的活性[15]。這說(shuō)明PsPG蛋白與果實(shí)軟化關(guān)系密切。

    3.2 低溫有利于‘槜李’果實(shí)采后貯藏保鮮

    目前,已有許多報(bào)道較為深入地研究了低溫脅迫對(duì)果實(shí)品質(zhì)和代謝的影響。首先,低溫使代謝過(guò)程中許多酶的活性減弱,并抑制乙烯的生物合成;其次,低溫能有效抑制微生物生長(zhǎng),減少腐爛病發(fā)生。不同品種果實(shí)在不同溫度下的耐受能力不同。李(PrunussalicinaLinn.)、杏李(P.simoniiCarr.)和歐洲李(P.domesticaLinn.)部分品種在室溫條件下可貯藏20~30 d,在溫度4 ℃和空氣相對(duì)濕度90%~95%條件下貯藏時(shí)間可達(dá)50 d[16];‘金太陽(yáng)’杏(Armeniacavulgaris‘Golden sun’)在溫度(0±1) ℃和空氣相對(duì)濕度90%~95%條件下可貯藏40~50 d,失重率僅為0.2%,可加工果率高達(dá)96%[17];汪開(kāi)拓等[18]研究認(rèn)為,采用1 ℃貯藏楊梅〔Myricarubra(Lour.) Sieb. et Zucc.〕果實(shí)較5 ℃或10 ℃貯藏更為顯著地延緩了果實(shí)軟化,并降低了果實(shí)腐爛率,從而有效延長(zhǎng)了果實(shí)貯藏期。本研究中,低溫〔(4±1)℃〕貯藏條件下‘槜李’果實(shí)硬度的降幅較室溫〔(25±1)℃〕貯藏條件下明顯減小,說(shuō)明低溫貯藏有利于保持‘槜李’果實(shí)的商品品質(zhì)。此外,結(jié)合本研究中1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)處理和減壓浸鈣處理在抑制‘槜李’果實(shí)軟化相關(guān)基因的表達(dá)上的作用,推測(cè)在1-MCP處理或減壓浸鈣處理后采用低溫貯藏可進(jìn)一步延長(zhǎng)貨架期和保持良好的風(fēng)味品質(zhì)。

    3.3 PsPG基因參與‘槜李’果實(shí)軟化過(guò)程

    多聚半乳糖醛酸酶是植物體內(nèi)水解果膠物質(zhì)的基礎(chǔ)酶[19],其基因的表達(dá)與果膠變性和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān)[20]。研究結(jié)果表明:在不同種類果實(shí)軟化過(guò)程中,PG基因的表達(dá)增加,同時(shí)伴隨著果膠聚合物的變性和果實(shí)的軟化[10,20]。結(jié)合不同采后處理和貯藏條件下‘槜李’果實(shí)硬度變化趨勢(shì)和PsPG基因表達(dá)模式推測(cè),在果實(shí)完全軟化前,PsPG基因轉(zhuǎn)錄水平升高;當(dāng)果實(shí)完成軟化后,負(fù)反饋機(jī)制抑制該基因的進(jìn)一步表達(dá),說(shuō)明PsPG基因參與了‘槜李’果實(shí)軟化的某些階段。

    乙烯是一種內(nèi)源性的氣態(tài)植物激素,調(diào)控果實(shí)的發(fā)育進(jìn)程。Kyte等[21]在PG基因啟動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)乙烯應(yīng)答元件,PG基因的表達(dá)和內(nèi)源乙烯釋放量的增加在時(shí)間上有緊密相關(guān)性。1-MCP為乙烯受體抑制劑,能夠高效抑制內(nèi)源乙烯的釋放。本研究中,在1-MCP處理?xiàng)l件下,‘槜李’PsPG基因的表達(dá)模式與其果實(shí)硬度的下降趨勢(shì)相對(duì)應(yīng),PsPG基因表達(dá)受抑制,果實(shí)硬度下降趨勢(shì)減緩,表明PsPG基因受乙烯調(diào)控參與‘槜李’果實(shí)軟化。在果實(shí)軟化初期,PsPG基因響應(yīng)乙烯信號(hào),表達(dá)量升高,激活了多聚半乳糖醛酸酶活性促進(jìn)果實(shí)軟化;當(dāng)果實(shí)完全軟化后,不再需要多聚半乳糖醛酸酶發(fā)揮功能,乙烯信號(hào)減弱并協(xié)同負(fù)反饋機(jī)制阻斷PsPG基因進(jìn)一步表達(dá)。但具體響應(yīng)機(jī)制仍需RNAi技術(shù)結(jié)合目的基因的遺傳轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)一步深入闡明。

    鈣是果樹(shù)必不可缺的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素,也是一種多功能的細(xì)胞信號(hào)分子,其在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮著極其重要的作用。而在果實(shí)軟化方面,Silveira等[22]研究認(rèn)為,外源補(bǔ)鈣主要是增加組織中自由鈣離子(Ca2+)和結(jié)合鈣含量,促進(jìn)Ca2+與果膠的相互交鏈,減少細(xì)胞內(nèi)酶通過(guò)細(xì)胞壁與底物接觸的機(jī)會(huì),從而有效地減緩果實(shí)的軟化。在本研究中,采用減壓浸鈣處理和低溫處理一方面延緩了‘槜李’PsPG基因表達(dá),另一方面明顯提高了PsPG基因的表達(dá)水平,由此推測(cè),PsPG基因不僅參與了‘槜李’果實(shí)軟化過(guò)程,同時(shí)能響應(yīng)Ca2+和低溫誘導(dǎo)參與其他重要生化過(guò)程。其原因可能是,Ca2+通過(guò)誘導(dǎo)果實(shí)中PsPG基因大量表達(dá),激活了果實(shí)內(nèi)多聚半乳糖醛酸酶活性,從而增加了其與底物的接觸機(jī)會(huì),完成果實(shí)軟化過(guò)程。另外,PsPG基因表達(dá)上升階段主要發(fā)生在‘槜李’果實(shí)快速軟化階段,說(shuō)明多聚半乳糖醛酸酶是參與果實(shí)軟化的誘導(dǎo)酶,而非啟動(dòng)酶。

    3.4 結(jié)論

    綜合研究結(jié)果顯示:‘槜李’果實(shí)在貯藏過(guò)程中,果實(shí)硬度呈下降趨勢(shì),1-MCP處理、減壓浸鈣處理和低溫貯藏可以明顯延緩果實(shí)硬度下降。PsPG基因的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),PsPG基因可受到1-MCP的抑制,并能夠明顯響應(yīng)Ca2+誘導(dǎo)。低溫貯藏是‘槜李’果實(shí)采后品質(zhì)保鮮的有效手段,可以抑制PsPG基因的表達(dá)以延緩果實(shí)軟化過(guò)程。本研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示‘槜李’果實(shí)貯藏和軟化機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

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    CloningandexpressionanalysisonfruitsofteningrelatedgenePsPGfromPrunussalicina‘Zuili’

    WANG Gang, JIA Zhanhui, ZHANG Jiyu, JIA Xiaodong, WANG Tao, WENG Wenxin, XUAN Jiping①, GUO Zhongren①

    (Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, China),J.PlantResour. &Environ., 2017,26(4): 60-66

    Dynamic changes in fruit firmness ofPrunussalicina‘Zuili’ in the conditions of room temperature 〔(25±1) ℃〕 storage, low temperature 〔(4±1) ℃〕 storage, 1-methylcyclopropene (1-MCP) treatment, and immersed in Ca2+solution with decompression treatment were studied, polygalacturonase gene (PsPG) fromP.salicina‘Zuili’ was cloned, and its bioinformatics and expression were analyzed. The results show that low temperature storage, 1-MCP treatment, and immersed in Ca2+solution with decompression treatment can effectively retard the decrease of fruit firmness ofP.salicina‘Zuili’. The length of open reading frame (ORF) ofPsPGgene fromP.salicina‘Zuili’ is 1 134 bp, which encodes 377 amino acids. The secondary structure of PsPG protein includes 11.14% ofαhelix, 31.03% ofβsheet, and 57.82% of random coil. The result of bioinformatics analysis shows that PsPG protein has pectate lyase 3 domain and four PbH1 domains; the relationships among amino acid sequences encoded byPsPGgene andPGgenes fromPrunuspersica(Linn.) Batsch andPrunusarmeniacaLinn. are close, with similarity more than 96%. The result of qRT-PCR analysis shows that with prolonging of postharvest storage time, all relative expressions ofPsPGgene increase firstly and then decrease in the conditions of low temperature storage, 1-MCP treatment, and immersed in Ca2+solution with decompression treatment, and reach the peak value when stored for 5, 3, and 5 d, respectively. It is suggested thatPsPGgene fromP.salicina‘Zuili’ has a close relationship with its fruit softening, low temperature storage is effective measure to retain freshness of fruit ofP.salicina‘Zuili’ after harvest, which can inhibit expression ofPsPGgene to postpone fruit softening.

    Prunussalicina‘Zuili’;PsPGgene; cloning; gene expression; fruit softening

    Q943.2; S662.3

    A

    1674-7895(2017)04-0060-07

    10.3969/j.issn.1674-7895.2017.04.08

    2017-03-23

    國(guó)家科學(xué)技術(shù)部“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAD16B04)

    王 剛(1984—),男,山西興縣人,博士,助理研究員,主要從事果樹(shù)遺傳育種方面的研究。

    ①通信作者E-mail: xuanjiping@cnbg.net; zhongrenguo@cnbg.net

    張明霞)

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