鮑魚內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶中試規(guī)模制備研究

陳勝男， 張 利， 石賢愛, 2， 陳金梅， 蔡振輝

(1. 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 福建 福州 350116； 2. 福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350002)

鮑魚內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶中試規(guī)模制備研究

陳勝男1， 張 利1， 石賢愛1, 2， 陳金梅1， 蔡振輝1

(1. 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 福建 福州 350116； 2. 福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350002)

采用膠體磨勻漿、 高速管式離心、 陶瓷復(fù)合膜過(guò)濾、 超濾、 DEAE-瓊脂糖離子交換層析和CM-瓊脂糖離子交換層析的中試制備工藝， 從鮑魚內(nèi)臟中分離純化得到β-葡萄糖苷酶. 研究發(fā)現(xiàn)： 膠體磨勻漿所得勻漿液總酶活為12 174.21 U， 比活力為0.158 U·mg-1； 高速管式離心兩次后得到粗酶液， 酶比活力為0.247 U·mg-1； 陶瓷復(fù)合膜過(guò)濾后所得清液的酶比活力為0.133 U·mg-1； 超濾濃縮脫鹽后所得濃縮液的酶比活力為0.249 U·mg-1； DEAE-瓊脂糖陰離子交換層析洗脫緩沖液的最佳pH值為7.5， CM-瓊脂糖陽(yáng)離子交換層析洗脫緩沖液的最佳pH值為6.0; DEAE-瓊脂糖陰離子交換層析后收集酶活性組分的酶比活力為0.492 U·mg-1， CM-瓊脂糖陽(yáng)離子交換層析收集酶活性組分的酶比活力為1.709 U·mg-1， 純化倍數(shù)為10.78， 收率為5.0%.

鮑魚內(nèi)臟；β-葡萄糖苷酶； 中試； 純化

0 引言

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase， CE3.2.1.21)能夠催化水解芳基和烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵并生成葡萄糖[1-2]， 是水解纖維素及合成紅景天苷的關(guān)鍵酶[3]. 目前關(guān)于β-葡萄糖苷酶的研究多集中于微生物[4-8]， 也有部分水生生物[9-11].

鮑魚內(nèi)臟酶主要集中在消化酶. 廖金花等[12]采用離子交換柱層析及分子篩技術(shù)從雜色鮑內(nèi)臟分離純化得到堿性磷酸酶. 文獻(xiàn)[13]采用鹽析、 透析及柱層析等技術(shù)從鮑魚內(nèi)臟中得到纖維素酶及瓊脂酶. 宮國(guó)君等[14]從皺紋盤鮑內(nèi)臟分離純化得到β-1, 3-葡聚糖酶. 石賢愛等[15]從鮑魚內(nèi)臟中分離純化得到β-葡萄糖苷酶. 目前關(guān)于從鮑魚內(nèi)臟中提取純化各種酶類均處于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的研究， 尚未見在中試規(guī)模制備β-葡萄糖苷酶的報(bào)道. 本研究在前期實(shí)驗(yàn)室規(guī)模研究的基礎(chǔ)上， 采用多功能膠體磨、 高速管式離心機(jī)、 陶瓷復(fù)合膜過(guò)濾設(shè)備、 超濾設(shè)備、 DEAE-瓊脂糖層析柱和CM-瓊脂糖層析柱， 研究從鮑魚內(nèi)臟中制備β-葡萄糖苷酶的中試工藝， 以期為更大規(guī)模β-葡萄糖苷酶的分離純化奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

鮑魚內(nèi)臟， 由福建莆田匯豐食品公司提供； 對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNPG純度98%以上)、 DEAE-瓊脂糖、 CM瓊脂糖購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司； 牛血清蛋白(BSA)購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限工司， 純度99.9%以上； 其他試劑均為分析純， 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定及蛋白含量測(cè)定

按照文獻(xiàn)[15]描述的方法測(cè)定β-葡萄糖苷酶活力及蛋白含量.β-葡萄糖苷酶液活力定義： 在一定條件下， 1.0 mL酶液1 min內(nèi)催化水解pNPG生成1微摩爾數(shù)pNP定義為一個(gè)活力單位(U).

1.2.2 粗酶提取

1) 膠體磨勻漿. 取冷凍鮑魚內(nèi)臟8.0 kg(先將內(nèi)臟剪碎)， 以1∶3加入冰冷Tris-HCl緩沖液(50 mmol·L-1， pH 7.0)24.0 L， 在多功能膠體磨中勻漿后， 加入210.0 g的NaCl， 使之終濃度為0.15 mol·L-1. 將勻漿液置于4 ℃， 攪拌抽提2.0 h后， 靜置過(guò)夜.

2) GQ75B高速管式離心. 將上述勻漿液通入GQ75B高速管式離心機(jī)(蠕動(dòng)泵流速0.55 L·min-1， 分離筒轉(zhuǎn)速20 000 r·min-1)高速離心1 h去除大顆粒固體殘?jiān)?收集上清液. 上清液再次高速離心得到粗酶液.

1.2.3 酶分離純化

1) 陶瓷復(fù)合膜過(guò)濾. 將粗酶液轉(zhuǎn)入陶瓷復(fù)合膜(膜管為19通道， 外徑30 mm， 長(zhǎng)度1 016 mm)進(jìn)行錯(cuò)流過(guò)濾.

2) 超濾脫鹽、 濃縮. 將過(guò)濾得到的清液進(jìn)行超濾濃縮， 超濾膜截留分子量為10 kD， 待所有清液經(jīng)超濾濃縮至3 L濃縮液后， 用10% AgNO3溶液檢測(cè)脫鹽是否徹底. 每12 h補(bǔ)充清液至超濾罐滿. 在超濾3、 17、 32、 46、 60、 70 h時(shí)取樣分別測(cè)定濃縮液和透出液的酶活力和蛋白含量.

3) DEAE-瓊脂糖柱層析. 用Tris-HCl緩沖液(pH=7.5、 50 mmol·L-1)平衡后上樣， 上樣體積為1 L， 然后用Tris-HCl緩沖液(pH=7.5， 50 mmol·L-1， 含0～0.4 mol·L-1NaCl)進(jìn)行梯度洗脫， 流速為20.0 mL·min-1， 每5 min收集一管， 分別測(cè)定各管酶活力和蛋白含量， 收集活性組分進(jìn)行CM-瓊脂糖柱層析.

4) CM-瓊脂糖柱層析. 用Tris-HCl緩沖液(pH=6.0， 50 mmol·L-1)平衡后上樣， 然后用Tris-HCl緩沖液(pH=6.0、 50 mmol·L-1， 含0～0.3 mol·L-1NaCl)進(jìn)行梯度洗脫， 流速為20.0 mL·min-1， 每5 min收集一管. 分別測(cè)定各管酶活力和蛋白含量并收集活性組分.

2 結(jié)果與討論

圖1 鮑魚內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶中試規(guī)模制備流程圖Fig.1 The flow diagram of pilot-plant scale preparation of β-glucosidase from abalone viscera

常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制備鮑魚內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶的工藝為： 微型組織勻漿、 硫酸銨沉淀、 透析、 DEAE-纖維素柱層析和Sephadex G-100柱層析[15]. 由于微型組織勻漿、 透析只適用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模， 硫酸銨分段鹽析對(duì)于中試來(lái)說(shuō)成本太大、 操作不便， 因而本研究采用如圖1所示的中試工藝.

勻漿設(shè)備改為膠體磨勻漿, 離心設(shè)備由高速冷凍離心機(jī)改至高速管式離心機(jī)， 離心量從50 mL擴(kuò)大至30～40 L， 而轉(zhuǎn)速?gòu)?5 000增加至20 000 r·min-1. 陶瓷復(fù)合膜過(guò)濾設(shè)備(過(guò)濾精度0.05 μm)用于去除未被分離的微小顆粒物質(zhì). 改用超濾設(shè)備進(jìn)行脫鹽濃縮， 操作簡(jiǎn)便且清洗簡(jiǎn)單. 由于鮑魚內(nèi)臟中纖維素酶和葡聚糖酶含量較高[13]， 且Sephadex G-100的上樣量有限， 因而改用DEAE-瓊脂糖和CM-瓊脂糖(床層體積φ5.5 cm×45 cm)， 以替代DEAE-纖維素和Sephadex G-100的方案.

2.1 膠體磨勻漿

將8.0 kg鮑魚內(nèi)臟勻漿后獲得32.6 L勻漿液， 總酶活為12 174.21 U， 總蛋白為76 812.16 mg， 比活力為0.158 U·mg-1.

2.2 高速管式離心

高速管式離心結(jié)果如表1所示. 從表1可知， 第二次高速管式離心后獲得的粗酶液比活較第一次離心稍高， 為0.247 U·mg-1，純化倍數(shù)為1.56，收率為79.2%，但粗酶液仍很渾濁.

表1 高速管式離心分離效果Tab.1 Separation results with high speed tubular centrifuge

2.3 陶瓷膜過(guò)濾

陶瓷膜過(guò)濾是在外壓作用下， 粗酶液在膜通道內(nèi)流動(dòng)， 酶及其他可溶性物質(zhì)透過(guò)膜并形成清液， 微小顆粒物被膜截留并形成濃液回流至原料罐. 如此不斷循環(huán)達(dá)到分離純化的目的. 結(jié)果如表2所示.

表2 陶瓷復(fù)合膜過(guò)濾結(jié)果Tab.2 Filtration results with ceramic composite membrane

從表2可知， 所得清液總酶活為2 977.71 U， 濃液的總酶活為1 531.70 U. 陶瓷復(fù)合膜設(shè)備在運(yùn)作過(guò)程產(chǎn)生的沖擊力會(huì)導(dǎo)致酶活損失嚴(yán)重， 因而在開始運(yùn)作時(shí)需確保設(shè)備通量減少運(yùn)作時(shí)間， 且在高速離心時(shí)應(yīng)盡量去除大分子固體顆粒以增加陶瓷膜的通量. 部分酶被截留在濃液中， 因而應(yīng)收集濃液留待下次膜過(guò)濾時(shí)繼續(xù)處理或者加水稀釋盡量使酶透過(guò)膜， 提高酶活的總回收率.

2.4 超濾濃縮脫鹽

超濾的主要目的是將陶瓷復(fù)合膜濾出的清液進(jìn)行濃縮并脫鹽以便進(jìn)行離子交換. 由于陶瓷復(fù)合膜過(guò)濾出的清液有24.3 L， 而超濾的通量為0.292 L·h-1， 所以超濾至3 L需72 h， 每12 h補(bǔ)充清液至超濾罐滿. 超濾結(jié)果如表3所示. 隨著超濾時(shí)間增加， 濃縮液的酶活力及比活力也逐步增加， 但超濾72 h后其比活力卻減少了， 其原因是超濾設(shè)備的機(jī)械剪切力導(dǎo)致部分酶的蛋白結(jié)構(gòu)被破壞而失活. 因此超濾前應(yīng)檢驗(yàn)超濾的通量是否正常， 如超濾的通量太小應(yīng)對(duì)超濾膜進(jìn)行清洗或及時(shí)更換超濾膜， 盡量減少超濾時(shí)間， 減少酶失活. 而透出液的酶活力都很微弱, 說(shuō)明截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 kD的超濾膜是適用的， 不會(huì)使酶大量流失.

表3 超濾濃縮結(jié)果Tab.3 Result of ultrafiltration

續(xù)表3

t取樣/h項(xiàng)目酶活力/U·mL-1蛋白含量/mg·mL-1比活力/U·mg-132濃縮液0．293±0．0081．246±0．0070．235±0．008透出液0．009±0．0020．107±0．0270．084±0．00246濃縮液0．340±0．0021．291±0．0130．263±0．001透出液0．000±0．0020．084±0．0020．000±0．00760濃縮液0．487±0．0031．429±0．0220．341±0．007透出液0．001±0．0010．015±0．0060．066±0．00572濃縮液0．516±0．0032．070±0．0090．249±0．003透出液0．029±0．0060．289±0．0090．100±0．008

2.5 弱堿性陰離子DEAE-瓊脂糖柱層析

2.5.1 洗脫緩沖液pH的選擇

從DEAE-瓊脂糖層析柱中穿透出來(lái)的酶活力回收率與洗脫緩沖液pH值的關(guān)系(如圖2所示)可知， 當(dāng)pH值為7.5時(shí)， 酶活回收率最高， 為78.3%. 因此當(dāng)進(jìn)行弱堿性陰離子DEAE-瓊脂糖柱層析純化時(shí)， 應(yīng)選擇pH7.5的洗脫緩沖液.

圖2 洗脫緩沖液pH值對(duì)酶活回收率的影響 圖3 DEAE-瓊脂糖柱層析洗脫圖譜Fig.2 Effect of elution buffer pH on recovery of enzymatic activity Fig.3 Elution diagram of DEAE-sepharose chromatography

2.5.2 弱堿性陰離子DEAE-瓊脂糖柱層析純化效果

將濃縮脫鹽后的酶液1.0 L上樣后， 用0～0.4 mol·L-1NaCl、 50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)梯度洗脫如圖3所示. 從圖3可以看出, 用pH 7.5緩沖液洗脫時(shí)， 大部分β-葡萄糖苷酶直接從柱中洗脫出來(lái)， 形成蛋白峰II-1、 II-2、 II-3、II-4以及酶活力峰I-1和I-2(其中， OD410表示酶活力的吸光值，OD595表示蛋白的吸光值，下同). 由于I-1酶活力峰峰值最大， 且相對(duì)蛋白含量較低， 故收集I-1峰處活性組分共1.33 L. 經(jīng)過(guò)DEAE-瓊脂糖柱層析將大部分雜蛋白與β-葡萄糖苷酶分離達(dá)到純化目的.

2.6 弱酸性陽(yáng)離子CM-瓊脂糖柱層析

2.6.1 洗脫緩沖液pH的選擇

從CM-瓊脂糖層析柱中穿透出來(lái)的酶活力回收率與洗脫緩沖液pH值的關(guān)系(如圖4所示)可知， 當(dāng)pH值為6.0時(shí)， 酶活回收率最高， 為84.6%. 因此CM-瓊脂糖柱層析應(yīng)選擇pH6.0的洗脫緩沖液.

圖4 洗脫緩沖液pH值對(duì)酶活回收率的影響 圖5 CM-瓊脂糖柱層析洗脫圖譜Fig.4 Effect of elution buffer pH on recovery of enzymatic activity Fig.5 Elution diagram of CM-sepharose chromatography

2.6.2 弱酸性陽(yáng)離子CM-瓊脂糖柱層析純化效果

收集過(guò)DEAE-瓊脂糖柱層析后的最大活性峰組分1.33 L過(guò)CM-瓊脂糖柱層析. 洗脫結(jié)果如圖5所示. 其中， 蛋白洗脫峰II-1中檢測(cè)到極少的酶活力和很高的蛋白含量， 說(shuō)明雜蛋白居多； 蛋白洗脫峰II-2檢測(cè)到很高的酶活力和極少的蛋白含量， 說(shuō)明II-2中的酶純度高. 而蛋白洗脫峰II-1和酶活力峰I-2基本吻合， 說(shuō)明該峰就是含β-葡萄糖苷酶的洗脫峰.

2.7 β-葡萄糖苷酶的中試純化效果

β-葡萄糖苷酶的具體純化效果如表4所示. 經(jīng)上述純化步驟后， 從鮑魚內(nèi)臟分離純化得到純度較高的β-葡萄糖苷酶， 純化倍數(shù)10.78倍， 收率5.0%， 酶的比活力為1.709 U·mg-1. 高速管式離心的收率較高， 但獲得的粗酶液很渾濁， 效果不如高速冷凍離心， 這就是中試規(guī)模和實(shí)驗(yàn)室的規(guī)模的差異， 也是中試規(guī)模提取β-葡萄糖苷酶的難度所在.采用陶瓷復(fù)合膜過(guò)濾能將未被分離的微小顆粒截留， 但在整個(gè)純化步驟中， 該步驟的酶活損失最嚴(yán)重， 應(yīng)盡量減少過(guò)濾時(shí)間， 收集濃液留至下次繼續(xù)分離純化或者加水稀釋濃液盡量將酶透過(guò)膜. 超濾能使酶液濃縮脫鹽以便于上層析柱， 與透析相比其回收率較低. 而DEAE-瓊脂糖柱層析和CM-瓊脂糖柱層析純化效果皆與實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的效果差不多.

表4 β-葡萄糖苷酶的純化效果Tab.4 Summary of purification of β-glucosidase from abalone viscera

3 結(jié)論

采用膠體磨勻漿、 高速管式離心、 陶瓷復(fù)合膜過(guò)濾、 超濾、 DEAE-瓊脂糖陰離子交換層析和CM-瓊脂糖陽(yáng)離子交換層析的中試制備工藝， 從鮑魚內(nèi)臟中分離純化得到一種β-葡萄糖苷酶. 進(jìn)行柱層析純化時(shí)， DEAE-瓊脂糖陰離子交換層析洗脫緩沖液的最佳pH值為7.5， CM-瓊脂糖陽(yáng)離子交換層析洗脫緩沖液的最佳pH值為6.0. 經(jīng)以上純化步驟后， 純化倍數(shù)為10.78， 收率為5.0%， 酶比活力為1.709 U·mg-1. 該工藝的純化倍數(shù)和收率與文獻(xiàn)[11]相比，其數(shù)值不夠高， 并未達(dá)到最優(yōu)效果， 仍然具有提高的空間， 將在后續(xù)研究中加以改進(jìn).

β-葡萄糖苷酶作為纖維素降解的限速酶及合成多種糖苷的關(guān)鍵酶有很高的工業(yè)價(jià)值. 而鮑魚內(nèi)臟作為鮑魚加工的下腳料， 可利用其開發(fā)飼料、 調(diào)味料等， 同時(shí)可對(duì)其所含的消化酶及多糖等進(jìn)行生產(chǎn)開發(fā)， 因此具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值. 探索出一套純化倍數(shù)高、 酶活損失率低的適合工業(yè)化的β-葡萄糖苷酶分離純化方法, 可為鮑魚內(nèi)臟綜合利用提供參考作用.

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Studyonthepilot-plantscalepreparationofβ-glucosidasefromabaloneviscera

CHEN Shengnan1, ZHANG Li1, SHI Xian’ai1, 2, CHEN Jinmei1, CAI Zhenhui1

(1. College of Biological Science and Technology, Fuzhou University, Fuzhou, Fujian 350116, China;2. Fujian Key Laboratory of Medical Instrument and Pharmaceutical Technology, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Theβ-glucosidase fromabalonevisceralwas separated, purified through a pilot scale technique combination including homogenation in colloid mill, centrifugation in high speed tubular centrifuge, filtration upon ceramic composite membrane, ultrafiltration, anion-exchange chromatography of DEAE-agarose and cation-exchange chromatography of CM-agarose. It was demonstrated that the total enzyme activity in the homogenate was 12 174.21 U and the specific activity was 0.158 U·mg-1as well as the specific activity of crude enzyme in the supernatant obtained by 2 times of high speed tubular centrifugation was 0.247 U·mg-1. It was demonstrated that the specific activity of permeate from ceramic composite membrane filtration and concentrate from ultrafiltration were 0.133 U·mg-1and 0.249 U·mg-1, respectively. Through the study on the elution pH gradient in anion exchange chromatography of DEAE- agarose and cation exchange chromatography of CM- agarose, it was also demonstrated that the best elution pH was about 7.5 and 6.0. The specific activities ofβ-glucosidase collected from anion-exchange chromatography of DEAE-agarose and cation-exchange chromatography of CM-agarose were 0.492 U·mg-1and 1.709 U·mg-1, respectively, with a final purification fold was 10.78, and the yield was 5.0%.

abaloneviscera；β-glucosidase； pilot scale； purification

10.7631/issn.1000-2243.2017.05.0731

1000-2243(2017)05-0731-05

Q814.1

A

2016-03-08

石賢愛(1971-)， 教授， 主要從事海洋生物活性物質(zhì)及生物檢測(cè)等研究， shixa@fzu.edu.cn

國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)子課題(201205022-3)

(責(zé)任編輯： 林曉)