溫度對(duì)微囊化重組CHO細(xì)胞生長(zhǎng)和去氨普酶表達(dá)的影響

王 雨, 何盛南, 蔡志明, 牟麗莎

(1. 中山大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 廣州 510275； 2. 深圳市第二人民醫(yī)院, 深圳 518035)

溫度對(duì)微囊化重組CHO細(xì)胞生長(zhǎng)和去氨普酶表達(dá)的影響

王 雨1,2, 何盛南1,2, 蔡志明2, 牟麗莎1,2

(1. 中山大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 廣州 510275； 2. 深圳市第二人民醫(yī)院, 深圳 518035)

為了研究不同溫度對(duì)微囊化rCHO細(xì)胞生長(zhǎng)代謝和重組蛋白表達(dá)影響，采用不同溫度培養(yǎng)微囊化rCHO細(xì)胞，經(jīng)MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，生物傳感器測(cè)定葡萄糖和乳酸代謝，纖溶平板測(cè)定去氨普酶(DSPA，Desmodus rotundus salivary plasminogen activator)蛋白表達(dá)量。結(jié)果表明，低溫培養(yǎng)降低微囊化rCHO的增殖速率和細(xì)胞密度，但提高了重組蛋白的生產(chǎn)?？梢?jiàn)溫度顯著影響微囊化rCHO的生長(zhǎng)代謝和重組蛋白表達(dá)，33℃下可以將DSPA蛋白生產(chǎn)量最大提高41%。

微膠囊；溫度；重組蛋白表達(dá)；細(xì)胞培養(yǎng)

去氨普酶(DSPA，Desmodus rotundus salivary plasminogen activator) 是一種從南美吸血蝙蝠唾液中提取的纖溶酶原激活劑，也是第3代溶栓藥物[1]。與第1代和第2代溶栓藥物，如tPA、uPA等相比，DSPA具有高度的溶栓能力，而且纖維蛋白特異性更高，不易引起出血性并發(fā)癥[2-3]，目前已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)。DSPA可通過(guò)重組技術(shù)在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中進(jìn)行生產(chǎn)[4]，通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)蛋白藥物也是生物制藥的發(fā)展趨勢(shì)[5]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)越來(lái)越多地采用無(wú)血清培養(yǎng)基，可以避免血清源性污染和有利于下游產(chǎn)品的純化，但是同時(shí)也易造成細(xì)胞的凋亡，降低了細(xì)胞的蛋白表達(dá)能力。我國(guó)每年發(fā)生缺血性腦卒中的人口約有200萬(wàn)，臨床治療劑量巨大，如何高效地表達(dá)蛋白成為重要的研發(fā)環(huán)節(jié)。

從當(dāng)前發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看，使用攪拌式生物反應(yīng)器進(jìn)行懸浮細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)是目前世界范圍內(nèi)各大生物公司產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展方向。動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清、懸浮培養(yǎng)在提高細(xì)胞密度、單位產(chǎn)量、簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本、保證產(chǎn)品質(zhì)量等方面都起到非常重要的作用，是高效生產(chǎn)最有效的途徑。目前動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)已經(jīng)是世界各大生物公司競(jìng)相開(kāi)發(fā)的前沿課題，美國(guó)FDA也要求各生物公司建立的規(guī)?；a(chǎn)技術(shù)平臺(tái)。同時(shí)由于大型生物反應(yīng)器容量的過(guò)剩，國(guó)際上對(duì)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究方向集中在培養(yǎng)工藝的優(yōu)化。

我國(guó)的生物技術(shù)藥物發(fā)展起步較晚，與國(guó)外相比，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的上游技術(shù)方面，我國(guó)的基因重組技術(shù)水平低，構(gòu)建的細(xì)胞系表達(dá)能力遠(yuǎn)低于國(guó)外。以tPA為例，我國(guó)的CHO表達(dá)能力僅是美國(guó)的1/10～1/5，提高細(xì)胞系的表達(dá)能力需要大量的資金和技術(shù)投入，短時(shí)間內(nèi)極難完成。同時(shí)，我國(guó)的反應(yīng)器容量小，如果盲目套用國(guó)外成熟的哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)，就要相應(yīng)擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，從而將成本增加至5～10倍，這顯然是極不現(xiàn)實(shí)的。因此，根據(jù)我國(guó)的現(xiàn)狀優(yōu)化動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)是發(fā)展重組蛋白藥物的必然要求。

重組蛋白的生產(chǎn)可以通過(guò)兩個(gè)方面提高：細(xì)胞密度和細(xì)胞的蛋白表達(dá)能力。微囊化培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)是Lim和Sun提出的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)[6]，利用聚賴(lài)氨酸-海藻酸鈉-聚賴(lài)氨酸(APA)微囊將細(xì)胞包裹在半透膜中。微囊膜可防止細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中受到物理?yè)p傷，同時(shí)半透膜允許小分子影響物質(zhì)自由通過(guò)被細(xì)胞利用。微囊為細(xì)胞提供了一個(gè)相對(duì)封閉的微環(huán)境，使細(xì)胞在囊內(nèi)呈三維立體方式生長(zhǎng)，有利于細(xì)胞間信息傳遞，提高重組細(xì)胞的產(chǎn)物表達(dá)能力[7]。在我們的前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與懸浮培養(yǎng)相比，微囊化培養(yǎng)可以將CHO的DSPA生產(chǎn)能力從32.5 μg/mL提高到95.5 μg/mL[8]。

細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境溫度是動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的重要優(yōu)化指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)溫度的適當(dāng)降低會(huì)使部分種類(lèi)的細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝和蛋白表達(dá)發(fā)生變化。例如，培養(yǎng)溫度降低時(shí)，雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝變緩，存活率提高，抗體的生產(chǎn)能力保持穩(wěn)定[9-11]；重組BHK細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝減緩，不影響重組抗凝血酶III的生產(chǎn)[12]；人胚胎肺細(xì)胞生產(chǎn)TPA的能力提高[13]。

優(yōu)化重組CHO細(xì)胞的培養(yǎng)工藝對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝及蛋白表達(dá)都是十分重要的。為了提高蛋白的容積產(chǎn)率，既要獲得較高的細(xì)胞密度，又要提高細(xì)胞的蛋白表達(dá)能力。本實(shí)驗(yàn)中我們采用微囊化技術(shù)對(duì)表達(dá)DSPA蛋白的重組CHO細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期時(shí)用不同溫度對(duì)微囊化細(xì)胞進(jìn)行處理，考察低溫條件對(duì)細(xì)胞密度和蛋白表達(dá)的影響，以期對(duì)微囊化細(xì)胞培養(yǎng)工藝的優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株及試劑：重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(recombinant China Hamster Ovary， rCHO)由山東齊魯制藥有限公司惠贈(zèng)；培養(yǎng)基為CD OptiCHO(美國(guó)，Gibco公司)；谷氨酰胺(美國(guó)，Sigma公司)。聚賴(lài)氨酸(美國(guó)，Sigma公司)；海藻酸鈉(青島晶巖生物技術(shù)有限公司)；凝血酶原(美國(guó)，Sigma公司)；纖維蛋白原(美國(guó)，Sigma公司)；纖溶酶原(美國(guó)，Sigma公司)；MTT(美國(guó)，Sigma公司)。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器： MS-353酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Labsystems Co. Ltd,芬蘭)；Heraeus BB 16UV CO2恒溫培養(yǎng)箱(Heal Force Development Co. Ltd,中國(guó))；大功率高壓脈沖微膠囊制備儀(本實(shí)驗(yàn)室研制)；微囊靜電液滴發(fā)生器(本實(shí)驗(yàn)室研制)。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟

1.2.1 rCHO細(xì)胞的培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期后用臺(tái)盼蘭染色計(jì)算活細(xì)胞數(shù)量，接種到100 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，所用培養(yǎng)液為CD OptiCHO培養(yǎng)液(4 mmol/L谷氨酰胺)，接種密度為2×105/mL。每3天取上清于-20℃冰箱內(nèi)保存，并用臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)量。

1.2.2 微囊化rCHO細(xì)胞的制備[7]細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期后用臺(tái)盼蘭染色計(jì)算活細(xì)胞數(shù)量，懸于1.5%(W/V)海藻酸鈉溶液中，細(xì)胞密度為2×106/mL。使用微囊靜電液滴發(fā)生器將細(xì)胞-海藻酸鈉混懸液滴入1.1%(W/V)的CaCl2溶液中鈣化20 min形成海藻酸鈣膠珠，然后依次用多聚賴(lài)氨酸成膜，用55 mmol/L檸檬酸鈉溶液液化，獲得包裹rCHO細(xì)胞的微膠囊。

1.2.3 微囊化rCHO細(xì)胞的培養(yǎng) 將制備好的微囊化rCHO細(xì)胞與培養(yǎng)基按體積比1∶10加入100 mL培養(yǎng)瓶中，分別在30℃、33℃和37℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，所用培養(yǎng)液為CD OptiCHO培養(yǎng)液(4 mmol/L谷氨酰胺)。每3天取上清于-20℃冰箱內(nèi)保存，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)體系進(jìn)行全換液。

1.2.4 微囊內(nèi)活細(xì)胞密度測(cè)定 微囊內(nèi)活細(xì)胞密度測(cè)量采用MTT法,MTT被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。將適量微囊加入24孔板，按10%體積加入MTT溶液，于37℃，5% CO2及飽和濕度條件下孵育24 h，使用DMSO溶解藍(lán)色結(jié)晶后在酶標(biāo)儀570/630 nm雙波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。根據(jù)吸光度OD值與微囊內(nèi)活細(xì)胞做標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞密度。

1.2.5 葡萄糖和乳酸代謝的測(cè)定 培養(yǎng)液中的葡萄糖和乳酸濃度采用SBA-40C型生物傳感分析儀測(cè)定。

1.2.6 DSPA蛋白的測(cè)定 由Granelli等于1978年建立的檢測(cè)PA物質(zhì)的體外纖溶活性，模擬PA溶栓反應(yīng)，溶圈直徑與PA含量的對(duì)數(shù)線性相關(guān)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品形成溶圈梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線估測(cè)PA含量，是定性和半定量檢測(cè)PA的首選方法。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道制作纖維蛋白平板[14]，以生理鹽水為溶劑配制0.5%瓊脂糖凝膠，加入纖維蛋白原(0.529 U/mL)，凝血酶原(0.056 U/mL)，纖溶酶原(少量)，倒入水平放置的24孔板蓋內(nèi)凝固后打孔使用。向每孔內(nèi)加入梯度濃度的DSPA標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)量溶圈直徑，制作濃度直徑標(biāo)準(zhǔn)曲線。向每孔內(nèi)加入待測(cè)樣品，測(cè)量溶圈直徑，回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到待測(cè)樣品的DSPA濃度。

其中μp為DSPA比生產(chǎn)速率，μg/106cells/d；X為細(xì)胞密度，106/mL；△P為DSPA產(chǎn)量mg/L；t為培養(yǎng)時(shí)間，d；n代表時(shí)間點(diǎn)。

其中YX/G為細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的得率系數(shù)，106/mg;△X為細(xì)胞增殖數(shù)量，106/mL；△G為葡萄糖消耗，mg/L。

其中YP/G為DSPA對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的得率系數(shù)，mg/mg; △P為DSPA產(chǎn)量，mg/L；△G為葡萄糖消耗量，mg/L。

其中YL/G為乳酸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的得率系數(shù)，mg/mg; △L為乳酸生成量，mg/L；△G為葡萄糖消耗量，mg/L。

2 結(jié)果

2.1 微囊化培養(yǎng)對(duì)重組CHO細(xì)胞生長(zhǎng)和DSPA表達(dá)的影響

圖 1 不同培養(yǎng)方式下rCHO細(xì)胞的生長(zhǎng)和DSPA生產(chǎn)曲線

為了考察微囊化培養(yǎng)對(duì)rCHO生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的影響，本文考察了在不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞的MTT活性，根據(jù)臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)及微囊化計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到不同培養(yǎng)條件下微囊化rCHO細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線和DSPA表達(dá)曲線(圖1-A和1-B)。從圖1A中可以看出，不同培養(yǎng)條件下rCHO的生長(zhǎng)趨勢(shì)是一致的，在培養(yǎng)初期生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)一周左右后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。而微囊化細(xì)胞的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期可以維持12 d，并且獲得高密度的細(xì)胞數(shù)量，最大細(xì)胞密度為(3.86±0.09)×106/mL，是裸細(xì)胞最大密度的223%。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，微囊化rCHO的DSPA蛋白產(chǎn)量一直高于裸細(xì)胞培養(yǎng)，在第15天兩種培養(yǎng)方式都獲得了最高產(chǎn)量，微囊化培養(yǎng)的最高產(chǎn)量為(41.48±1.01)mg/L,比裸細(xì)胞的最高產(chǎn)量提高了72%(圖1-B)。比生成速率(μp)的物理意義是單位時(shí)間內(nèi)單位數(shù)量的rCHO的DSPA產(chǎn)量，表征了單細(xì)胞的重組蛋白生產(chǎn)能力。從圖1-C可以看出，微囊化培養(yǎng)促進(jìn)了rCHO細(xì)胞的DSPA生產(chǎn)能力，最大生產(chǎn)能力為(7.68±0.19)μg/106cells/d，比裸細(xì)胞培養(yǎng)提高了59%。微囊化培養(yǎng)不但提高了rCHO的細(xì)胞密度，而且促進(jìn)了細(xì)胞的蛋白生產(chǎn)能力，從而增加了培養(yǎng)體系的DSPA產(chǎn)量。

2.2 溫度對(duì)微囊化rCHO細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

圖 2 溫度對(duì)微囊化rCHO細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

在微囊化細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)采用不同的培養(yǎng)溫度，結(jié)果顯示在繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中，在低溫條件(30℃)下，細(xì)胞數(shù)量減少，比生長(zhǎng)速率為負(fù)。在較低溫度(33℃)下，rCHO細(xì)胞的生長(zhǎng)速度減慢，最大密度為(3.06±0.07)×106/mL，是37℃培養(yǎng)溫度下最大細(xì)胞密度的79%，二者的比生長(zhǎng)速率無(wú)顯著性差異。但同時(shí)低溫也延長(zhǎng)了細(xì)胞維持最大密度的時(shí)間，并且在37℃下細(xì)胞密度下降的培養(yǎng)后期，仍然保持了較高的細(xì)胞密度(圖2)。盡可能延長(zhǎng)高密度細(xì)胞的生長(zhǎng)時(shí)間，是獲得蛋白高產(chǎn)量的途徑之一。

2.3 溫度對(duì)微囊化rCHO細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

為了考察微囊化rCHO細(xì)胞在不同溫度下的蛋白表達(dá)，使用纖溶平板法測(cè)定培養(yǎng)體系中DSPA的濃度即容積產(chǎn)率，結(jié)果如圖3。低溫條件(30℃)下，微囊化rCHO的蛋白表達(dá)能力持續(xù)下降。從圖3-A中可知，33℃下微囊化rCHO細(xì)胞的DSPA生產(chǎn)量與37℃相比，細(xì)胞的數(shù)量減少，但是蛋白表達(dá)量反而增加。最大值分別可達(dá)(48.43±0.88)mg/L和(41.48±1.01)mg/L，低溫培養(yǎng)的DSPA最大表達(dá)量是37℃的117%。對(duì)于DSPA比生產(chǎn)速率的比較(圖3-B)表明，33℃下，微囊化rCHO細(xì)胞的DSPA生產(chǎn)能力比37℃下最大提高了41%，并且在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后的一周內(nèi)保持較高的蛋白表達(dá)活性。

圖 4 溫度對(duì)微囊化rCHO細(xì)胞代謝的影響Fig 4 The effect of temperature on the metabolism of microencapsulated rCHO cells

2.4 溫度對(duì)微囊化rCHO細(xì)胞代謝的影響

微囊化rCHO細(xì)胞的葡萄糖及乳酸代謝由生物傳感器測(cè)得，結(jié)果見(jiàn)圖4。在培養(yǎng)溫度由37℃降至33℃時(shí)，微囊化rCHO細(xì)胞的葡萄糖消耗和乳酸生成隨著溫度降低而減少，說(shuō)明隨著培養(yǎng)溫度的降低，葡萄糖代謝速率降低。結(jié)合圖2進(jìn)行分析，在溫度從37℃降低到33℃的前3天培養(yǎng)時(shí)間，微囊化rCHO細(xì)胞幾乎沒(méi)有增殖，對(duì)葡萄糖的攝取出現(xiàn)明顯減少，但乳酸生成量增加，說(shuō)明在低溫培養(yǎng)初期，微囊化rCHO的葡萄糖代謝更多地進(jìn)入糖酵解途徑。分析原因在于，培養(yǎng)溫度的驟然下降，線粒體對(duì)有氧代謝功能減弱，而經(jīng)過(guò)短暫適應(yīng)過(guò)程后，微膠囊微環(huán)境幫助囊內(nèi)拮抗環(huán)境變化，使細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用恢復(fù)到初始水平，但整體仍低于較高溫度下。同時(shí)，隨著溫度的降低，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的得率升高，乳酸對(duì)葡萄糖的得率降低，產(chǎn)物對(duì)葡萄糖的得率顯著增加，結(jié)果見(jiàn)圖5。說(shuō)明隨著溫度降低，葡萄糖用于無(wú)氧呼吸的比例降低，用于細(xì)胞增殖和DSPA蛋白生產(chǎn)的葡萄糖比例增加。在溫度對(duì)雜交瘤細(xì)胞影響的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的規(guī)律[15]。結(jié)合圖2～5，可以發(fā)現(xiàn)，在低溫條件下(30℃)，微囊化CHO細(xì)胞數(shù)量，代謝及蛋白生產(chǎn)能力均下降，不適合進(jìn)行培養(yǎng)。

3 討論

目前的研究表明：微囊化培養(yǎng)和低溫培養(yǎng)都有利于重組細(xì)胞的蛋白表達(dá)。為了獲得最大的重組蛋白產(chǎn)量，一方面要盡可能提高細(xì)胞密度，另一方面要保持細(xì)胞的蛋白表達(dá)能力。

圖 5 溫度對(duì)微囊化rCHO細(xì)胞的細(xì)胞得率、產(chǎn)物得率和乳酸得率的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，微囊化rCHO細(xì)胞可以提高DSPA蛋白的產(chǎn)量，原因在于微囊化培養(yǎng)為細(xì)胞提供了三維生長(zhǎng)環(huán)境，不僅提高了細(xì)胞密度，而且促進(jìn)了單位細(xì)胞生產(chǎn)DSPA蛋白的能力，所以微囊化培養(yǎng)提高了生產(chǎn)體系的DSPA產(chǎn)量。但微囊化細(xì)胞的增殖和蛋白表達(dá)存在負(fù)相關(guān)，當(dāng)細(xì)胞增殖過(guò)快時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)多用于細(xì)胞自身蛋白的合成，重組蛋白的表達(dá)受到影響，并非細(xì)胞密度越大，所能獲得的重組蛋白的產(chǎn)量越高[16]。

適當(dāng)降低溫度減緩了細(xì)胞生長(zhǎng)，使最大細(xì)胞密度降低，延長(zhǎng)了細(xì)胞生長(zhǎng)的延滯期，細(xì)胞增殖較快時(shí)，更多細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的G1期，而處于表達(dá)重組蛋白的G0期的細(xì)胞數(shù)量少直接導(dǎo)致重組蛋白產(chǎn)量低[17-18]。低溫培養(yǎng)增加了雜交瘤細(xì)胞的G1期比例[19]，提高了單克隆抗體的生產(chǎn)[15]。Kaufmann在CHO細(xì)胞的低溫培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，溫度降低誘導(dǎo)了RNA結(jié)合蛋白CIRP的過(guò)量表達(dá)，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)停留在細(xì)胞周期的G1期[20]，溫度降低也會(huì)延遲細(xì)胞的凋亡[21]。低溫培養(yǎng)降低了細(xì)胞對(duì)葡萄糖的代謝能力和乳酸對(duì)葡萄糖的得率，提高了細(xì)胞和DSPA蛋白對(duì)葡萄糖的得率，說(shuō)明低溫條件下葡萄糖更多的用于細(xì)胞增殖和DSPA蛋白的合成，因而重組蛋白的表達(dá)活性較高。

本文著重研究了不同溫度對(duì)微囊化rCHO細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝及蛋白表達(dá)能力的影響。結(jié)果表明，隨著溫度適當(dāng)降低，微囊化rCHO的細(xì)胞密度降低，但是蛋白表達(dá)能力并不隨著溫度降低而提高，從而提高蛋白生產(chǎn)量。該結(jié)果對(duì)微囊化培養(yǎng)rCHO細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白的工藝優(yōu)化提供了一定的依據(jù)。

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EffectsoftemperatureonmicroencapsulatedrecombinantCHOcellsproliferationandDSPAproduction

WANG Yu1, 2, HE Sheng-nan1, 2, CAI Zhi-ming2, MOU Li-sha1, 2

(1. Medicine School， Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275; 2. Shenzhen Second People′s Hospital, Shenzhen 518035, China)

To investigate the effects of temperature on microencapsulated recombinant CHO (rCHO) cells proliferation, metabolism and recombinant protein expression, microencapsulated rCHO cells were cultured under different temperature. MTT method was used to measure the cell density, biosensor was used to measure the metabolism of glucose and lactate, and fibrin plate assay was used to measure the expression of DSPA protein. Lower temperature inhibited the cell growth rate and cell density, but improved the DSPA production capacity of microencapsulated rCHO. The DSPA production increased by 41% at 33℃ compared with 37℃.

microencapsulated; temperature; recombinant protein expression; cell culture

2016-11-30；

2016-12-13

國(guó)家自然科學(xué)基金(21602138)；深圳市三名工程；深圳市科創(chuàng)委學(xué)科布局項(xiàng)目(JCYJ20160229204849975)；高水平醫(yī)學(xué)學(xué)科建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)基金(2016031638)；深圳市科創(chuàng)委企業(yè)工程中心項(xiàng)目(GCZX2015043017281705)

王 雨，博士，助理研究員，研究方向?yàn)樯镝t(yī)學(xué)工程，E-mail:sszzxeno@126.com

牟麗莎，博士，副研究員，研究方向?yàn)樯镝t(yī)學(xué)工程， E-mail:molly__molly@163.com

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.013

Q813; Q819

A

2095-1736(2017)06-0013-06