青藤堿對(duì)膿毒血癥模型大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用

，

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院急診科，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

青藤堿對(duì)膿毒血癥模型大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用

李雄輝1，張東山*

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院急診科，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

目的探討青藤堿(SIN)對(duì)膿毒血癥大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用。方法將SD大鼠75只隨機(jī)均分為假手術(shù)組、膿毒血癥模型組和SIN小、中、大劑量組，建模，術(shù)后24 h采用ELISA法測(cè)定血清、尿液中性粒細(xì)胞明膠相關(guān)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NGAL)、腎損傷分子1(KIM-1)水平及血降鈣素原(PCT)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)濃度，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果和膿毒血癥模型組相比，SIN大、中劑量組NGAL和KIM-1均顯著降低；SIN大、中、小劑量組PCT均較膿毒血癥組顯著降低，而BUN及Scr均顯著低于模型組；SIN大劑量組腎臟病理明顯改善。結(jié)論SIN有效降低血清和尿液NGAL和KIM-1，降低血清PCT、BUN和Scr濃度，對(duì)膿毒血癥所致的急性腎損傷起到一定保護(hù)作用。

SIN； 膿毒血癥； 急性腎損傷； NGAL； KIM-1

膿毒血癥是臨床上常見的嚴(yán)重的感染性疾病，如果得不到及時(shí)治療，病死率較高。近年來，盡管抗感染治療和器官功能支持療法取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但膿毒血癥的病死率仍高達(dá)30%～70%[1]，急性腎損傷 (acute kidney injury，AKI) 是膿毒血癥患者常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥[2]。有研究表明，從傳統(tǒng)中藥青風(fēng)藤中提取的生物堿單體青藤堿(Sinomenine，SIN)具有免疫抑制、抗炎鎮(zhèn)痛等多種藥理作用[3]，且臨床上已經(jīng)被應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的治療，療效獲得肯定。本文擬建立一個(gè)大鼠膿毒血癥模型，探討SIN對(duì)膿毒血癥模型大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物75只雄性SD大鼠，體重250～300 g，購自斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2011-0003。大鼠術(shù)前3天單獨(dú)放入代謝籠，給予等級(jí)飼料喂養(yǎng)并自由飲水。

1.2主要藥物、試劑及儀器SIN購自湖南正清制藥有限公司，純度大于95%。血清降鈣素原(procalcitonin，PCT)試劑盒(德國BRAHMS Diagnostica 公司)；大鼠中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil related lipid transport protein，NGAL) 試劑盒(上海藍(lán)基生物有限公司)；大鼠腎損傷分子-1( kidney injury molecule 1，KIM-1)試劑盒(上海藍(lán)基生物有限公司)；Vitros 250型全自動(dòng)生化分析儀(美國強(qiáng)生公司) ；ELX800 型酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK儀器公司)。

1.3試驗(yàn)方法按照隨機(jī)數(shù)字表法，75只大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、膿毒血癥模型組、SIN小劑量組、SIN中劑量組和SIN大劑量組，每組15只。術(shù)前禁食12 h，麻醉采用10%水合氯醛溶液腹腔注射，劑量為3.5 mL/kg，麻醉滿意后，固定、消毒及備皮，沿腹中線切開皮膚約1.5 cm，探查到盲腸將其結(jié)扎，注射器針頭刺穿被結(jié)扎盲腸頭尾端，擠壓出盲腸內(nèi)容物，無需清洗將盲腸和內(nèi)容物送回腹腔，關(guān)腹。假手術(shù)組大鼠僅探查盲腸，不結(jié)扎盲腸和造成穿孔。SIN小劑量組、中劑量組和大劑量組在手術(shù)結(jié)束時(shí)分別在尾靜脈注射劑量為25、50、100 mg/kg SIN。假手術(shù)組及膿毒血癥組均注射生理鹽水0.5 mL。術(shù)中如出現(xiàn)大鼠提前復(fù)蘇，酌情給予0.1～0.2 mL水合氯醛溶液，以助手術(shù)順利進(jìn)行。術(shù)后大鼠即送入代謝籠，各種原因?qū)е?4 h內(nèi)死亡的大鼠均被剔除出組，重新補(bǔ)充大鼠繼續(xù)觀察。

1.4資料收集術(shù)后24 h觀察大鼠毛色、寒顫和腹腔情況并記錄，收集尿液并處死大鼠，收集大鼠下腔靜脈血液并取下大鼠腎臟。靜脈血和尿液均常溫下放置1 h，離心(3 000 r/min，10 min)，留取上清液，備用。

1.4.1 血清NGAL和KIM-1水平測(cè)定 均采用ELISA法，分別按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)中止后，各孔于波長(zhǎng)450 nm的酶標(biāo)儀上讀取光密度(D) 值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及D值畫出曲線圖，分別確定對(duì)應(yīng)的濃度范圍。

1.4.2 尿液NGAL和KIM-1蛋白測(cè)定 采用ELISA法檢測(cè)，方法同上。

1.4.3 血清降鈣素原(PCT)測(cè)定 采用ELISA法嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行操作。

1.4.4 血清Scr、BUN測(cè)定 采用全自動(dòng)多功能生化分析儀，按照步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.5 大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué) 采用HE染色進(jìn)行觀察，經(jīng)過石蠟切片、脫蠟、脫二甲苯、核染、分化與漂洗、染色、脫水、透明和封片等步驟獲得病理切片標(biāo)本。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用t值檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1大鼠術(shù)后一般情況除假手術(shù)組，其他各組均有不同程度呼吸急促，毛色欠光滑；假手術(shù)組及SIN大劑量組無寒戰(zhàn)現(xiàn)象，其他各組均不同程度出現(xiàn)寒戰(zhàn)，以膿毒血癥組和SIN小劑量組為甚；除假手術(shù)組，其余各組均出現(xiàn)腹腔膿腫，SIN大劑量組僅出現(xiàn)3例，而膿毒血癥組及SIN小劑量組所有大鼠均出現(xiàn)腹腔膿腫。

2.2大鼠血清各項(xiàng)指標(biāo)比較血清NGAL和KIM-1比較，假手術(shù)組NGAL和KIM-1均顯著低于膿毒血癥模型組；SIN大、中劑量組NGAL和KIM-1均顯著低于膿毒血癥模型組(P<0.05)，SIN小劑量組NGAL和KIM-1和膿毒血癥模型組相比較，差異無顯著性(P>0.05)。見表1。大鼠血清PCT比較，SIN大、中、小劑量組PCT進(jìn)行兩兩對(duì)比，差異均有顯著性(P<0.05)，且均顯著低于膿毒血癥模型組(P<0.05)；和假手術(shù)組比較，SIN中、小劑量組PCT顯著增高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清NGAL、KIM-1、PCT比較(ng/L，n=15)

與假手術(shù)組比較，a：P<0.05；與膿毒血癥模型組比較，b：P<0.05

2.3尿液NGAL和KIM-1濃度比較假手術(shù)組NGAL和KIM-1均顯著低于膿毒血癥模型組；SIN大、中劑量組NGAL和KIM-1均顯著低于膿毒血癥模型組(P<0.05)，SIN小劑量組NGAL和KIM-1和膿毒血癥模型相比較，差異無顯著性(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠尿液NGAL、KIM-1比較(ng/mL，n=15)

與假手術(shù)組比較，a：P<0.05；與膿毒血癥模型組比較，b：P<0.05

2.4大鼠血清Scr、BUN比較SIN大、中、小劑量組BUN及Scr均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，低于膿毒血癥組(P<0.05)，假手術(shù)組和膿毒血癥模型組進(jìn)行比較，差異有顯著性(P<0.05)。見表3。

2.5大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)觀察假手術(shù)組光鏡下腎臟形態(tài)學(xué)改變差異不明顯。膿毒血癥模型組和SIN小劑量組腎小球體增大，較多腎曲小管上皮呈輕中度濁腫變性，胞漿內(nèi)紅染的顆粒數(shù)目明顯增多、增粗，可見數(shù)個(gè)小灶狀小管壞死，部分管腔內(nèi)可見管型。SIN中劑量組腎小球體增大，腎小球毛細(xì)血管輪廓稍顯模糊，小部分腎曲小管上皮呈輕中度濁腫變性，胞漿內(nèi)紅染的顆粒數(shù)目增多，顆?？梢娫龃?，可見小部分小灶狀小管壞死及管型。SIN大劑量組腎小球體稍大，腎小球毛細(xì)血管輪廓較清晰，小部分腎曲小管上皮呈輕度濁腫變性，胞漿內(nèi)紅染的顆粒數(shù)目有所增多，但顆粒未見增粗，無小管壞死及管型形成。見圖1。

表3 各組大鼠血清BUN、Scr比較(n=15)

與假手術(shù)組比較，a：P<0.05；與膿毒血癥模型組比較，b：P<0.05

圖1 大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)觀察

3 討 論

膿毒血癥其實(shí)質(zhì)是全身性炎癥呈惡性發(fā)展的狀態(tài)，常合并AKI，部分患者如不采取及時(shí)有效的阻斷措施，容易發(fā)展為多器官功能衰竭。最新文獻(xiàn)表明，炎癥介質(zhì)在膿毒血癥的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，其血漿濃度與疾病的嚴(yán)重程度和預(yù)后明顯相關(guān)[4]。在膿毒血癥急性腎損傷發(fā)生過程中，免疫介導(dǎo)的腎小管功能紊亂比腎缺血更重要，提示AKI的發(fā)病機(jī)制是復(fù)雜的[5]，抑制機(jī)體免疫反應(yīng)而達(dá)到有效治療膿毒血癥急性腎損傷可能是一個(gè)方向。

SIN主要用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及自身免疫性疾病，療效肯定。文獻(xiàn)報(bào)道[6]SIN可以降低IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17A、IL-1β水平，升高IL-10水平，減輕全身炎癥反應(yīng)。王竹等[7]發(fā)現(xiàn)SIN可抑制DC細(xì)胞的生物學(xué)活性，減少DC的炎癥因子分泌。文娟[8]發(fā)現(xiàn)SIN能改善臨床癥狀和減少炎性病灶，SIN上調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)TGF-β1的表達(dá)，并指出這可能是SIN發(fā)揮其保護(hù)作用的機(jī)制之一。可見，SIN的抗炎作用也是多通道的。

目前已有多個(gè)有預(yù)測(cè)膿毒血癥相關(guān)AKI有價(jià)值的生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，如NGAL和KIM-1。NGAL是一種損傷誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)鐵蛋白，一般情況下組織中表達(dá)很少，在缺血和腎毒性小鼠模型中可檢測(cè)到NGAL迅速升高，檢測(cè)能夠早期發(fā)現(xiàn)腎損傷，NGAL評(píng)價(jià)腎功能方面可能優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測(cè)指標(biāo)[9]。Kim-1腎臟近曲小管上皮細(xì)胞表達(dá)的一種跨膜蛋白，在正常腎臟內(nèi)表達(dá)水平極低，當(dāng)腎急性損傷后，近端小管細(xì)胞內(nèi)Kim-l基因轉(zhuǎn)錄水平急劇上調(diào)，Kim-l蛋白也隨之大量表達(dá)，隨著結(jié)構(gòu)與功能的恢復(fù)，Kim-1這種高表達(dá)的現(xiàn)象也會(huì)消失[10]。類似現(xiàn)象在另外一篇文獻(xiàn)也被報(bào)道[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大、中劑量SIN組的NGAL和KIM-1無論是采用血清標(biāo)本還是尿液，均明顯低于膿毒血癥組，提示大、中劑量SIN能明顯降低大鼠AKI時(shí)NGAL和KIM-1，而在膿毒血癥導(dǎo)致AKI中，小劑量SIN并無明顯保護(hù)作用。大、中劑量SIN組組間比較差異無顯著性，可能提示本研究中采取50 mg/kg的劑量已使相關(guān)作用受體飽和，具體機(jī)制如何尚需進(jìn)一步研究。假手術(shù)組的NGAL和KIM-1顯著低于膿毒血癥組，提示大鼠膿毒血癥造模是成功的。

研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生AKI時(shí)PCT升高早于血肌酐的升高[12]，被認(rèn)為是識(shí)別膿毒血癥的一個(gè)早期敏感指標(biāo),可作為膿毒血癥誘導(dǎo)急性腎損傷患者的預(yù)測(cè)指標(biāo)[13]。本研究將SIN各組進(jìn)行兩兩對(duì)比，PCT值差異顯著，SIN劑量越大，PCT值越低；將SIN各組分別與膿毒血癥模型組進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)膿毒血癥組PCT值較SIN組明顯增高，兩組數(shù)據(jù)均提示了SIN能有效降低PCT值，有效減輕了膿毒血癥導(dǎo)致AKI對(duì)機(jī)體的破壞性作用。AKI嚴(yán)重程度最直接的反映就是機(jī)體的腎功能。臨床和科研上評(píng)價(jià)腎功能一般常用Scr和BUN兩個(gè)觀察指標(biāo)。本研究中，膿毒血癥組Scr和BUN最高，低劑量SIN組次之，余下依次為中劑量SIN、高劑量SIN組和假手術(shù)組。本研究中，膿毒血癥組和低劑量SIN組組間比較差異有顯著性，提示低劑量SIN在保護(hù)腎功能方面同樣有益。而前文述及，小劑量SIN并不能明顯降低大鼠AKI時(shí)NGAL和KIM-1濃度。NGAL和KIM-1是研究腎功能變化觀察指標(biāo)之一，SIN對(duì)腎功能的保護(hù)作用是否還有其他機(jī)制參與有待進(jìn)一步研究。大、中劑量SIN組的Scr和BUN較膿毒血癥模型組顯著降低，但顯著高于假手術(shù)組，說明合適劑量的SIN具有一定的減輕膿毒血癥導(dǎo)致的AKI。而評(píng)價(jià)腎功能最直接的辦法就是進(jìn)行病理切片檢查。本研究中，膿毒血癥組大鼠腎臟胞漿內(nèi)紅染的顆粒數(shù)目明顯增多、增粗，腎小管壞死，甚至管型形成，上述現(xiàn)象提示大鼠腎臟出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的感染，小劑量的青藤堿的病理呈現(xiàn)高度相似的結(jié)果，提示小劑量的青藤堿不能改善腎膿毒血癥的結(jié)局。隨著青藤堿劑量增大，中劑量青藤堿組的病理較小劑量組有了一定改善，直到大劑量青藤堿組可以發(fā)現(xiàn)，胞漿內(nèi)紅染的顆粒未見增粗，無小管壞死及管型形成，提示在該劑量青藤堿參與下，膿毒血癥大鼠腎臟病理結(jié)果有了較大的改善，證實(shí)了合適劑量的青藤堿對(duì)膿毒血癥大鼠腎臟具有一定的保護(hù)作用。本研究設(shè)計(jì)上也有不足之處，因觀察時(shí)間短，保護(hù)作用是否持久，能否替代其他治療措施緩解甚至逆轉(zhuǎn)膿毒血癥導(dǎo)致的AKI，本實(shí)驗(yàn)尚需進(jìn)一步研究。

綜上，SIN對(duì)膿毒血癥導(dǎo)致急性腎損傷具有一定保護(hù)作用，具體作用機(jī)制可能是多方面的，本研究為SIN應(yīng)用于膿毒血癥致急性腎損傷的保護(hù)作用研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] Dennen P,Douglas IS,Anderson R.Acute kidney injury in the intensive care unit:an update and primer for the intensivist[J].Crit Care Med,2010,38(1):261-275.

[2] Ishani A,Xue JL,Himmelfarb J,et al.Acute kidney injury increases risk of ESRD among elderly[J].J Am Soc Nephrol,2009,20(1):223-228.

[3] Wang QX,Li XK.Immunosuppressive and anti-inflammatory activities of sinomenine[J].Int Immunopharmacol,2011,11(3):373-376.

[4] Bagshaw SM,Uchino S,Bellomo R,et al.Septic acute kidney injury in critically ill patients:clinical characteristics and outcomes[J].Clinl J Am Soc Nephrol,2007,2(3):431-439.

[5] Wan L,Bagshaw SM,Langenberg C,et al.Pathophysiology of septic acute kidney injury:what do we really know[J].Criti Care Med,2008,36(4):S198-S203.

[6] Tong B,Yu J,Wang T,et al.Sinomenine suppresses collagen-induced arthritis by reciprocal modulation of regulatory T cells and Th17 cells in gut-associated lymphoid tissues[J].Mol Immunol,2015,65(1):94-103.

[7] 王竹，王冰冰，官菊梅，等.SIN抑制體外培養(yǎng)DC2.4樹突狀細(xì)胞的生物學(xué)活性并減少炎癥因子分泌[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2015,31(5):660-663.

[8] 文娟.SIN對(duì)大鼠EAE的防治作用及IL-10、TGF-β1表達(dá)的影響[D].長(zhǎng)沙：中南大學(xué)，2008.

[9] Mishra J,Ma Q,Prada A,et al.Identification of neutrophil gelatinase-associated lipocalin as a novel early urinary biomarker for ischemic renal injury[J].J Am Soc Nephrol,2003,14(10):2534-2543.

[10] Tse C,Capeau J.Real time PCR methodology for quantification of nucleic acids[C].Annales de biologie clinique,2002,61(3):279-293.

[11] Han WK,Waikar SS,Johnson A,et al.Urinary biomarkers in the early diagnosis of acute kidney injury[J].Kidney Int,2008,73(7):863-869.

[12] 劉慧琳，劉桂花，馬青變，等.降鈣素原對(duì)急診膿毒癥患者早期診斷的價(jià)值[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2012，24(5)：298-301.

[13] Nie X,Wu B,He Y,et al.Serum procalcitonin predicts development of acute kidney injury in patients with suspected infection[J].Clin Chem Lab Med,2013,51(8):1655-1661.

Protectiveeffectsofsinomenineonacuterenalinjuryinsepticrats

LI Xionghui,ZHANG Dongshan

(EmergencyDepartment,theSecondXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410000,Hunan,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of sinomenine on acute kidney injury in rats with sepsis.Methods75 SD rats were randomly divided into sham operation group,sepsis group and sinomenine,in modeling large,middle and small dose group,and after 24 h ELISA was used to test serum,urine neutrophil related lipid transport protein gelatin (NGAL),kidney injury molecule 1 (KIM-1) and the level of serum procalcitonin (PCT),blood urea nitrogen (BUN),serum creatinine (Scr) concentration,and the results were statistically analyzed.ResultsCompared with the sepsis group,the NGAL and KIM-1 in the large and middle dose group of sinomenine were significantly lower than those in the sepsis group,and the PCT of the large,middle and small dose group were significantly lower than those of the sepsis group,while BUN and Scr were significantly lower than those in the model group.SIN large dose group significantly improved renal pathology.ConclusionsSinomenine can effectively reduce serum and urine NGAL and KIM-1,decrease serum PCT,BUN and Scr,and play a protective role on acute kidney injury induced by sepsis.

sinomenine; sepsis; acute kidney injury; NGAL; KIM-1

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.008

2017-01-03；

2017-04-14

*通訊作者，E-mail：zhkidney@qq.com.

R631

A

蔣湘蓮)