SDF-1/CXCR4在糖尿病腎組織中的表達(dá)及其與微血管異常的關(guān)系①

陳玉琴 林 麗 張子陽 王昌盛 余麗梅 楊亦彬

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科， 遵義 563003)

SDF-1/CXCR4在糖尿病腎組織中的表達(dá)及其與微血管異常的關(guān)系①

陳玉琴 林 麗 張子陽 王昌盛 余麗梅②楊亦彬

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科， 遵義 563003)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[1]。近年來強(qiáng)調(diào)微血管結(jié)構(gòu)、功能異常以及慢性缺氧在各種慢性腎臟疾病進(jìn)展中的重要性，尤其是糖尿病腎臟存在異常血管新生這一病理生理現(xiàn)象而倍受關(guān)注[2]。研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(Stromal cell-derived factor1,SDF-1)能與其特異性受體CXCR4結(jié)合,參與新生血管形成、炎癥反應(yīng)、調(diào)控造血干細(xì)胞遷移及歸巢、惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移及組織修復(fù)等多種病理和生理過程[3,4]，并在腫瘤、缺血性疾病、糖尿病心肌病變和視網(wǎng)膜病變等疾病中表達(dá)增高，但在糖尿病腎臟中是否存在異常表達(dá)，與DN微血管病變是否有關(guān)聯(lián)尚罕見報道。

1 材料與方法

1.1實驗材料 180～220 g清潔級雄性SD大鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所提供)；鏈脲佐菌素(Sigma公司)；兔抗大鼠SDF-1、 CXCR4(武漢博士德生物工程有限公司)；兔抗大鼠Thrombomodulin-1單克隆抗體(武漢博士德)；羊抗大鼠CD133(Santa cruz)；樂康全血糖儀(美國羅氏公司)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴(kuò)增試劑(大連寶生物工程有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄儀(C1000)；熒光定量PCR擴(kuò)增儀(ICycler iQ)。

1.2實驗方法 SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組(NC組)和糖尿病腎病組(DN組)，每組設(shè)8、12、20、28周共4個觀察時點，每個時點6只大鼠。DN組采用腹腔注射STZ(55 mg/kg)造模，NC組換用同等劑量枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液一次性腹腔內(nèi)注射，72 h后測血糖，連續(xù)3 d血糖>16.65 mmol/L，尿量>150%，24hUAlb>30 mg為成模標(biāo)準(zhǔn)。成模后均未使用降糖藥，留取24 h尿后按上述時點處死各組大鼠，心臟采血，左腎取腎皮質(zhì)區(qū)約200 mg，10%甲醛固定，行病理學(xué)檢查及免疫組化檢測；取相同標(biāo)本一份快速凍于液氮，行免疫熒光檢測；右腎取50～100 mg組織行qRT-PCR。

1.3檢測指標(biāo)

1.3.1血糖、尿蛋白 兩組大鼠處死前測血糖，置于代謝籠，自由進(jìn)食進(jìn)水，收集24 h尿，計量后立即送檢測24 h尿蛋白。

1.3.2腎臟常規(guī)病理 腎組織用10%甲醛固定后石蠟包理，病理切片在溫水中展平，貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的干凈載玻片上，90℃烤片2 h后備用。HE染色后光鏡下觀察腎臟病理結(jié)構(gòu)。

1.3.3腎組織SDF-1、CXCR4免疫組化及CD133、TM-1免疫熒光 取石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)抗原，山羊血清封閉游離結(jié)合位點，減少非特異染色，滴加SDF-1抗體(1∶100)、CXCR4抗體(1∶100)，4℃冰箱過夜，次日分別滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG，經(jīng)過DAB顯色、蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇分化、中性樹膠封固后，顯微鏡下觀察，采用全自動圖像分析系統(tǒng)(Image-pro plus 6.0)測量其平均積分光密度(IOD)。液氮冰凍組織用OCT液包埋、切片、固定、山羊血清封閉、室溫孵育后，滴加CD133抗體(1∶200)、TM-1 (1:200)抗體，4℃冰箱過夜，次日滴加相應(yīng)FITC熒光二抗，37℃孵育30 min，PBS液沖洗后熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4qRT-PCR檢測腎組織SDF-1、CXCR4 mRNA的表達(dá) RNA提取及純化按說明書及參考文獻(xiàn)操作步驟操作。引物由大連寶生物工程有限公司設(shè)計合成，SDF-1a上游5′-GAGCTCAAGGTTGGGCAGA-3′，下游5′-TTTGGAGGCAAGCAGAGATCA-3′；CXCR4上游5′-AGCAGGTAGCAGTGACCCTCTGA-3′，下游5′-GAAGCAGGGTTCCTTGTTGGAGT-3′；內(nèi)參β-actin上游5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。

2 結(jié)果

2.1兩組大鼠不同時點血糖，24hUAlb水平的比較 DN組血糖、24hUAlb明顯高于NC組(P<0.01)，且24hUAlb水平呈進(jìn)行性增高。見表1。

2.2兩組大鼠腎組織常規(guī)病理改變 NC組腎小球、小管間質(zhì)、腎血管未發(fā)現(xiàn)明顯異常。DN組早期即出現(xiàn)明顯腎小球肥大，系膜基質(zhì)漸進(jìn)增多，中晚期部分腎小管上皮細(xì)胞顆粒和空泡變性，晚期可見部分腎小球縮小。見圖1。

2.3兩組大鼠腎組織SDF-1、CXCR4蛋白的表達(dá) NC組不同時點可見部分腎小管輕度表達(dá)SDF-1 和CXCR4。DN組SDF-1突出表達(dá)于腎小管，于12周時小管間質(zhì)也可見表達(dá)；CXCR4突出表達(dá)于腎小管間質(zhì)、腎小管周毛細(xì)血管，于20周時腎小管也明顯表達(dá)。DN組SDF-1、CXCR4蛋白的表達(dá)明顯強(qiáng)于同時點NC組(P<0.01)，峰值均在20周。見表2，圖2、3。

2.4兩組大鼠腎組織SDF-1、CXCR4 mRNA的表達(dá) DN組SDF-1 mRNA在8周、28周時表達(dá)明顯高于同時點NC組(P<0.05，P<0.01)，但在12周、20周時卻與同時點NC組無明顯差異(P>0.05)；而CXCR4 mRNA的表達(dá)較NC組同時點呈下調(diào)趨勢，但差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

GroupsPG(mmol/L)8w12w20w28w24hUAlb(mg/24h)8w12w20w28wNC4.70±0.864.30±0.874.78±0.674.65±0.7011.00±1.7912.00±2.61113.67±3.0813.00±2.61DN26.60±0.581)25.72±0.971)23.17±1.701)2)26.05±1.001)44.33±10.151)57.67±15.241)66.00±14.531)75.50±13.001)2)3)

Note：Compared with NC group,1)P<0.01;compared with 8 w,2)P<0.01;compared with 12 w,3)P<0.05.

GroupsSDF-1protein8w12w20w28wCXCR4protein8w12w20w28wNC22.17±0.6223.00±0.8623.04±0.6722.94±0.9616.98±1.1416.99±1.0316.92±1.2616.84±1.91DN53.61±5.481)78.03±3.581)3)157.07±4.511)3)4)91.96±2.821)3)4)5)43.98±3.982)95.43±4.951)2)151.79±4.261)2)3)55.21±3.121)2)5)GroupSDF-1mRNA8w12w20w28wCXCR4mRNA8w12w20w28wNC92.51±29.9586.67±23.9787.41±25.4495.47±29.02100.43±26.20112.83±29.24105.11±32.45102.89±30.42DN129.34±25.161)66.96±13.423)64.45±8.723)177.15±39.712)3)4)78.89±17.00105.54±30.3796.13±8.5482.76±24.21

Note：Compared with NC group,1)P<0.05,2)P<0.01;compared with 8 w,3)P<0.01;compared with 12 w,4)P<0.01;compared with 20 w,5)P<0.01.

圖1 兩組大鼠腎組織HE染色結(jié)果(×400)Fig.1 HE staining of rats renal tissue(×400)

圖2 兩組大鼠腎組織SDF-1免疫組化圖(×400)Fig.2 SDF-1 staining in rats renal tissue by immunohistochemistry(×400)

GroupCD133protein8w12w20w28wTM-1protein8w12w20w28wNC3.86±0.093.85±0.113.80±0.043.67±0.1037.46±1.4145.89±0.90155.79±0.9233.23±0.90DN4.68±0.091)4.89±0.051)2)4.99±0.081)2)4)5.05±0.061)2)3)66.09±1.181)72.22±0.991)2)98.18±0.491)2)3)50.99±0.981)2)3)5)

Note：Compared with NC group,1)P<0.01;compared with 8 w,2)p<0.01;compared with 12 w,3)p<0.01,4)p<0.05;compared with 20 w,5)P<0.01.

圖3 兩組大鼠腎組織CXCR4免疫組化圖(×400)Fig.3 CXCR4 staining in rats renal tissue by immunohistochemistry(×400)

圖4 兩組大鼠腎組織CD133、TM-1免疫熒光圖(20周,×200)Fig.4 CD133 and TM-1 staining in rats renal tissue by immunofluorescence(20 w, ×200)

2.5兩組大鼠腎組織CD133、TM-1蛋白的表達(dá) CD133主要表達(dá)在腎內(nèi)微小血管內(nèi)皮層和腎小管，TM-1突出表達(dá)在腎小球；DN組CD133、 TM-1表達(dá)明顯較NC組增強(qiáng)(P<0.01)。見表3，圖4。

2.6相關(guān)分析 DN組SDF-1、CXCR4與尿蛋白呈正相關(guān)(r=0.729，P<0.01；r=0.414，P<0.05)；SDF-1表達(dá)與CD133、TM-1呈正相關(guān)(r=0.777，P<0.01；r=0.735，P<0.01)，CXCR4表達(dá)與CD133、TM-1呈正相關(guān)(r=0.489，P<0.05；r=0.639，P<0.01)。

3 討論

腎臟微血管病變及慢性缺氧在DN的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，兩者關(guān)系密切且可能互為因果[2,5]，眾多研究表明糖尿病腎臟存在異常血管新生且與腎臟局部促血管生長因子密切相關(guān)，故不少學(xué)者呼吁重視這一病理生理性改變在糖尿病腎臟微血管病變發(fā)生發(fā)展中的作用。

SDF-1是骨髓基質(zhì)類細(xì)胞產(chǎn)生的CXC類趨化蛋白，廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞和器官組織， CXCR4是其特異受體并主要表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞表面。在成人腎臟SDF-1主要表達(dá)在腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞、足細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和腎小管細(xì)胞；CXCR4主要表達(dá)在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管周毛細(xì)血管[6]。 SDF-1/CXCR4軸參與一系列的生理過程，如胚胎發(fā)育和干細(xì)胞的能動性，能刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)，并且可以促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)募集至損傷部位，從而參與新生血管形成[7]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)SDF-1在結(jié)直腸癌中高表達(dá)且與CXCR4及VEGF的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，為SDF-1調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)提供了直接證據(jù)[8]，但它們在糖尿病腎臟微血管病變以及血管新生中作用尚不清楚。

本實驗采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠，并連續(xù)多時點觀察，結(jié)果顯示SDF-1和CXCR4蛋白主要表達(dá)于腎小管及間質(zhì)、管周毛細(xì)血管,DN組大鼠腎組織各時點SDF-1/CXCR4蛋白表達(dá)均高于同時期NC組，峰值均在20周，而SDF-1 mRNA也呈現(xiàn)異常表達(dá)，提示糖尿病腎臟存在SDF-1/CXCR4軸異常表達(dá)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)抑制2型糖尿病小鼠腎小球SDF-1表達(dá)有助于減輕腎小球硬化、足突細(xì)胞丟失和蛋白尿排泄[9]?？紤]SDF-1異常表達(dá)參與了糖尿病腎臟病變進(jìn)展，改善其異常表達(dá)可緩解糖尿病腎臟病變。SDF-1通過其受體CXCR4誘導(dǎo)多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中PI3K/Akt途徑的活化可以誘導(dǎo)VEGF的生成、促進(jìn)細(xì)胞黏附和增殖。研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)是一種可滅活SDF-1的蛋白酶，在高糖環(huán)境下，培養(yǎng)重組MMP-9的NRK-52E細(xì)胞可顯著降低SDF-1誘導(dǎo)的CXCR4及Akt磷酸化；糖尿病大鼠隨機(jī)接受 CXCR4拮抗劑(AMD3100)干預(yù)，使CXCR4無法與SDF-1結(jié)合，可導(dǎo)致大鼠尿蛋白排泄增加、VEGF分泌減少、腎小球毛細(xì)血管密度減少以及腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加[10]，提示糖尿病大鼠腎臟SDF-1/CXCR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受損，可影響其血管生成并且加快腎損害進(jìn)程。此外，本實驗顯示糖尿病大鼠腎臟SDF-1/CXCR4并不是持續(xù)高表達(dá)，其SDF-1 mRNA表達(dá)呈雙峰，而CXCR4 mRNA表達(dá)并未升高，分析可能與持續(xù)高血糖、腎臟眾多生長因子、細(xì)胞因子異常表達(dá)(如TGF-β1、HIF-1)等相關(guān)[11]。有研究顯示高糖、低氧條件下培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞和EPCs，發(fā)現(xiàn)糖酵解產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可改變HIF-1α的結(jié)構(gòu)，從而使其調(diào)控的靶基因SDF-1、CXCR4和VEGF隨之減少[12]。

研究表明，腦動靜脈畸形(AVM)的血管生成和重構(gòu)可通過激活SDF-1α/CXCR4通路，進(jìn)一步募集骨髓來源的EPCs來完成[13]。也有人發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠脈絡(luò)膜新生血管(CNV)嚴(yán)重程度與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表達(dá)SDF-1及VEGF增多有關(guān)[14]。為了觀察SDF-1/CXCR4與糖尿病腎臟微血管病變的關(guān)系，本實驗選用CD133和血栓調(diào)節(jié)蛋白-1(Thrombomodulin-1,TM-1)兩個內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物以及尿蛋白排泄作為觀察指標(biāo)，研究顯示蛋白尿是糖尿病腎臟微血管廣泛受損的標(biāo)志物。CD133是造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞表面的獨特抗原之一，CD133+的EPCs處于成熟最早階段，是內(nèi)皮層修復(fù)的早期標(biāo)志[15]；TM-1 主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的凝血酶受體，常作為內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子。本研究發(fā)現(xiàn)DN組腎臟各時點CD133、TM-1蛋白表達(dá)明顯強(qiáng)于同時點正常組，提示糖尿病腎臟微小血管內(nèi)皮細(xì)胞增多，且可能與微小血管內(nèi)皮細(xì)胞增生修復(fù)或新生血管生成相關(guān)；進(jìn)一步相關(guān)分析顯示SDF-1或CXCR4的蛋白表達(dá)與尿蛋白排泄、CD133和TM-1表達(dá)水平明顯相關(guān)，提示糖尿病腎臟SDF-1和CXCR4蛋白異常表達(dá)與腎臟局部微血管病變相關(guān)。

本研究顯示SDF-1/CXCR4異常表達(dá)參與了糖尿病腎臟微血管病變及腎損害進(jìn)程，糖尿病腎臟SDF-1/CXCR4異常表達(dá)可能是機(jī)體器官缺血、缺氧狀態(tài)下的適應(yīng)反應(yīng)，其目的可能是促進(jìn)血管新生，改善局部缺血、缺氧，但這些新生血管不成熟、功能差、滲漏性高，血中大量物質(zhì)滲出，促發(fā)或加劇周圍組織炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、殘存的細(xì)胞凋亡和胞外基質(zhì)積聚等，從而形成惡性循環(huán)加劇病變進(jìn)行性發(fā)展。因此，糖尿病腎臟血管生成調(diào)控因子或許是干預(yù)治療的靶點，并且在靶向治療過程中，調(diào)節(jié)SDF-1/CXCR4相互作用，可以為減緩DN的發(fā)展提供一種新的策略。

[1] Gnudi L,Coward RJ,Long DA.Diabetic nephropathy:perspective on novel molecular mechanisms[J].Trends Endocrinol Metab,2016,27(11):820-830.

[2] Tanaka T,Nangaku M.Angiogenesis and hypoxia in the kidney[J].Nat Rev Nephrol,2013,9(4):211-222.

[3] Zgraggen S,Huggenberger R,Kerl K,etal.An important role of the SDF-1/CXCR4 axis in chronic skin inflammation[J].PLoS One,2014,9(4):e93665.

[4] Ziegler ME,Hatch MM,Wu N,etal.mTORC2 mediates CXCL12-induced angiogenesis[J].Angiogenesis,2016,19(3):359-371.

[5] Leung WK,Gao L,Siu PM,etal.Diabetic nephropathy and endothelial dysfunction:Current and future therapies,and emerging of vascular imaging for preclinical renal-kinetic study[J].Life Sci,2016,166:121-130.

[6] Chen LH,Advani SL,Thai K,etal.SDF-1/CXCR4 signaling preserves microvascular integrity and renal function in chronic kidney disease[J].PLoS One,2014,9(3):e92227.

[7] Puchert M,Engele J.The peculiarities of the SDF-1/CXCL12 system:in some cells,CXCR4 and CXCR7 sing solos,in others,they sing duets[J].Cell Tissue Res,2014,355(2):239-253.

[8] 張 磊,孫雪竹,孫景洲.SDF-1/CXCR4及VEGF在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)及其意義[J].中國免疫學(xué)雜志,2015,31(5):674-677.

[9] Darisipudi MN,Kulkarni OP,Sayyed SG,etal.Dual blockade of the homeostatic chemokine CXCL12 and the proinflammatory chemokine CCL2 has additive protective effects on diabetic kidney disease[J].Am J Pathol,2011,179(1):116-124.

[10] Siddiqi FS,Chen LH,Advani SL,etal.CXCR4 promotes renal tubular cell survival in male diabetic rats:implications for ligand inactivation in the human kidney[J].Endocrinology,2015,156(3):1121-1132.

[11] Zhang D,Shao S,Shuai H,etal.SDF-1α reduces fibronectin expression in rat mesangial cells induced by TGF-β1 and high glucose through PI3K/Akt pathway[J].Exp Cell Res,2013,319(12):1796-1803.

[12] Ceradini DJ,Yao D,Grogan RH,etal.Decreasing intracellular superoxide corrects defective ischemia-induced new vessel formation in diabetic mice[J].J Biol Chem,2008,283(16):10930-10938.

[13] Wang L,Guo S,Zhang N,etal.The role of SDF-1/CXCR4 in the vasculogenesis andremodeling of cerebral arteriovenous malformation[J].Ther Clin Risk Manag,2015,11:1337-1344.

[14] Cai Y,Li X,Wang YS,etal.Hyperglycemia promotes vasculogenesis in choroidal neovascularization in diabetic mice by stimulating VEGF and SDF-1 expression in retinal pigment epithelial cells[J].Exp Eye Res,2014,123:87-96.

[15] Ishige-Wada M,Kwon SM,Eguchi M,etal.Jagged-1 signaling in the bone marrow microenvironment promotes endothelial progenitor cell expansion and commitment of CD133+human cord blood cells for postnatal vasculogenesis[J].PLoS One,2016,11(11):e0166660.

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.024

R587.1R692

A

1000-484X(2017)12-1870-04

①本文為國家自然科學(xué)基金(81260118)和遵義醫(yī)學(xué)院博士科研啟動基金項目[(2006)13]。

②貴州省細(xì)胞工程重點實驗室，遵義 563003。

陳玉琴(1991年-)，女，在讀碩士，主要從事糖尿病腎病的研究。

及指導(dǎo)教師：楊亦彬(1962年-)，男，博士 教授，主要從事腎衰竭和糖尿病腎病的相關(guān)研究，E-mail：yyb1011@sina.com。

[收稿2017-04-19 修回2017-07-17]

(編輯 倪 鵬)