分光光度法測(cè)定杜仲雄花和葉中的總黃酮

杜慶鑫 ，魏艷秀 ，劉攀峰 ，杜紅巖

（1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2. 國(guó)家林業(yè)局 杜仲工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450003）

分光光度法測(cè)定杜仲雄花和葉中的總黃酮

杜慶鑫1，2，魏艷秀1，2，劉攀峰1，2，杜紅巖1，2

（1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2. 國(guó)家林業(yè)局 杜仲工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450003）

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法和AlCl3比色法分別測(cè)定杜仲雄花和杜仲葉中總黃酮，研究杜仲中總黃酮含量測(cè)定的最佳方法，并對(duì)杜仲雄花和杜仲葉中總黃酮含量差異進(jìn)行分析。結(jié)果表明：NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法干擾嚴(yán)重，測(cè)定結(jié)果偏高，AlCl3比色法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，結(jié)果合理，在5.0～30 μg·mL-1范圍內(nèi)，蘆丁濃度與吸光度呈良好線性關(guān)系（R2=0.999 7），平均加樣回收率達(dá)99.27%，RSD為1.21%，適合杜仲中總黃酮含量的大量測(cè)定；杜仲雄花和杜仲葉中總黃酮測(cè)定結(jié)果顯示，不同材料間總黃酮含量差異較大，且雄花中總黃酮含量明顯高于葉，為杜仲資源的開發(fā)利用提供了一定的參考。

杜仲；雄花；葉；總黃酮；分光光度法

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.為杜仲科杜仲屬植物，系第四紀(jì)冰川侵襲后僅留存于我國(guó)的孑遺樹種，是我國(guó)特有名貴中藥材和珍稀瀕危Ⅱ類保護(hù)植物，在軍工、航空航天、醫(yī)療保健、健康食品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[1-3]。中國(guó)傳統(tǒng)以杜仲干皮入藥，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效[4-5]?，F(xiàn)代研究表明，杜仲雄花、杜仲葉含有與皮相類似的有效成分，總黃酮就是主要成分之一，且含量遠(yuǎn)高于杜仲皮[6-7]，具有降脂減肥、抗自由基、抗氧化、抑菌、抗病毒等作用，對(duì)治療冠心病、高血壓等疾病有顯著的作用[8-12]。近年來(lái)，以杜仲雄花和杜仲葉為原料的開發(fā)利用日益引起人們重視，其中，以杜仲雄花為原料開發(fā)出的茶制品、保健酒、功能飲料等產(chǎn)品具有較高的醫(yī)療保健功效，以杜仲葉為原料相繼在食品、飼料添加劑以及化妝品等領(lǐng)域開發(fā)出系列產(chǎn)品，備受市場(chǎng)青睞[13-16]。

當(dāng)前，植物總黃酮含量測(cè)定的方法有HPLC法、分光光度法等[17-18]。HPLC法結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確，但成本較為高昂。分光光度法測(cè)定總黃酮的原理是金屬離子與酮羰基、鄰位羥基配合形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。其中，以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法最常用[19]，AlCl3比色法也被應(yīng)用于植物中總黃酮的含量測(cè)定[20]，但該法在杜仲中總黃酮含量的測(cè)定還未見報(bào)道?，F(xiàn)分別采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法和AlCl3比色法測(cè)定杜仲雄花和葉中的總黃酮含量，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較，以期建立杜仲中總黃酮含量測(cè)定的最適方法，同時(shí)比較分析杜仲雄花和葉片中總黃酮含量的差異，以期為杜仲資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的杜仲雄花和杜仲葉均采自中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心原陽(yáng)試驗(yàn)基地杜仲基因庫(kù)，基因庫(kù)采用6株小區(qū)，定植行間距為3 m×3 m。雄花是于盛花期分別在樹冠中部的東、西、南、北4個(gè)方向采摘雄花各約10簇，葉片是2015年7月分別在樹冠中部的東、西、南、北4個(gè)方向?qū)Τ墒烊~片進(jìn)行采集，共約20片杜仲葉。樣品采集后低溫冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室，保存?zhèn)溆?。雄花和葉片均采自同一編號(hào)的杜仲樣株，且長(zhǎng)勢(shì)旺盛、無(wú)病蟲害。

1.2 儀器與試劑

儀器：Cary 300紫外-可見分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫）；AL204 電子天平（美國(guó)METTLER TOLEDO）；HT-300BQ 型數(shù)控超聲波清洗器（濟(jì)寧恒通超聲電子設(shè)備有限公司）；DHG-91013SA型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋（鄭州元強(qiáng)儀器設(shè)備有限公司）。

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）；三氯化鋁、醋酸鈉、冰醋酸、乙醇均為分析純；水為超純水。

1.3 方 法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備

稱取20.0 mg蘆丁對(duì)照品，105 ℃干燥至恒質(zhì)量，用60%乙醇溶解，定容至200 mL，配成100 μg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備

將采集的杜仲雄花和杜仲葉樣品在105℃下殺青3 min，然后60℃烘干，粉碎過(guò)60目篩。精密稱取杜仲雄花粉末0.10 g，加入60%乙醇，料液比1∶30，超聲30 min，離心后取上清液，以60%乙醇定容至10 mL，得杜仲雄花樣品提取液，同法制得杜仲葉樣品提取液。

1.3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

1.3.3.1 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法

準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液1.0 mL，移入10 mL 刻度比色管中，加入60%乙醇5 mL，分別加入 5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，振搖后放置 6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.5mL 搖勻后放置6 min，加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液2 mL，用60 %乙醇定容至刻度，快速搖勻，室溫放置15 min。同法制得空白液，在 300～ 600 nm 掃描，發(fā)現(xiàn)蘆丁對(duì)照品溶液在510 nm處有最大吸收峰。

1.3.3.2 AlCl3比色法

準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液1.0 mL，移入10 mL刻度比色管中，依次加入pH值 3.6的醋酸-醋酸鈉緩沖液3 mL，0.1 AlCl3溶液3 mL，用60%乙醇定容至10 mL，快速搖勻，室溫放置30 min。同法制得空白液，在300～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)蘆丁對(duì)照品溶液在400 nm處有最大吸收峰。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法：準(zhǔn)確吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL，按1.3.3.1項(xiàng)下的方法進(jìn)行顯色處理，在510 nm處測(cè)定吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。AlCl3比色法：準(zhǔn)確吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL，按1.3.3.2項(xiàng)下的方法進(jìn)行顯色處理，在400 nm處測(cè)定吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)1.3.4中的方法，可得NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法蘆丁濃度對(duì)吸光度值的線性回歸方程為A=0.015 3C－0.002 7(R2=0.999 5)，表明對(duì)照品在 5.0～ 30 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。AlCl3比色法蘆丁濃度對(duì)吸光度值的線性回歸方程為A=0.020 6C－0.014(R2=0.999 7)，表明對(duì)照品在5.0～ 30 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法評(píng)價(jià)

2.2.1 精密度試驗(yàn)

吸取蘆丁對(duì)照品溶液1.0 mL，按1.3.3.1項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，RSD為0.53%，表明該方法的精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取杜仲雄花樣品溶液1.0 mL，顯色后分別在5、10、15、20、25、30 min測(cè)定吸光度，RSD為0.82%，說(shuō)明樣品顯色后30 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取杜仲雄花樣品6份，按1.3.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，然后測(cè)定吸光度，RSD為0.96%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量杜仲雄花樣品6份，每份0.1 g，分別加入蘆丁對(duì)照品1.0 mL，按1.3.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

式中：r為回收率，%；m1為樣品中總黃酮含量，mg；m2為蘆丁加入量，mg；m3為測(cè)得量，mg。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of recovery tests of total flavonoids

由 表1可 知，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯 色法測(cè)定總黃酮的平均回收率為99.22%，RSD為0.95%，說(shuō)明該方法測(cè)定杜仲雄花中總黃酮具有較高的回收率。

2.3 AlCl3比色法評(píng)價(jià)

2.3.1 精密度試驗(yàn)

吸取蘆丁對(duì)照品溶液1.0 mL，按1.3.3.2項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，RSD為0.46%，表明該方法的精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取杜仲雄花樣品溶液1.0 mL，顯色后后分別在 10、20、30、40、50、60 min測(cè) 定 吸 光 度，RSD為0.94%，說(shuō)明樣品顯色后60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取杜仲雄花樣品6份，按1.3.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，然后測(cè)定吸光度，RSD為0.58%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量杜仲雄花樣品6份，每份0.1 g，分別加入蘆丁對(duì)照品1.0 mL，按1.3.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

式中：r為回收率，%；M1為樣品中總黃酮含量，mg；M2為蘆丁加入量，mg；M3為測(cè)得量，mg。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery tests of total flavonoids

由表2可知，AlCl3比色法測(cè)定總黃酮的平均回收率為99.27%，RSD為1.21%，說(shuō)明該方法測(cè)定杜仲雄花中總黃酮具有較高的回收率。

2.4 杜仲雄花和葉中總黃酮含量的測(cè)定

分別吸取杜仲雄花和杜仲葉供試品溶液1.0 mL，分別按照1.3.3.1和1.3.3.2項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)步驟測(cè)定吸光度，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算出供試品溶液中蘆丁的濃度，并計(jì)算杜仲雄花和葉中總黃酮的含量。

式中：P為樣品中總黃酮的含量，mg·g-1；c為標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出的供試品溶液中蘆丁的濃度，μg·mL-1；V1為樣品待測(cè)液總體積，mL；V2為樣品提取液總體積，mL；V3為測(cè)定用體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法和AlCl3比色法分別測(cè)定杜仲雄花和杜仲葉中總黃酮含量，結(jié)果見表3。由表3可知，13份樣品杜仲雄花和葉中總黃酮含量均存在較大差異。NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法測(cè)定結(jié)果顯示：5號(hào)樣品杜仲雄花總黃酮含量最高，達(dá)到了為41.31 mg·g-1；其次是4號(hào)樣品和9號(hào)樣品，分別為37.29 mg·g-1和37.04 mg·g-1；3號(hào)樣品總黃酮含量最低，僅為29.28 mg·g-1。5號(hào)樣品杜仲葉總黃酮含量最高，達(dá)到了31.15 mg·g-1；3號(hào)樣品杜仲葉總黃酮含量最低，僅為16.59 mg·g-1。AlCl3比色法測(cè)定結(jié)果顯示：5號(hào)樣品杜仲雄花總黃酮含量最高，達(dá)到了30.26 mg·g-1，3號(hào)樣品杜仲雄花總黃酮含量最低，僅為17.35 mg·g-1；杜仲葉中總黃酮含量最高的仍為5號(hào)樣品，為20.05 mg·g-1，含量最低的也是3號(hào)樣品，僅為6.70 mg·g-1。采用2種方法測(cè)定同一份樣品杜仲雄花和杜仲葉中總黃酮含量差別較大，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法測(cè)定結(jié)果明顯比AlCl3比色法偏高，此外，2種方法測(cè)定結(jié)果均為杜仲雄花中總黃酮含量明顯高于杜仲葉片中總黃酮含量。

3 結(jié)論與討論

本研究采用2種常見的分光光度計(jì)法測(cè)定杜仲雄花和杜仲葉中總黃酮含量，主要是依據(jù)鋁離子與黃酮母核中的3位（或5位）上的羥基和4位羰基配合形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[21]（見圖1）。此外，杜仲中的鄰苯二羥基化合物（主要為綠原酸）也會(huì)與Al3+形成螯合物，干擾測(cè)定。而Al3+與鄰苯二羥基形成的螯合物在酸性環(huán)境下會(huì)分解，降低了鄰二酚類化合物的干擾[22]（見圖2）。因此，AlCl3比色法測(cè)定杜仲中總黃酮含量時(shí)專屬性較強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果可達(dá)到預(yù)期要求。仇豪文等[23]以ZrOCl2作為顯色劑改進(jìn)了杜仲葉中總黃酮含量測(cè)定方法，但該方法測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)，不適于杜仲中總黃酮含量的大量測(cè)定。尉芹等[24]用紙層析-Al(NO3)3比色法測(cè)定杜仲葉中總黃酮含量，亦可有效消除干擾，但操作步驟繁瑣。董發(fā)明等[25]采用HPLC法測(cè)得杜仲雄花中總黃酮含量平均為13.13 mg·g-1，比本研究中杜仲雄花總黃酮含量（22.12 mg·g-1）要低，可能與采集的杜仲雄花樣品不同有關(guān)。

表3 杜仲雄花和葉樣品總黃酮含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of total flavonoids content in E. ulmoides male flowers and leafs mg·g-1

采用AlCl3比色法測(cè)定杜仲中總黃酮操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，適合杜仲中總黃酮含量的大量測(cè)定。通過(guò)對(duì)杜仲雄花和杜仲葉中總黃酮含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同材料間杜仲雄花和杜仲葉中總黃酮含量差異較大，且杜仲雄花中總黃酮含量明顯高于杜仲葉中總黃酮含量，為今后杜仲資源開發(fā)利用提供了一定的參考。

圖1 鋁離子與黃酮母核中的3位（或5位）上的羥基和4位羰基配合形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)Fig. 1 Coordinate structure between Al3+ and hydroxyl and carbonyl groups in flavonoids

圖2 AlCl3比色法測(cè)定杜仲雄花總黃酮反應(yīng)原理Fig.2 Principle of total flavonoids in E. ulmoides male flowers with AlCl3 method

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Determination on total flavonoids in male flowers and leaves ofEucommia ulmoidesby spectrophotometry

DU Qingxin1,2, WEI Yanxiu1,2, LIU Panfeng1,2, DU Hongyan1,2
(1.Non-timber Forest Research and Development Center of Chinese Academy of Forestry, Zhengzhou 450003, Henan, China;2. The Eucommia Engineering Research Center of National Forestry Administration, Zhengzhou 450003, Henan, China)

To study the optimal method for the determination of total flavonoids content ofEucommia ulmoides, and analyze the differences of total flavonoids content inEucommia ulmoidesmale flowers and leaves.The content of total flavonoids inEucommia ulmoidesmale flowers and leaves were determined by NaNO2-Al(NO3)3-NaOH method and AlCl3colorimetric method, respectivly.The results showed that NaNO2-Al(NO3)3-NaOH method existed interference and the content of total flavonoids is higher, while AlCl3colorimetric method is easy, highly reproducible, accurate, the absorbency and concentration of Rutin had a good linear in range of 5～30 ug·mL-1(R2=0.999 7), the average recovery rate was 99.27%, RSD 1.21%, and the method is suitable for mass determination of total flavonoids ofEucommia ulmoides. According to the determination results, the differences of total flavonoids content is larger among different materials and the content of total flavonoids in male flowers was obviously higher than that in leaves, which could provide a certain reference for the development and utilization ofEucommia ulmoidesresources.

Eucommia ulmoides; male flowers; leaves; total flavonoids; spectrophotometry

10.14067/j.cnki.1673-923x.2017.05.000 http: //qks.csuft.edu.cn

2015-12-24

國(guó)家“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域科技計(jì)劃課題研究任務(wù)合約（2012BAD21B0502）

杜慶鑫，碩士研究生

杜紅巖，研究員，博士生導(dǎo)師；E-mail：dhy515@126.com

杜慶鑫，魏艷秀，劉攀峰，等.分光光度法測(cè)定杜仲雄花和葉中的總黃酮[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,37(5):96-100.

S718.43

A

1673-923X(2017)05-0096-05

[本文編校：謝榮秀]