福建武夷山的野生干巴菌Thelephoraganbajun Zang新分布

蔡程山, 張 英, 張雨森, 趙國柱

(北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院,北京 100083)

福建武夷山的野生干巴菌ThelephoraganbajunZang新分布

蔡程山, 張 英, 張雨森, 趙國柱

(北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院,北京 100083)

對福建武夷山疑似野生干巴菌的子實體，標本編號GB-WYS，進行形態(tài)和分子鑒定.ITS-5.8S rDNA擴增測序，獲得656 bp核酸片段，與GenBank中產(chǎn)自云南的干巴菌同源比對分析，同源性達91%～94%.系統(tǒng)發(fā)育分析顯示：GB-WYS與云南干巴菌以及干巴菌模式標本同屬于一大的分支，又產(chǎn)生一定分化.結(jié)合形態(tài)特征、分子鑒定及生境特點將GB-WYS鑒定為干巴菌，并推斷由于地理隔離，GB-WYS與云南的干巴菌存在一定的遺傳分化.這是我國云南省之外罕見報道的野生干巴菌的新分布，擴大了干巴菌的生境范圍，為其生態(tài)研究、保護開發(fā)等提供參考.

菌根真菌; 分類; 生態(tài); 革菌

干巴菌ThelephoraganbajunZang為擔子菌門革菌目革菌科革菌屬[1]，又稱松毛菌、繡球菌、對花菌、馬牙菌.子實體蓮花片狀，纖維革質(zhì)，高5～14 cm， 闊4～14 cm，灰色或灰棕色，幼時柔軟，老后干韌.干巴菌是野生食用菌中的上品，菌香濃郁、生嘗微甘，似有海藻氣味，肉質(zhì)堅韌，有腌牛肉干的濃郁香味，民間俗稱“干巴”，因而得名干巴菌.干巴菌營養(yǎng)豐富，含有鈣、鐵、蛋白質(zhì)、硫胺素等多種微量元素，具有抗氧化物質(zhì)，能清除人體內(nèi)的自由基，延緩衰老，強身健體等功效[2].它含有核苷酸、多糖等物質(zhì)，有助于降低膽固醇，調(diào)節(jié)血脂，提高免疫力等[3-5]，而且對HIV逆轉(zhuǎn)錄酶有抑制作用[6]，抑制腫瘤細胞增殖等[7].

現(xiàn)有文獻中干巴菌大多記載為我國云南省特有的野生食用菌[8]，以滇中高原為主，主產(chǎn)地為昆明、玉溪、曲靖、楚雄等[9]，多分布于600～2 500 m海拔的松林地帶.每年七月到九月生長在馬尾松、思茅松、云南松等林地上，并形成外生菌根[10].由于獨特的地理生境、較高的經(jīng)濟食用價值和難以人工栽培等特點，自然資源極其有限.已有的研究多集中在云南省的干巴菌，包括分類、 菌種分離、營養(yǎng)成分測定等，云南之外，鮮有報道.

武夷山位于福建省西北部，東經(jīng)117°37′22″—118°19′44″，北緯27°27′31″—28°04′49″，屬中亞熱帶地區(qū)，四季氣溫較均勻、溫和濕潤，年平均氣溫12～13 ℃，降水量在2 000 mm以上，平均相對濕度高達85%，是福建省降水量最多的地區(qū).武夷山國家自然保護區(qū)保存了世界同緯度帶最完整、最典型、面積最大的中亞熱帶原生性森林生態(tài)系統(tǒng)，該保護區(qū)動植物菌類繁多，生物多樣性豐富.筆者于2015年7月，在武夷山的大型菌物考察中，采集到一份疑似野生干巴菌標本，因該菌大多報道分布于我國云南，生境比較特殊，遂對其展開進一步的形態(tài)與分子研究，以明確我國云南之外(武夷山)是否分布野生干巴菌，為干巴菌的生境生態(tài)研究、保護應用開發(fā)等提供參考.

1 材料與方法

1.1 研究標本

2015年7月在福建武夷山黃崗山大峽谷松樹闊葉樹混交林地采集標本，編號GB-WYS；2016年8月在云南南華縣食用菌交易市場購得云南新鮮干巴菌，編號GB-YNNH.

1.2 樣品鑒定

1.2.1 形態(tài)學鑒定 對采集的標本進行形態(tài)學鑒定，包括子實體宏觀特征，如大小、顏色、質(zhì)地、菌片厚度等.在KOH，棉藍，Melzer試劑中進行顯色反應.微觀特征包括：體視鏡觀察、顯微鏡觀察、掃描電鏡觀察.體視鏡下觀察時，清除樣本表面根部泥土，昆蟲糞便等雜質(zhì)，觀察解剖特征等.顯微鏡觀察，用無菌的鑷子和剪刀剪取潔凈的支片，制切片，于顯微鏡下觀察菌絲組織結(jié)構(gòu)，孢子形態(tài)特征.掃描電鏡觀察，用無菌的剪刀和鑷子剪取0.5 cm×0.5 cm大小的干燥潔凈組織塊，用導電的雙面膠粘貼在金屬板上，放在小型離子濺射儀中鍍金后，于掃描電鏡下觀察，拍照.

1.2.2 分子鑒定 DNA提?。喝∽訉嶓w干標本樣品0.1 g，于滅菌好的研缽中研磨至粉末，采用上海浩然生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的真菌DNA小量提取試劑盒，按說明書步驟進行.ITS-5.8S rDNA區(qū)域的特異性PCR擴增：上游引物為ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，下游引物為 ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[11].PCR反應體系(50 μL)：Mix 25 μL，引物 ITS4、ITS5(20 μmol·L-1)各1 μL，DNA模板2 μL，加雙蒸水(ddH2O)至50 μL.PCR反應條件：94 ℃預變性10 min，94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min.PCR產(chǎn)物檢測：取5 μL產(chǎn)物加1 μL 6×上樣緩沖液于含Goldview的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，PCR產(chǎn)物由北京睿博興科測序生物公司純化并測序.

基于rDNA ITS 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹：使用多重序列比對分析軟件BioEDIT對所得 ITS序列與GenBank中已公布的同屬多株代表菌株以及干巴菌模式標本序列(云南大學王鵬飛博士論文中獲取的干巴菌模式標本ITS序列)[12]進行比對(Alignment).應用 MEGA 6.0軟件進行分析，采用鄰近連接法(Neighbor-Joining Method)進行聚類分析，選取Thelephoraregularis(U83485.1)做系統(tǒng)發(fā)育樹的外群，以自展法(bootstrap)進行顯著性分析檢驗，重復1000次[13].

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學鑒定

GB-WYS：子實體子層高3～12 cm，直徑5～13 cm，珊瑚狀多次分支，基部肉質(zhì)較厚，沿子實體菌片向上依次裂成扇形或掃梳狀小分支，頂端的小枝片高5 cm，多次分支，小支片邊緣鋸齒狀.子實體整體灰褐色，有濃郁的菌香(圖1A).在普通光學顯微鏡下(400倍)可以看到大量的擔孢子，孢子邊緣不整齊，有疣突(圖1C)，菌絲體扭結(jié)清晰可見.孢子和菌絲體在棉蘭試劑中有明顯的嗜藍反應，KOH反應呈藍色； Melzer試劑反應呈藍黑色.掃描電鏡觀察，可以清晰看到孢子，擔孢子(7～12)μm×(6～8) μm，通常圓球型，淡褐色，有時失水多有變形，褶皺，多角形，有疣突(圖1B、D).菌絲粗4～6 μm，具鎖狀聯(lián)合，透明，尖端扭曲.

2.2 分子鑒定

對武夷山采集到的疑似干巴菌子實體標本GB-WYS和云南的干巴菌GB-YNNH，分別提取DNA后，PCR擴增ITS-5.8S rDNA基因區(qū)段，產(chǎn)物電泳可見650 bp左右的清晰電泳條帶(圖2).兩份標本均成功擴增了ITS-5.8S rDNA區(qū)段.

干巴菌GB-WYS測序結(jié)果顯示，ITS區(qū)(包含5.8S rDNA)全長656 bp(KU847425)，GC含量51.37%.將GB-WYS、GB-YNNH、干巴菌模式標本(云南大學王鵬飛博士論文中獲取的干巴菌模式標本ITS序列，未在GenBank中到)[12]以及GenBank中Gb001、Gb077和Gb259等基因序列[14]輸入到ClustalW軟件中分析，發(fā)現(xiàn)GB-WYS樣本擴增序列含有缺失位點3個，插入位點2個，堿基突變位點33個.

A:子實體；B,D:掃描電鏡下的干巴菌擔孢子，表面具有明顯的疣突；C：普通光學顯微鏡下的擔孢子.圖1 福建武夷山的干巴菌(GB-WYS)形態(tài)學分析Fig.1 T.ganbajun Zang (GB-WYS) collected from Wuyi Mountain, Fujian

1.Marker;2.武夷山的干巴菌GB-WYS;3.云南的干巴菌 GB-YNNH;4.陰性對照.圖2 干巴菌的ITS-5.8S rDNA片段PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 PCR electrophoresis of ITS-5.8S rDNA of T.ganbajun Zang

從GenBank篩選革菌屬Thelephora，毛革菌屬Tomentella，兩屬5個干巴菌相似種(Tomentellasublilacina、Tomentellasubtestacea、Thelephoraversatilis、Thelephoracaryophyllea、Thelephoraterrestris)共10份標本的ITS-5.8S rDNA序列(每種2個標本/菌株序列)，與模式標本T.ganbajunfruit type[12]，GB-WYS、GB-YNNH以及GenBank中干巴菌Gb001、Gb077和Gb259標本的ITS-5.8S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3).可以明確看出武夷山的干巴菌GB-WYS和干巴菌模式標本[12]，GB-YNNH以及Gb001、Gb077和Gb259菌株分布在同一大分支上，支持率(Bootstrap值)高于96%，而與革菌科下的其它屬種距離較遠.結(jié)合形態(tài)特征，確定武夷山的標本GB-WYS為干巴菌T.ganbajunZang.但是在系統(tǒng)發(fā)育樹上，武夷山的干巴菌GB-WYS與云南的干巴菌存在一定的分化，分析可能是地理隔離造成的.

T.regularis為外群.圖3 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的干巴菌GB-WYS的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 N-J phylogenetic tree of rDNA-ITS of T.ganbajun Zang GB-WYS

3 討論

干巴菌在我國云南采食歷史悠久，但分類學地位一直存在爭議，長期被認為是繡球菌Sparassiscrispa(Wulf.) Fr.，直到臧穆系統(tǒng)研究和比較之后，認為干巴菌并非繡球菌，并建立一新種T.ganbajunZang，才得以澄清[15].民間人們平常所習稱的干巴菌除了干巴菌(T.ganbajunZang)，也常包含蓮座革菌(T.vialisSchwein)和橙黃革菌(T.aurantiotinctaCorner)[4].在諸多文獻報道中，干巴菌常作為我國云南特有的種類，然而近年對福建莆田老鷹尖自然保護區(qū)、安徽鷂落坪自然保護區(qū)、江西省、四川省等地的大型真菌考察，偶有報道野生干巴菌的存在，但未見詳細的形態(tài)描述和分子鑒定[16-19].林汝楷等曾對武夷山進行系統(tǒng)的大型真菌資源考察，采集大型真菌標本827份，共鑒定232種，食用菌102種，均未見干巴菌的報道[20].筆者在福建武夷山的考察發(fā)現(xiàn)疑似野生干巴菌，子實體宏觀與顯微形態(tài)特征與云南報道的較為吻合，然而分子鑒定結(jié)果存在一定差異.

通過對標本ITS-rDNA序列對比分析，發(fā)現(xiàn)武夷山的干巴菌GB-WYS比云南的干巴菌類群多個基因突變位點.在系統(tǒng)發(fā)育樹上，雖然聚在一個大的分支上，但也表現(xiàn)出一定的遺傳分化，這與王鵬飛對云南干巴菌群體的遺傳學研究相吻合.他發(fā)現(xiàn)各基因的等位基因在云南滇中地區(qū)分布較多，少數(shù)具有明顯獨立遺傳特性的群體分布于滇中之外的邊緣地區(qū)中，說明基因流交匯區(qū)域為滇中，邊緣地區(qū)因基因流較少而保留了少量的遺傳分化特性[12].Sha et al[14]表示干巴菌的基因流動是有限的，云南同一地區(qū)內(nèi)的遺傳分化通常在7%以內(nèi)，地區(qū)之間的遺傳分化低于小于10%，說明云南省內(nèi)不同地域的干巴菌也存在較大的遺傳分化.福建武夷山與云南相距約2 000 km，因此判斷云南干巴菌與福建武夷山干巴菌為兩個獨立的種群.對于存在地理隔離的不同群體來說，GB-WYS與云南的干巴菌類群同源性在91%～94%之間，群體之間可能因為缺乏基因交流而出現(xiàn)的遺傳分化，屬于種內(nèi)變異，但也不能否認遠距離的異域分化形成不同物種的可能.標本GB-WYS的外貌形態(tài)、氣味(濃郁菌香)、孢子形態(tài)、生境等特點，均與云南干巴菌較為吻合[10,15]，結(jié)合分子序列將其鑒定為干巴菌.由于獲得的武夷山干巴菌標本數(shù)量有限，不排除將來獲得大量標本材料進一步深入研究定為新種的可能.這是我國云南之外較為系統(tǒng)深入的干巴菌的研究報道，不但豐富了福建武夷山大型野生食用菌的種類，擴大了干巴菌的生境范圍和地理分布，而且為干巴菌及其相關類群真菌的研究提供了重要信息.

干巴菌是一種外生菌根真菌，與伴生植物關系密切，另受氣候、海拔、降雨量等環(huán)境因素影響.它的自然資源稀缺，雖然可以通過宜林地的管理、合理采集和人工促繁等方法來維持和增加自然產(chǎn)量[21]，但尚未實現(xiàn)完全人工栽培.干巴菌市場的供應主要來自云南，完全依賴采集野生資源，簡單索取、無序利用，野生干巴菌的自然資源和生態(tài)環(huán)境已受到嚴重破壞，價格逐年攀升[22]，產(chǎn)量和質(zhì)量逐年下降[23].如何合理的保護開發(fā)和利用，探索云南之外干巴菌適宜的棲息繁殖保護地，應引起人們的重視.本次云南之外的野生干巴菌報道，對其生態(tài)習性、基因的多樣性、遺傳發(fā)育進化，保護開發(fā)等具有重要參考.

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AnewdistributionofThelephoraganbajunZanginWuyiMountain,Fujian,China

CAI Chengshan, ZHANG Ying, ZHANG Yusen, ZHAO Guozhu

(College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

A suspected wildThelephoraganbajunspecimen (No.GB-WYS) was found in Wuyi Mountain, Fujian Province. A 656 bp ITS-5.8S rDNA sequence fragment was obtained from the fruiting body of GB-WYS, which shared 91%-94% similarity withT.ganbajunsequence from Yunnan. In the phylogenetic tree, GB-WYS clustered with those from Yunnan and type specimen, but with a short distance. Combined morphological characteristics, molecular identification and habitat characteristic of GB-WYS, it was identified asT.ganbajun. Meanwhile, we inferred that the geographical segregation resulted in a certain genetic differentiation between GB-WYS andT.ganbajunin Yunnan. This is a new distribution of wildT.ganbajunoutside Yunnan Province, which expanded the habitat range ofT.ganbajunand provided important reference for its ecological research, protection and development.

mycorrhizal fungi; taxonomy; ecology;Thelephora

2017-05-31

2017-08-13

國家自然科學基金資助項目(31570019, J1310005).

蔡程山(1990-)，男，碩士研究生.研究方向：食藥用真菌資源開發(fā).Email:2862536108@qq.com.通訊作者趙國柱(1976-),男，博士，碩士生導師.研究方向：真菌分類和食藥用菌資源開發(fā).Email:zhaogz@im.ac.cn.

Q939.5

A

1671-5470(2017)06-0692-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.06.015

(責任編輯:蘇靖涵)