2015年杭州地區(qū)新生兒腸道病毒腦炎病原分型及臨床特征

張瓊 劉玉潔 李偉 尚世強(qiáng)

2015年杭州地區(qū)新生兒腸道病毒腦炎病原分型及臨床特征

張瓊 劉玉潔 李偉 尚世強(qiáng)

目的分析2015年夏季杭州地區(qū)新生兒腸道病毒腦炎病原分型及臨床特征。方法選擇浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院2015年5-9月收治的45例有顱內(nèi)感染的新生兒為研究對象，采用RT-PCR法檢測腦脊液中的腸道病毒，根據(jù)結(jié)果分為病例組（陽性）與對照組（陰性），比較與分析新生兒腸道病毒腦炎病原分型及臨床特征。結(jié)果45例患兒腦脊液中檢出腸道病毒陽性17例（37.8%）。病例組腦脊液中糖含量高于對照組（P＜0.05），蛋白含量少于對照組（P＜0.05）；兩組患者發(fā)熱、黃疸、嘔吐、抽搐等臨床癥狀比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。將17例腦脊液腸道病毒陽性標(biāo)本進(jìn)行基因分析，得到?？刹《荆‥CHO）30（13例）、ECHO 16（2例）和柯薩奇病毒（CV）B2（2例）；對上述臨床株進(jìn)行進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)與參考株的同源性達(dá)89.6%～98.3%。結(jié)論2015年夏季杭州地區(qū)新生兒腸道病毒腦炎局部暴發(fā)流行，腦脊液生化指標(biāo)的變化符合病毒性腦炎的特點，但臨床表現(xiàn)無明顯特異性；ECHO 30是主要病原體，進(jìn)化樹分析顯示本次暴發(fā)流行可能是浙江省ECHO 30分離株的又一暴發(fā)流行。

腸道病毒腦炎新生兒病原分型臨床特征

腸道病毒是單鏈RNA病毒，在世界范圍內(nèi)廣泛傳播。目前已知有100多個血清型，包括柯薩奇病毒（CV）A及B型、?？刹《荆‥CHO）、脊髓灰質(zhì)炎病毒（PV）和其他腸道病毒[1]。腸道病毒感染可以導(dǎo)致多種疾病，如手足口病、皰疹性咽峽炎、腸道病毒腦炎等。嬰幼兒，尤其新生兒是腸道病毒的主要易感人群[2]。有文獻(xiàn)報道腸道病毒是引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的重要病原體，在全世界范圍內(nèi)不同腸道病毒血清型均可引起腸道病毒腦炎，如CV A9及B1～B5型，ECHO 4、6、9、11、19、25及30型，腸道病毒71、75、76型[3-5]。由于腸道病毒血清型很多，且各有不同的臨床表現(xiàn)；因此，系統(tǒng)地監(jiān)測與分析腸道病毒感染是很有必要的。本文就2015年夏季杭州地區(qū)新生兒腸道病毒腦炎病原分型及臨床特征作一分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象選擇浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院2015年5-9月收治的45例有顱內(nèi)感染的新生兒為研究對象，收集患兒發(fā)病時間、臨床表現(xiàn)、腦脊液檢查結(jié)果等臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）入院時年齡＜28d；（2）符合顱內(nèi)感染的診斷（依據(jù)人民衛(wèi)生出版社的《實用新生兒學(xué)》第4版，即腦脊液病原學(xué)檢測陽性或腦脊液常規(guī)及生化檢測明顯異常）。

1.2 主要儀器及設(shè)備腸道病毒通用型核酸測定試劑盒、EX2400核酸自動提取儀均購自上海之江生物科技股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海Invitrogen公司；Taq DSC DNA聚合酶購自Enzymatics公司；ABI-PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 病毒總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄使用腸道病毒核酸測定試劑盒、核酸自動提取儀，從新生兒腦脊液標(biāo)本中提取腸道病毒RNA。

1.3.2 腸道病毒核酸的鑒定使用腸道病毒通用型核酸測定試劑盒檢測腦脊液RNA樣本，反應(yīng)條件：50°C 15min，95°C 5min，94°C 15s，55°C 45s；循環(huán)40次。

1.3.3 VP1基因的擴(kuò)增和測序?qū)δc道病毒通用型陽性RNA樣本進(jìn)行VP1區(qū)的擴(kuò)增和測序，VP1基因逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的引物依據(jù)參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：每份RT-PCR樣本的總量為10μl，包括2μl buffer（5×）、0.4μl dNTP（10mM）、1μl DTT、0.2μl上游引物和下游引物、0.5μl SuperscriptⅢ、5μl腸道病毒RNA模板、0.4μl RNasin。反應(yīng)條件：22℃10min，45℃45min，95℃5min。巢式PCR反應(yīng)包括2輪：第一輪VP1基因的PCR產(chǎn)物總量為50μl，包括10μl RT-PCR的產(chǎn)物、0.5μl Taq DSC和2.5μl外引物，基因擴(kuò)增的反應(yīng)條件：95℃5min，（95℃30s，42℃30s，60℃45s）×40個循環(huán)，72℃10min。第二輪PCR產(chǎn)物總量為50μl，包括1μl第一輪PCR產(chǎn)品、0.5μl Taq DSC和2.5μl外引物，反應(yīng)條件：95℃6min，（95℃30s，60℃20s，72℃25s）×40個循環(huán)，72℃10min。結(jié)束以上操作后，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序。

1.3.4 基因型分析使用Mega 5.10軟件，將臨床得到的VP1基因DNA序列與國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫的DNA序列進(jìn)行比較與系統(tǒng)分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布，用示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新生兒腸道病毒腦炎的臨床特征45例顱內(nèi)感染的新生兒腦脊液標(biāo)本中，檢測出腸道病毒RNA陽性17例（腸道病毒腦炎），陽性率為37.8%。其中男9例，占52.9%；女8例，占47.1%。臨床表現(xiàn)：黃疸16例，占94.1%；發(fā)熱14例，占82.4%；少吃少動9例，占52.9%；皮膚花斑7例，占41.2%；腹瀉3例，占17.6%；腹脹2例，占11.8%；抽搐2例，占11.8%；呼吸暫停2例，占11.8%；所有患者無嘔吐癥狀。實驗室檢查：心肌酶譜增高13例，占74.5%；血WBC正常14例，占82.4%。同時行腦脊液常規(guī)檢查17例，WBC增多9例，占52.9%。同時行腦脊液生化檢查16例，糖含量降低6例，占37.5%；蛋白含量增高16例，占100.0%（其中蛋白含量＞800mg/L 9例，占56.3%）。5-9月分別檢出0、8、9、0和0例，具有明顯的季節(jié)性，見圖1。

圖1 45例顱內(nèi)感染的新生兒腸道病毒腦炎發(fā)病的季節(jié)分布

2.2 腸道病毒腦炎患者與對照組腦脊液生化指標(biāo)及臨床癥狀比較將17例腸道病毒腦炎患者設(shè)為病例組，余下28例顱腦感染患者設(shè)為對照組。病例組腦脊液中糖含量高于對照組，蛋白含量低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；兩組患者腦脊液中乳酸脫氫酶含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。兩組患者發(fā)熱、黃疸、抽搐、嘔吐、腹瀉、少吃少動、皮膚花斑等臨床表現(xiàn)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表1 病例組與對照組腦脊液生化指標(biāo)比較

2.3 RT-PCR病毒測定結(jié)果及基因分型17例腸道病毒包括ECHO 30、ECHO 16和CV B2，分別有13例（76.5%）、2例（11.8%）和2例（11.8%）。比較測序所得的不同腸道病毒臨床株的VP1序列，發(fā)現(xiàn)臨床株與標(biāo)準(zhǔn)株的同源性為89.6%～98.3%。再將測序所得的VP1序列，與NCBI網(wǎng)站用BLAST程序在GenBank上的VP1序列進(jìn)行比對，同時進(jìn)行同源性分析，并繪制遺傳進(jìn)化樹；找到與此次暴發(fā)的ECHO 30臨床株同源性最近的是浙江省ECHO 30分離株，與此次暴發(fā)的ECHO 16臨床株同源性最近的是云南省ECHO 16分離株，與此次流行的CV B2臨床株同源性最近的是上海市CV B2分離株；腸道病毒遺傳進(jìn)化樹見圖2。

表2 病例組與對照組臨床表現(xiàn)比較[例（%）]

圖2 腸道病毒遺傳進(jìn)化樹

3 討論

病毒性腦炎是由多種病毒感染引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。輕者能自行緩解，重者會引起后遺癥或死亡，而腸道病毒是其最主要的病原體之一[7]。新生兒一旦感染腸道病毒，最常見的并發(fā)癥是無菌性腦炎[2]。既往研究均有關(guān)于兒童腸道病毒腦炎暴發(fā)流行的報道，如2004年浙江臨海地區(qū)暴發(fā)了ECHO 30所致的病毒性腦炎[8]；2005年山東省兗州市暴發(fā)無菌性腦膜炎，分離得到的病毒株主要為Cox B5[9]；2006年希臘暴發(fā)ECHO 6所致的病毒性腦炎[10]；2008年西班牙暴發(fā)ECHO 4所致的病毒性腦炎[11]；2008年山東省郯城縣腸道病毒腦炎暴發(fā)，病原體主要為CV B3。但是，關(guān)于新生兒腸道病毒腦炎暴發(fā)的報道不多，特別是不同腸道病毒血清型所致新生兒腸道病毒腦炎的報道更是少見。因此，筆者就2015年杭州地區(qū)新生兒腸道病毒腦炎病原分型及臨床特征作一分析。

本研究對45例顱內(nèi)感染的新生兒腦脊液進(jìn)行腸道病毒檢測及分型，檢出腸道病毒17例，陽性率為37.8%；6-7月是新生兒腸道病毒腦炎的暴發(fā)季節(jié)。17例新生兒腸道病毒腦炎發(fā)病時間基本符合既往流行病學(xué)報道及研究[12-13]。進(jìn)一步分析17例患兒的臨床特征，并與對照組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩組患者發(fā)熱、黃疸、少吃少動、嘔吐、抽搐等臨床癥狀方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且顱內(nèi)高壓癥狀不典型；考慮與新生兒顱骨發(fā)育特點有關(guān)，即新生兒囟門及顱縫未閉合，對顱內(nèi)高壓有緩沖作用，且新生兒神經(jīng)系統(tǒng)及其他臟器發(fā)育不完善，往往臨床表現(xiàn)無明顯特異性。這與近年來關(guān)于新生兒顱內(nèi)感染的臨床研究結(jié)果一致[14-15]。由此可見，新生兒不同病原體引起的顱內(nèi)感染，其臨床癥狀不是主要鑒別方式，檢測腦脊液中病原體才是明確診斷與指導(dǎo)用藥的金標(biāo)準(zhǔn)[16]。比較兩組患兒腦脊液生化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)病例組腦脊液中糖含量高于對照組，而蛋白含量少于對照組；以上腦脊液生化指標(biāo)的改變符合病毒性腦炎的特點[16]。建議在腸道病毒流行的季節(jié)，應(yīng)高度警惕病毒性腦炎患兒是否由腸道病毒感染引起，有檢測條件的醫(yī)院要對有發(fā)熱、黃疸、少吃少動的新生兒盡早行腦脊液病原學(xué)檢查，以明確診斷并給予及時治療。

既往研究表明浙江省從2002年開始陸續(xù)有關(guān)于ECHO 30暴發(fā)流行的報道[8，17-18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ECHO 30仍是2015年夏季杭州地區(qū)新生兒腸道病毒腦炎的主要病原體。通過測序比較不同腸道病毒臨床株的VP1基因序列，發(fā)現(xiàn)腦脊液ECHO 30分離株無論是核苷酸水平還是氨基酸水平，同源性都相當(dāng)高，它們屬于人感染腸病毒，且同位于進(jìn)化樹同一分支上；故本次腦炎暴發(fā)可能由來源相同的ECHO 30引起的。此外，發(fā)現(xiàn)與引起此次暴發(fā)的ECHO 30臨床株同源性最近的是浙江省ECHO 30分離株，同源性達(dá)95.5%～98.3%；提示本次新生兒病毒性腦炎的集中發(fā)病可能是浙江省ECHO 30分離株的又一暴發(fā)流行Lukashew等[19]、Domingo等[20]研究表明RNA類病毒具有高度的遺傳多樣性，這類病毒在傳播過程中通過改變自身的結(jié)構(gòu)完整性及酶的功能，可以較快地適應(yīng)新環(huán)境；因此，同一來源腸道病毒可反復(fù)引起暴發(fā)流行。

綜上所述，2015年夏季杭州地區(qū)新生兒腸道病毒腦炎局部暴發(fā)流行，腦脊液生化指標(biāo)的變化符合病毒性腦炎的特點，但臨床表現(xiàn)無明顯特異性；ECHO 30是主要病原體，進(jìn)化樹分析顯示本次暴發(fā)流行可能是浙江省ECHO 30分離株的又一暴發(fā)流行。

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Pathogenic genotypes and clinical features of neonatal enterovirus-associated encephalitis in Hangzhou 2015

ZHANG Qiong,LIU Yujie,LI Wei,et al.
Department of Pediatrics,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou 310012,China

Objective To analyze the pathogenic genotypes and clinical features of neonatal enterovirus-associated encephalitis in Hangzhou 2015.Methods Forty five newborns with intracranial infection admitted in Children's Hospital,Zhejiang University School of Medicine from May to September 2015 were enrolled in this study.The cerebrospinal fluid(CSF)samples from these newborns were collected and tested by RT-PCR.The pathogenic genotypes and clinical features of patients were analyzed.Results The enterovirus was positive in 17 CSF specimens(case group)with a positive rate of 37.8%.The glucose concentration in CSF of the case group was significantly higher(P＜0.05),however,the protein content in CSF of case group was significantly lower than those of control group(P＜0.05).There were no significant in clinical symptoms,including fever,jaundice,vomiting and cramps between case and control groups(P＞0.05).Among 17 cases with positive intestinal virus in CSF,the Echo 30 virus was detected in 13 cases(76.5%),Echo 16 virus in 2 cases(11.8%)and CVB 2 virus in 2 cases(11.8%).Phylogenetic tree analysis showed that the homology between clinical isolates and reference strains was 89.6%-98.3%.Conclusion Echo 30 is the main pathogen of the outbreak of viral encephalitis among newborns in the summer of 2015 in Hangzhou.

Enterovirus encephalitis Newborns Pathogen parting Clinical features

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2016-1690

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般計劃項目（2015KYA119）

310012杭州，浙江省立同德醫(yī)院兒科（張瓊）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院實驗檢驗中心（劉玉潔、李偉、尚世強(qiáng)）

尚世強(qiáng)，E-mail：shangshiqiang33@163.com

2016-10-21）

（本文編輯：陳丹）