FISH技術(shù)檢測骨髓異常綜合征四種常見染色體異常

王 巍，練有浩，官全生，黃永彬，梁文君，文瑞婷，梁 亮，楊志剛

(廣東醫(yī)科大學(xué) 血液病研究室、廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科，廣東 湛江524001)

FISH技術(shù)檢測骨髓異常綜合征四種常見染色體異常

王 巍，練有浩，官全生，黃永彬，梁文君，文瑞婷，梁 亮，楊志剛

(廣東醫(yī)科大學(xué) 血液病研究室、廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科，廣東 湛江524001)

目的評估熒光原位雜交(FISH)技術(shù)在檢測骨髓增生異常綜合征(MDS)常見染色體異常中的價(jià)值。方法FISH方法檢測47例新診斷MDS患者-5/5q-、-7/7q-、+8、-20/20q-染色體異常，并與15例染色體核型結(jié)果比較。結(jié)果47例患者中，-5/5q-、-7/7q-、+8、-20/20q-染色體異常FISH方法總檢出率44.7%，其中5q-最常見，其次是+8、-7/7q-，-20/20q-最少見。中期分裂相不足10個時，F(xiàn)ISH法可提高染色體異常檢出率；分裂相達(dá)10個以上，兩種方法對上述染色體異常檢測結(jié)果基本一致。結(jié)論本室FISH方法檢測MDS患者-5/5q-、-7/7q-、+8、-20/20q-染色體異?？倷z出率與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致；染色體核型和FISH同時做，可提高M(jìn)DS患者染色體異常檢出率。

骨髓增生異常綜合征；熒光原位雜交；染色體異常

(ChinJLabDiagn,2017,21:2046)

骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic syndromes，MDS)是一組源于造血干細(xì)胞的獲得性克隆性疾病，以髓系中一系或多系血細(xì)胞減少或發(fā)育異常、無效造血以及急性髓系白血病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高為特征。約40%-70% MDS患者具有非隨機(jī)的克隆性染色體異常，對染色體進(jìn)行分析是MDS診斷分型、預(yù)后判斷不可缺少的一部分[1]。目前常規(guī)檢測染色體的方法是核型分析，但由于技術(shù)方法所限或一些疾病本身細(xì)胞分裂指數(shù)低，部分標(biāo)本不能獲得足夠數(shù)量和高質(zhì)量的中期分裂相供分析。熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、不需獲得中期分裂相的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已越來越多地應(yīng)用于臨床。本文應(yīng)用FISH方法檢測了47例MDS患者-5/5q-、-7/7q-、+8、20q-染色體異常，并與常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)果比較，以評估FISH方法在檢測MDS常見染色體異常中的應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液科2013年1月至2016年11月經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和/或骨髓活檢確診的初發(fā)MDS 患者47例，其中男28例，女19例，男女比例約為1.5∶1，中位年齡64歲(16-83歲)。按照2016 WHO MDS分型診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，MDS-SLD 1例，MDS-MLD 14例，MDS-RS-SLD 1例，MDS-RS-MLD 1例，MDS 5q- 2例，MDS-U 1例，MDS-EB-1 12例，MDS-EB-2 15例。

1.2 方法

1.2.1熒光原位雜交技術(shù)(FISH)

抽取肝素鈉或EDTA抗凝骨髓液2-4 ml，經(jīng)低滲、固定后調(diào)整細(xì)胞濃度滴片，按照探針說明書老化、脫水、變性、雜交、洗片及復(fù)染，然后在Zeiss熒光顯微鏡下觀察熒光信號，Isis軟件進(jìn)行圖像采集。

5q缺失探針、7q缺失探針、+8探針、20q缺失探針購自英國Cytocell公司，檢測位點(diǎn)依次為D5S630(5p15.31)/EGR1(5q31.2)，D7S658(7q22.1-q22.2)/ D7S486 (7q31.2)，D8Z1 (8p11-q11)，D20S108 (20q12)/D20S150(20q13.12)。每例分析200個間期細(xì)胞，以20例非惡性血液病患者檢測結(jié)果設(shè)定閾值(`x±3s)，超過閾值上限為陽性。5q、7q、20q缺失探針正常熒光信號模式為間期細(xì)胞內(nèi)2紅2綠，+8探針為2綠。5q缺失探針異常信號模式：細(xì)胞內(nèi)1紅2綠，提示del 5q31，上限3.82%；1紅1綠，提示-5，上限3.67%。7q缺失探針異常信號模式：1紅1綠，提示-7或7q-，上限2.5%，該探針不能區(qū)分-7和7q-。20q缺失探針異常信號模式：1紅1綠，提示-20或20q-，上限3.49%，不能區(qū)分-20和20q-。+8探針異常信號模式：3綠，提示+8，上限2.77%。

1.2.2染色體核型分析

采用骨髓細(xì)胞24 h短期培養(yǎng)法，操作按照常規(guī)，G顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析。染色體核型按照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN2013)》的規(guī)定進(jìn)行描述。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，四格表資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 血常規(guī)結(jié)果

47例MDS患者均有貧血(Hb<110 g/L)，如按WHO對MDS血細(xì)胞減少的定義，Hb<100 g/L者45例，占95.7%；WBC正?；驕p低，其中減低33例，占70.2%；PLT可稍增高、正?；驕p低，其中減低34例，占72.3%。三系中全血細(xì)胞減少26例，占55.3%；2系減少18例，占38.3%；1系減少3例，占6.4%(表1)。

表1 47例MDS患者血常規(guī)結(jié)果

2.2 FISH檢測結(jié)果

47例MDS患者中21例檢出染色體異常，檢出率44.7%。其中單條染色體異常10例，占47.6%；兩條染色體異常9例，占42.9%；三條染色體異常2例，占9.5%；四條染色體同時累及的未見。5q-為最常見染色體異常(12例，25.5%)，其次是+8(9例，19.1%)和-7/7q-(8例，17%)，-20/20q-最少見(5例，10.6%)(表2)。低原始細(xì)胞比例MDS(<5%)20例，占42.6%，高原始細(xì)胞比例MDS(≥5%)27例，占57.4%，兩組上述四種染色體異常檢出率無顯著差異(表3)。

表2 47例MDS患者5、7、8、20號染色體異常檢出情況

表3 低、高原始細(xì)胞比例MDS患者5、7、8、20號染色體異常FISH檢出率比較

2.3 染色體核型分析結(jié)果

47例MDS患者中15例進(jìn)行了常規(guī)染色體核型分析，其中3例無分裂相，5例未分析夠20個分裂相，僅7例合格，合格率46.7%。在無分裂相的3例患者中有2例FISH檢出異常(例8和例9)。分裂相不足10個的3例患者，染色體分析均為正常核型，但1例FISH檢出異常(例7)。分裂相10-20個2例患者中，1例FISH與核型結(jié)果相符(例13)，1例FISH檢出了核型未檢出的異常(例4)。分裂達(dá)20個以上的7例患者中，2例為正常核型，5例檢出染色體異常。2例正常核型患者FISH結(jié)果亦陰性。5例染色體異常患者中1例FISH陰性，因?yàn)樵摾旧w異常不在FISH探針檢測范圍內(nèi)(例15)；其余4例所涉及染色體異常均包括5、7、8或20號染色體，1例FISH未檢出核型中的-20異常(例3)，余均檢出所在染色體異常。但仔細(xì)對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分病例FISH所檢出染色體異常雖與核型異常在同一條染色體上，但信號提示結(jié)果與核型結(jié)果并不完全一致，如例6和例13 FISH信號提示5q-，而核型結(jié)果為-5，見表4。

表4 15例MDS患者FISH與常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)檢測結(jié)果

*5q缺失探針信號均為1紅2綠，提示5q-。

3 討論

MDS主要發(fā)生于老年人，男性多于女性。本組患者中位年齡64歲，男女比例約1.5∶1，與教材[3]基本一致。從血常規(guī)檢測結(jié)果看，幾乎所有患者均有貧血，WBC數(shù)減低或正常，PLT可以減低、正常或稍增高。超過半數(shù)MDS患者存在全血細(xì)胞減少，單純1系減少的比例少見，約占6.4%，與陳安寶等報(bào)道的基本一致[4]。

MDS是一組高度異質(zhì)性疾病，涉及一系或多系血細(xì)胞發(fā)育異常。骨髓染色體畸變類型也較復(fù)雜，有數(shù)目異常，也有結(jié)構(gòu)異常，所累及染色體中以-5/5q-、-7/7q-、+8、20q-異常最常見。本組47例MDS患者中，F(xiàn)ISH方法檢測上述四種染色體異?？倷z出率為44.7%，與天津血研所42%[5]和湘雅醫(yī)院48%報(bào)道的基本一致[6]。其中單條染色體異常和兩條染色體異常的比例大致相當(dāng)，分別為47.6%和42.9%，而三條染色體同時異常的較少見(9.5%)，四條染色體同時累及的未見。5q-為最常見染色體異常，其次是+8、-7/7q-，20q-最少見。而湘雅醫(yī)院報(bào)告的FISH檢測100例MDS患者中，陽性檢出率從高到低依次為-5/5q-、20q-、+8、-7/7q-[6]。天津血研所FISH聯(lián)合染色體核型分析檢測112例MDS患者，陽性檢出率從高到低依次為+8、-7/7q-、-5/5q-、20q-[5]，可見在此方面各家醫(yī)院差異較大，可能與所用FISH探針覆蓋區(qū)域不同、地域差異及研究病例數(shù)偏少等有關(guān)。

文獻(xiàn)報(bào)道，約35%-40%的MDS患者可轉(zhuǎn)化為急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)，核型演變可能是MDS轉(zhuǎn)白的原因之一[7]。陳寶安等[4]用常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法檢測49例MDS患者，發(fā)現(xiàn)原始細(xì)胞比例增高(RAEB、RAEB-T)患者比原始細(xì)胞比例不高(RA、RAS)患者染色體異常檢出率高(78.3% VS 42.3%，P<0.05)，染色體異常組轉(zhuǎn)白率高于正常組。而本組研究中原始細(xì)胞比例增高患者染色體異常檢出率雖高于原始細(xì)胞比例不高患者(48.1% VS 40.0%)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。分析原因主要與FISH方法局限性即不能檢測探針覆蓋不到區(qū)域染色體異常有關(guān)，這也是FISH方法不能替代染色體核型分析的原因。

47例MDS患者中15例進(jìn)行了常規(guī)染色體核型分析，達(dá)標(biāo)(20個分裂相)的僅7例，達(dá)標(biāo)率約46.7%。3例即1/5左右患者無分裂相可供分析，分裂相不足10個的核型結(jié)果可靠性下降，即一些正常核型FISH檢出異常，而FISH 100%可檢測出結(jié)果，因此有條件的患者建議核型和FISH同時做，以提高染色體異常檢出率、縮短患者住院時間；同時，獲得足夠數(shù)量和高質(zhì)量的分裂相仍是染色體核型分析技術(shù)要努力解決的問題。從分裂相達(dá)到10個以上的核型與FISH對比結(jié)果來看，兩者檢測結(jié)果基本一致，但部分病例FISH信號所提示染色體異常與核型結(jié)果不一致，仔細(xì)觀察肖雅娟等[9]、高冬格等[10]的FISH與核型結(jié)果也存在不一致情況，說明是個普遍問題，分析原因可能與分裂相質(zhì)量、FISH探針質(zhì)量、閱片者經(jīng)驗(yàn)等因素有關(guān)。另外，本組1例FISH未全部檢出核型中的異常；1例FISH 5q-、-7/7q-陽性比例不高，尤其是-7/7q-，僅4.5%，易漏診；而核型結(jié)果10個分裂相中5個有-5、del(7)(q22)，比例并不低，說明FISH結(jié)果也不是萬無一失的，核型結(jié)果也是FISH結(jié)果的補(bǔ)充和驗(yàn)證。

綜上所述，盡管中期分裂相的數(shù)量和質(zhì)量制約著染色體核型結(jié)果的準(zhǔn)確性，但其仍然是染色體檢測常規(guī)且不可替代的方法，F(xiàn)ISH方法是有益補(bǔ)充；為提高M(jìn)DS患者染色體異常檢出率和準(zhǔn)確性，建議有條件患者同時做染色體核型和FISH檢查。

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DetectionoffourcommonabnormalchromosomesbyFISHinmyelodysplasticsyndrome

WANGWei,LIANYou-hao,GUANQuan-sheng,etal.

(LaboratoryofHematology,GuangdongMedicalUniversity;DepartmentofHematology,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524001,China)

ObjectiveTo evaluate the significance of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting the common chromosomal abnormalities in patients with myelodysplastic syndrome(MDS).MethodsThe -5/5q-,-7/7q-,+8 and -20/20q- chromosomal abnormalities were detected by FISH in 47 patients with de novo MDS,and the results were compared with those of metaphase cytogenetics in 15 patients.ResultsThe total positive rate of -5/5q-,-7/7q-,+8 and -20/20q- abnormalities detected by FISH was 44.7%,and 5q- was the most common chromosomal abnormality,then +8 and -7/7q- abnormalities followed,-20/20q- was the fewest one.FISH testing can improve the positive rate of chromosomal abnormalities in cases with fewer than 10 metaphases,and the results of FISH testing were in accordance with those of metaphase cytogenetics in cases with more than 10 metaphases.ConclusionThe total positive rate of -5/5q-,-7/7q-,+8 and -20/20q- chromosomal abnormalities detected by FISH in our hospital is in accordance with reports.And metaphase cytogenetics and FISH should be carried out at the same time to improve the positive rate of chromosomal abnormalities in MDS patients.

Myelodysplastic syndrome;Fluorescence in situ hybridization;Chromosome abnormality

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81500131)；湛江市財(cái)政資金科技專項(xiàng)競爭性分配項(xiàng)目(2016A06003)

1007-4287(2017)12-2046-04

R551.3

A

王巍，女，42歲，博士，副教授，主要研究方向：白血病分子機(jī)理研究，現(xiàn)在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院工作。

2017-07-14)