TRPC3參與α-突觸核蛋白引起的線粒體損傷

盧勇泉 陳 敏 高 歌 段春禮 魯玲玲 楊 慧

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京腦重大疾病研究院帕金森病研究所，教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京 100069)

·Alpha-突觸核蛋白的致病機制·

TRPC3參與α-突觸核蛋白引起的線粒體損傷

盧勇泉 陳 敏 高 歌 段春禮 魯玲玲 楊 慧*

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京腦重大疾病研究院帕金森病研究所，教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京 100069)

目的探討經(jīng)典型瞬時受體電位通道3(transient receptor potential canonical channel 3,TRPC3)是否參與α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)引起的線粒體損傷。方法在α-syn過表達原代培養(yǎng)神經(jīng)元、α-syn轉(zhuǎn)基因及敲除小鼠模型，利用免疫印跡和免疫熒光技術(shù)檢測TRPC3和α-syn在線粒體內(nèi)的定位和表達；在原代培養(yǎng)神經(jīng)元，運用MTT和乳酸脫氫酶法檢測細胞活力和受損情況，JC-1法檢測線粒體膜電勢，觀察敲減TRPC3對α-syn過表達引起的線粒體損傷和細胞損傷的影響。結(jié)果TRPC3和α-syn共同表達于線粒體，過表達α-syn增加TRPC3在線粒體的分布，敲除α-syn則下調(diào)TRPC3在線粒體的分布。敲減TRPC3明顯減輕過表達α-syn引起的線粒體膜電勢下降和細胞毒性。結(jié)論TRPC3可能參與過表達α-syn引起的線粒體損傷。

帕金森?。簧窠?jīng)元；α-突觸核蛋白；瞬時受體電位通道3；線粒體

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的主要病理特征為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進行性變性缺失以及殘存的多巴胺能神經(jīng)元中路易體(Lewy bodies,LB)的形成。LB的重要組成成分是α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)[1-2]。α-syn在神經(jīng)元內(nèi)異常積聚和聚集可以增加細胞膜的通透性，損傷蛋白酶體和溶酶體系統(tǒng)及造成線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡[3-7]。本課題組的前期研究結(jié)果[8-12]表明，過表達α-syn可以引起神經(jīng)元內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成增加，線粒體膜孔異常開放以及膜電勢降低，但其機制尚不完全清楚。

經(jīng)典型瞬時受體電位(transient receptor potential canonical,TRPC)通道是一類非選擇性鈣離子通道，該家族包含7個成員[13]。TRPC通道主要分布于胞質(zhì)及質(zhì)膜，維持細胞內(nèi)的鈣離子穩(wěn)態(tài)[14]。研究[15-16]表明，TRPC家族的成員通過影響細胞鈣離子的穩(wěn)態(tài)參與包含PD在內(nèi)的神經(jīng)疾病。TRPC3是TRPC家族唯一定位于線粒體上的亞型，參與調(diào)控線粒體鈣攝取和膜電勢[17]。TRPC3是否參與過表達α-syn引起的線粒體膜電勢改變，進而導(dǎo)致線粒體功能紊亂尚不清楚。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗動物：實驗動物均由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供服務(wù)，動物許可證號為SYXK(京)2015-0012。3只孕14 d SD大鼠從北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司引進，4只Thy-1-hα-syn轉(zhuǎn)基因小鼠從美國Jackson laboratory公司引進，4只α-syn敲除小鼠從南京大學(xué)模式動物研究所引進。倫理編號:AEEI-2014-111和AEEI-2015-177。

原代神經(jīng)元培養(yǎng)試劑：神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基A、50×B27 添加劑、0.5 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 U/mL 鏈霉素、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均購自美國Gibco公司，多聚-L-賴氨酸(poly-L-lysine，PLL)購自美國Sigma公司。

抗體：抗人源α-syn(human α-syn,hα-syn)抗體(3D5，1∶5 000)由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院于順教授惠贈，TRPC3(1∶500)購自美國Sigma公司，α-syn(1∶1 000)購自美國BD公司，β-actin(1∶2 000)購自美國Sigma公司，COX 4(1∶1 000)購自美國CST公司，Tom20 (1∶250)購自美國Santa Cruz公司。

LV-sh-TRPC3(5′-CCACCAAAGCGCAGCAGTA-3′)和LV-hα-syn購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，線粒體提取試劑盒購自美國Inventbiotech公司，5，5′，6，6′-四氯-1，1′，3，3′-甲基苯并咪唑氫碘化物(tetrechloro-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide,JC-1)購自美國Sigma公司，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[(3-4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)購自美國Sigma公司，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒購自瑞士Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 原代神經(jīng)元培養(yǎng)及慢病毒感染

分離出胎鼠大腦皮質(zhì)，置于盛有6%(質(zhì)量分數(shù))葡萄糖的PBS小皿中，剪碎后用0.125%(質(zhì)量分數(shù))的胰蛋白酶，37 ℃水浴消化10 min。加入含有10%(體積分數(shù))FBS的普通細胞培養(yǎng)基終止消化，離心1 000 g，5 min。棄上清，加入普通細胞培養(yǎng)基，重懸細胞，用40 μm的細胞濾篩進行過濾后按密度4×104個/cm2接種至多聚-L-賴氨酸預(yù)處理的培養(yǎng)皿，在37 ℃，5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待神經(jīng)元貼壁后改為Neurobasal-A培養(yǎng)。72 h后加入慢病毒，感染48 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 Western blotting分析TRPC3和α-syn的表達

收集慢病毒感染的原代神經(jīng)元、α-syn轉(zhuǎn)基因和敲除小鼠及其同窩對照小鼠的中腦，運用細胞組分提取試劑盒提取線粒體、胞質(zhì)組分及全細胞蛋白。采用5%(質(zhì)量分數(shù))積層膠70 V，30 min；12%(質(zhì)量分數(shù))SDS-PAGE分離膠120 V，1 h進行凝膠電泳分離蛋白，用半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂牛奶封閉1 h。分別孵育相應(yīng)的抗體后，放入Odyssey掃描成像系統(tǒng)(LI-COR公司，美國)中成像。

1.2.3 細胞免疫熒光化學(xué)法檢測TRPC3和α-syn在線粒體上的定位

4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛室溫固定原代神經(jīng)元后，用1%(體積分數(shù))PBST孵育10 min，5%(體積分數(shù))山羊血清室溫孵育1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜；用PBST清洗3次，后加入相應(yīng)源性的二抗室溫孵育1 h；于共聚焦顯微鏡下拍照分析。

1.2.4 MTT法檢測細胞活力

將皮質(zhì)原代神經(jīng)元種植于96孔板，按照實驗分組進行慢病毒感染。感染48 h后，向各孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL，37 ℃，5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。后吸棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL DMSO，避光振蕩10 min，置于酶標(biāo)儀中讀取490 nm波長處的吸光度值。

1.2.5 LDH釋放法檢測細胞損傷

將皮質(zhì)原代神經(jīng)元種植于96孔板中，待神經(jīng)元貼壁生長良好后，換上新的培養(yǎng)液。慢病毒感染48 h后，將細胞上清按每孔100 μL小心轉(zhuǎn)移到新的96孔板中，并對應(yīng)加入100 μL反應(yīng)混合液，室溫孵育30 min，終止反應(yīng)后，將96孔板置于酶標(biāo)儀中讀取490 nm波長處的吸光度值。

1.2.6 線粒體膜電勢檢測

將皮質(zhì)原代神經(jīng)元種植于96孔板，慢病毒感染48 h后，將JC-1染色液按終濃度10μg/mL加入各孔中，于37 ℃，5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)10 min。吸棄染色液，用Neurobasal-A培養(yǎng)基洗滌細胞后。用激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長580 nm觀察紅色熒光；激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長520 nm觀察綠色熒光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 α-syn和TRPC3共表達于線粒體上

在LV-hα-syn感染的SD大鼠皮質(zhì)原代神經(jīng)元中，用細胞免疫熒光技術(shù)分別標(biāo)記線粒體和TRPC3。結(jié)果顯示，α-syn和TRPC3廣泛表達于線粒體(圖1A)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，在提取的線粒體蛋白中可以檢測到TRPC3和α-syn(圖1B)。上述結(jié)果提示TRPC3和α-syn共表達于線粒體上。

圖1 TRPC3和α-syn共表達于線粒體Fig.1 Co-expression of TRPC3 and α-syn in mitochondria

A:Images of fluorescent immunocytochemical labeling.TRPC3 (yellow) and α-syn(green) signals,LV-hα-syn were merged on the mitochondrial marker(Tom20,red).scale bar=10 μm;Mergers were 4 times magnified.B: Representative Western blotting for TRPC3 and α-syn.Proteins were extracted from primary cortical neuron infected by LV-h α-syn for 48 hours.LV: lentivirus;GFP: green fluorescent protein;hα-syn: human α-synuclein;TRPC3:transient receptor potential canonical 3;COX4:cytochrome C oxidase subunit Ⅳ.

2.2 過表達α-syn增加線粒體TRPC3水平

取α-syn轉(zhuǎn)基因和α-syn敲除小鼠及其同窩對照小鼠的中腦。Western blotting檢測線粒體及胞質(zhì)內(nèi)α-syn及TRPC3的表達，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因組α-syn較對照組顯著升高2.5倍，敲除組無表達(P<0.01,n=4)；在全細胞和胞質(zhì)組分，TRPC3在轉(zhuǎn)基因組與野生型和敲除組的表達比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，n=4)；但在線粒體組分中，轉(zhuǎn)基因組TRPC3的表達較對照組顯著升高約1.4倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，n=4)，詳見圖2。以上結(jié)果提示，線粒體中TRPC3隨α-syn的升高而增加。

2.3 敲減TRPC3減輕α-syn的細胞毒性

LV-sh-TRPC3和LV-hα-syn感染SD大鼠皮質(zhì)原代神經(jīng)元48 h后，提取細胞蛋白。Western blotting檢測TRPC3的表達，結(jié)果顯示：LV-sh-TRPC3感染組中TRPC3的表達明顯下降，提示在過表達α-syn的細胞中成功敲減TRPC3(圖3A)。MTT及LDH的檢測結(jié)果顯示，LV-hα-syn組細胞活力下降40%，LDH活性顯著升高25%；共感染LV-sh-TRPC3和LV-hα-syn組的細胞活力較LV-hα-syn組顯著升高20%，并LDH活性顯著下降10%與對照組和LV-hα-syn組比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3B)。以上結(jié)果提示，抑制TRPC3能減輕過表達α-syn所致的細胞毒性。

2.4 敲減TRPC3減輕α-syn引起的線粒體膜電勢降低

LV-sh-TRPC3和LV-hα-syn感染SD大鼠皮質(zhì)原代神經(jīng)元48 h后，應(yīng)用JC-1檢測線粒體膜電勢。結(jié)果顯示，LV-hα-syn組線粒體的膜電勢下降明顯，而LV-sh-TRPC3和LV-hα-syn共感染組線粒體的膜電勢降低的程度明顯低于LV-hα-syn組(紅色熒光與綠色熒光比值升高)，與對照組和LV-hα-syn組比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果提示，敲減TRPC3能減輕過表達α-syn引起的線粒體膜電勢降低。詳見圖4。

3 討論

線粒體功能紊亂在PD的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。本研究顯示，α-syn和TRPC3可以共表達于線粒體，且線粒體TRPC3隨α-syn增加而增加，其機制可能與α-syn通過某些途徑提高細胞中磷脂酶C活性有關(guān)；此外，由于α-syn具有分子伴侶特性[18]，TRPC3可能與之發(fā)生直接相互作用而共同進入線粒體。TRPC3主要存在于線粒體內(nèi)膜上，是維持正常線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的組成部分，α-syn異常表達導(dǎo)致MMP下降，而抑制TRPC3的表達能有效恢復(fù)MMP，表明TRPC3參與α-syn積聚引起的線粒體功能障礙。以往研究[11,19]表明，α-syn可以通過和線粒體相關(guān)蛋白相互作用使其膜電勢下降，如電壓依賴性離子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)和腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運體(adenine nucleotide translocator,ANT)。雖然本研究不能排除VDAC和ANT參與的膜電勢降低，但本研究的結(jié)果提示α-syn也可能通過調(diào)控TRPC3導(dǎo)致線粒體膜電勢下降和功能障礙。TRPC3不依賴于線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)節(jié)線粒體的Ca2+攝入，其在線粒體表達增加，導(dǎo)致線粒體Ca2+攝入大量增加致鈣穩(wěn)態(tài)失衡；MMP的下降引起線粒體的通透性發(fā)生變化，各種凋亡因子從線粒體釋放到細胞質(zhì)中，表現(xiàn)為細胞活力顯著降低。抑制TRPC3表達能有效反轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象，提示TRPC3參與α-syn所致細胞活力下降。

圖2 TRPC3和α-syn的表達分布Fig.2 Distribution of TRPC3 and α-syn

圖3 細胞活力和LDH釋放檢測Fig.3 Cell viability and LDH release assay

圖4 線粒體膜電勢檢測Fig.4 Mitochondrial membrane potential assay

A: Images for primary cortical neurons were infected by LV-hα-syn and LV-sh-TRPC3 for 48 hours and probed by JC-1.B: Statistical data for JC-1red/green fluorescence ratios.scale bar=100 μm;*P<0.05vsvector,#P<0.05vsLV-hα-syn;n=4 in each group;LV: lentivirus;hα-syn: human α-synuclein;sh: short hairpin RNA;TRPC3:transient receptor potential canonical 3.

本研究為腦老化及PD腦的退行性改變中α-syn所致的線粒體功能障礙提供新的研究線索和實驗依據(jù)。

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TRPC3participatesinα-synuclein-inducedmitochondrialdamage

Lu Yongquan,Chen Min,Gao Ge,Duan Chunli,Lu Lingling,Yang Hui*

(DepartmentofNeurobiology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,CenterforParkinson’sDisease,BeijingInstituteforBrainDisorders,KeyLaboratoryforNeurodegenerativeDiseaseoftheMinistryofEducation,Beijing100069,China)

ObjectiveTo investigate the role of transient receptor potential canonical channel 3 (TRPC3)in the mitochondrial damage induced by aberrant α-synuclein (α-syn) accumulation.MethodsExpressions of TRPC3 and α-syn in mitochondria were detected by Western blotting and immunofluorescence in α-syn-overexpressing primary neurons and α-syn transgenic and knock-out mice.The detection of mitochondrial membrane potential(MMP) by JC-1 showed mitochondrial damage and the detection of cell viability used MTT and lactated dehydrogenase(LDH) release assays in α-syn-overexpression primary neurons which TRPC3 was knocked down.ResultsTRPC3 and α-syn co-expressed in mitochondria.Neurons overexpressing α-syn increased mitochondrial TRPC3 expression and decreased MMP and cell viability.Suppressing TRPC3 expression partially reversed the α-syn-induced reductions in MMP and cell viability.ConclusionMitochondrial TRPC3 may participate in α-syn-induced mitochondrial damage.

Parkinson’s disease;neuron； α-synuclein;transient receptor potential canonical channel 3 (TRPC3);mitochondria

國家重點研究發(fā)展計劃(2016YFC1306002)，國家自然科學(xué)基金(81371398,81371200)，北京市自然科學(xué)基金(7131001)，北京市創(chuàng)新團隊建設(shè)提升計劃(IDHT20140514)，北京市教育委員會科技發(fā)展計劃一般項目(KM201710025001)。This study was supported by National Key Research and Development Plan of China (2016YFC1306002),National Natural Science Foundation of China (81371398,81371200),Natural Science Foundation of Beijing (7131001),Project of Construction of Innovative Teams and Teacher Career Development for Universities and Colleges Under Beijing Municipality (IDHT20140514),Scientific Research Common Program of Beijing Municipal Commission of Education (KM201710025001).

*Corresponding author，E-mail：huiyang@ccmu.edu.cn

時間：2017-12-13 21∶25

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2125.042.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.016]

Q189

2017-10-23)

編輯 孫超淵