多指標-正交試驗優(yōu)化沙棘葉和沙棘籽中黃酮的提取工藝Δ

惠人杰，馮靜，藺默含，馮柏年，2#（.江南大學藥學院，江蘇無錫2422；2.江蘇艾凡生物醫(yī)藥有限公司，江蘇無錫2422）

多指標-正交試驗優(yōu)化沙棘葉和沙棘籽中黃酮的提取工藝Δ

惠人杰1＊，馮靜1，藺默含1，馮柏年1，2#（1.江南大學藥學院，江蘇無錫214122；2.江蘇艾凡生物醫(yī)藥有限公司，江蘇無錫214122）

目的：優(yōu)化沙棘葉和沙棘籽中黃酮的提取工藝。方法：以6種黃酮苷元即兒茶素、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素的提取率總和為指標，以乙醇體積分數、提取時間、提取次數、料液比為考察因素，采用L9（34）表設計正交試驗，分別優(yōu)化沙棘葉和沙棘籽中黃酮的提取工藝，并進行驗證試驗。結果：沙棘葉中黃酮的最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分數70%、提取3次、每次提取2.0 h、料液比1∶16；沙棘籽中黃酮的最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分數50%、提取3次、每次提取1.5 h、料液比1∶24；驗證試驗中，沙棘葉和沙棘籽中6種黃酮苷元的提取率總和分別為56.4、15.4 mg/g（RSD分別為1.4%、3.4%，n＝3）。結論：優(yōu)化后的提取工藝方法簡便、穩(wěn)定、可行，可用于沙棘葉和沙棘籽中黃酮成分的提取。

沙棘葉；沙棘籽；正交試驗；提取工藝；黃酮苷元

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）為胡頹子科酸刺屬的灌木或小喬木，別名醋柳[1]，具有多種營養(yǎng)保健作用，可作為營養(yǎng)食品、藥物和護膚品[2]。沙棘黃酮是沙棘中的重要活性物質，具有抗心肌缺血[3]、降糖[4]、抗腫瘤[5]、抗菌[6]、消炎[7]等作用。自1977年起，沙棘便被列入了《中國藥典》，此后在歷版藥典中均有記載[8]。除了被廣泛關注的沙棘果之外，沙棘葉、沙棘籽等沙棘的其他部位也富含多種黃酮成分，具有相當高的藥用價值[9]。深入開發(fā)沙棘葉和沙棘籽的經濟價值，尤其是其藥用價值，需要對沙棘的藥用成分進行更為精準有效的提取分析。在現有的沙棘黃酮提取工藝研究中，多以總黃酮為單一考察指標對提取方法的效率進行評價，不僅缺乏針對單一黃酮成分的分析及提取工藝研究，也缺乏針對不同提取部位的工藝優(yōu)化。本研究以沙棘葉和沙棘籽為樣本，以沙棘中6種主要黃酮苷元的提取率總和為指標，設計正交試驗，優(yōu)化其活性成分的提取工藝。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；ACM-L超細粉碎機（青島微納粉體機械有限公司）；DZF-08真空干燥箱（上海博泰實驗設備有限公司）；DT-200B電子天平（常熟市佳衡天平儀器有限公司）；HH-4數顯恒溫水浴鍋（上海豫康科教儀器設備有限公司）；BSA124S精密電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；LyoQuest-85真空凍干機（西班牙泰事達科技有限公司）；RE-52A旋轉蒸發(fā)器（鄭州科泰實驗設備有限公司）；PURIST UV超純水系統(tǒng)（上海樂楓生物科技有限公司）。

1.2 藥材、對照品與試劑

沙棘葉、沙棘籽（新疆金之源生物科技有限責任公司，采摘日期為2016年4月，鑒定人為無錫市藥品安全檢驗檢測中心副主任中藥師金卓）；兒茶素（批號：H1603040，純度：＞98%）、楊梅素（批號：L1623059，純度：＞98%）、山柰酚（批號：B1704013，純度：＞98%）、異鼠李素（批號：K1624002，純度：＞98%）對照品均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；槲皮素（批號：LI40Q05，純度：＞98%）、蘆丁（批號：LTC0Q20，純度：＞98%）對照品均購自百靈威科技有限公司；乙醇、石油醚、磷酸、鹽酸均為分析純，甲酸、甲醇均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 沙棘黃酮醇提物制備

沙棘葉、沙棘籽去雜后，經粉碎機粉碎后烘干，以料液比1∶8（g/mL）加入石油醚，70℃加熱回流2 h，過濾后棄濾液，剩余濾渣揮干石油醚，得脫脂脫水沙棘葉、沙棘籽樣品。精密稱定10 g樣品，以50%乙醇回流提取1 h，回收乙醇，干燥至無醇味，殘留物凍干至呈粉末狀。

2.26 種黃酮苷元含量測定及方法學驗證

2.2.1 供試品溶液制備精密稱取“2.1”項沙棘黃酮粉末50 mg，加入20 mL甲醇，混合均勻后加入20 mL 25%鹽酸溶液，以氮氣保護，90℃下加熱回流1 h，待溶液冷卻至室溫后，過濾。將續(xù)濾液轉移至50 mL量瓶中，搖勻，用甲醇定容至刻度，即得供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液制備分別精密稱取兒茶素、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素對照品各5.0 mg，混合均勻后，用甲醇逐級稀釋，以鹽酸調節(jié)pH至2.5，得質量濃度分別為0.23、0.47、0.94、1.88、3.75、7.50、15.00、30.00 μg/mL的系列混合對照品溶液。

2.2.3 色譜條件色譜柱：Shimadzu C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（含0.4%磷酸）（60∶40，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40℃；檢測波長：208 nm；進樣量：20 μL。取對照品及樣品（正交試驗號1）溶液進樣分析，結果理論板數以6種成分計均大于1 500，峰1～4的分離度均大于2，峰5～6分離度約為1.5，系統(tǒng)適用性良好。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1HPLC chromatograms

2.2.4 線性關系及定量限考察取系列質量濃度的混合對照品溶液進樣檢測，建立各黃酮苷元的標準工作曲線，以溶液中各黃酮苷元的質量濃度為橫坐標（x）、以相應的黃酮苷元的峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程分別為兒茶素：y＝128 086x+101 987（R2＝0.999 6）；蘆?。簓＝13 553x+27 405（R2＝0.999 6）；楊梅素：y＝32 713x－2 733.8（R2＝0.999 9）；槲皮素：y＝37 503x－9 514.1（R2＝0.999 4）；山柰酚：y＝38 039x－5 124.4（R2＝0.999 7）；異鼠李素：y＝38 376x－3 240.2（R2＝0.999 8）。結果表明，6種黃酮苷元檢測質量濃度線性范圍均為0.234～30.0 μg/mL，定量限均為0.234 μg/mL。

2.2.5 精密度、穩(wěn)定性、重復性、準確度試驗按照相關試驗要求，進行方法學驗證。結果表明，精密度試驗中，6種黃酮苷元峰面積RSD值均小于1.77%（n＝6）；穩(wěn)定性試驗中（12 h內），6種黃酮苷元峰面積RSD值均小于1.51%（n＝6）；重復性試驗中，6種黃酮苷元峰面積RSD值均小于1.83%（n＝6）；準確度試驗中，6種黃酮苷元的加樣回收率均為99.69%～106.81%（RSD＝3.59%，n＝6）。

2.3 正交試驗優(yōu)化黃酮提取工藝

2.3.1 正交試驗設計參考前期沙棘葉黃酮提取單因素試驗結果[10]，選擇乙醇體積分數（A）、提取時間（B）、提取次數（C）、料液比（D）為考察因素，以6種黃酮苷元的提取率總和為綜合考察指標，采用L9（34）表設計正交試驗[11]，對提取工藝進行考察。各黃酮苷元的提取率＝各黃酮苷元量/沙棘原料質量×100%。6種黃酮苷元的提取率總和即為各黃酮苷元提取率之和。

因素與水平見表1。

表1 因素與水平Tab 1Factors and levels

2.3.2 沙棘葉正交試驗結果與分析按照L9（34）提取正交試驗設計，沙棘葉提取試驗安排及方差分析結果見表2、表3。

表2 沙棘葉正交試驗設計與結果Tab 2Orthogonal test design and results of leaves of H.rhamnoides

表3 沙棘葉正交試驗結果的方差分析Tab 3Variance analysis in orthogonal test results of leaves of H.rhamnoides

由表2直觀分析可知，A因素中各水平影響大小順序為A3＞A1＞A2，B因素中各水平影響大小順序為B3＞B1＞B2，C因素中各水平影響大小順序為C3＞C2＞C1，D因素中各水平影響大小順序為D2＞D3＞D1，各因素對提取工藝影響大小順序為A＞B＞C＞D，最優(yōu)工藝條件為A3B3C3D2。方差分析結果顯示，各因素均有極顯著影響（P＜0.01），其中A因素影響最大，D因素的影響最小。綜合考慮，最終確定沙棘葉中黃酮最優(yōu)提取工藝條件為乙醇體積分數70%、提取3次、每次提取2.0 h、料液比1∶16。

2.3.3 沙棘籽正交試驗結果與分析依據“2.3.2”項下相同方法，對沙棘籽中的黃酮提取條件進行優(yōu)化，試驗設計與方差分析結果見表4、表5。

表5 沙棘籽正交試驗結果的方差分析Tab 5Variance analysis in orthogonal test results of seeds of H.rhamnoides

由表4直觀分析可知，A因素中各水平影響大小順序為A1＞A3＞A2，B因素中各水平影響大小順序為B2＞B3＞B1，C因素中各水平影響大小順序為C3＞C2＞C1，D因素中各水平影響大小順序為D3＞D1＞D2，各因素對提取工藝影響大小為C＞D＞A＞B，最優(yōu)工藝條件為A1B2C3D3。方差分析表結果顯示，C因素對結果有極顯著影響（P＜0.01），A、D因素對結果也有顯著影響（P＜0.05），B因素對結果無顯著影響。綜合考慮，最終確定沙棘籽中黃酮最優(yōu)提取工藝條件為乙醇體積分數50%、提取3次、每次提取1.5 h、料液比1∶24。

2.4 驗證試驗

取同批沙棘葉和沙棘籽粉末各3份，每份100 g，以正交試驗所得優(yōu)化條件進行工藝驗證試驗，結果見表6。

表6 沙棘葉和沙棘籽中黃酮提取工藝驗證試驗（n＝3）Tab6Verificationtestoftheextraction technology for flavonoids in leaves and seeds of H.rhamnoides（n＝3）

表6結果顯示，沙棘葉中兒茶素、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素的提取率分別約為19.1、14.2、15.3、2.9、2.3、2.6 mg/g，提取率總和約為56.4 mg/g；沙棘籽中6種黃酮苷元的提取率分別約為9.1、5.0、0.2、0.5、0.3、0.3 mg/g，提取率總和約為15.4 mg/g。驗證結果提示，優(yōu)化后的提取工藝結果穩(wěn)定、可靠。

3 討論

現有的黃酮提取技術中，多以紫外分光光度法測定所得總黃酮的含量結果為檢驗標準，無法鑒別具體的黃酮種類及其含量，因此無法對提取工藝和過程進行精確質控。而筆者通過研究發(fā)現，采用高效液相色譜法，可對沙棘葉和沙棘籽中的6種黃酮苷元進行快速分離和精確分析，可實現對提取物中黃酮種類和含量的全面分析。另外再結合正交試驗，利用建立的6種黃酮苷元的含量測定方法得到的含量結果，可篩選合適的提取條件，使得6種黃酮成分均能同時并最大化被提取出來，兼顧了不同指標的綜合效應，實現了提取工藝的整體優(yōu)化。本試驗結果表明，采用優(yōu)化后的提取工藝，沙棘葉和沙棘籽中的黃酮成分提取效果明顯：沙棘葉6種黃酮苷元的提取率總和高達56.4 mg/g，沙棘籽達到15.4 mg/g，均高于文獻[10，12-14]報道的水平。因此，本試驗結果為沙棘黃酮的工業(yè)化提取提供了新的方法參考。

從本試驗結果也可以看出，沙棘葉及沙棘籽中的黃酮含量差異明顯。沙棘葉中的黃酮苷元以兒茶素、楊梅素、蘆丁為主，同時槲皮素、山柰酚、異鼠李素也有一定的含量，因此適當提高醇提液中乙醇的比例、延長提取時間，可兼顧6種黃酮類成分，獲得最優(yōu)提取效果。而沙棘籽中黃酮含量較低，且以水溶性好的兒茶素和蘆丁為主，水溶性較差的其他黃酮總占比不足1%，因此適當調高醇提液中的水分比例，可提高水溶性黃酮的提取率，獲得最優(yōu)提取效果。綜上，采用各黃酮成分組成的多指標對藥材中的黃酮進行提取，可依據藥材中所含黃酮的種類和特性及時調整提取條件，與只以總黃酮為考察指標的工藝相比，可獲得更優(yōu)的提取效果。

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Optimization of Extraction Technology for Flavonoids in Leaves and Seeds of Hippophae rhamnoides by Multiindex-Orthogonal Test

HUI Renjie1，FENG Jing1，LIN Mohan1，FENG Bainian1，2（1.School of Pharmacy，Jiangnan University，Jiangsu Wuxi 214122，China；2.Jiangsu Alpha Biopharmaceuticals Co.Ltd.，Jiangsu Wuxi 214122，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology for flavonoids in leaves and seeds of Hippophae rhamnoides.METHODS：Using the total extraction rate of 6 flavonoid aglycones（catechins，rutin，myricetin，quercetin，kaempferol，isorhamnetin）as index，ethanol volume fraction，extraction time，extraction times，material-lipid ratio as investigation indexes，L9（34）orthogonal test was designed to optimize the extraction technology of flavonoids in leaves and seeds of H.rhamnoides，and verification test was carried out.RESULTS：The optimum extraction technology for flavonoids in leaves of H.rhamnoides was ethanol volume fraction of 70%，extracting for 3 times with material-lipid ratio of 1∶16，and 2.0 h each time；and that of seeds was ethanol volume fraction of 50%，extracting for 3 times with material-lipid ratio of 1∶24，and 1.5 h each time.In verification test，the total extraction rate of 6 flavonoid aglycones was 56.4 mg/g in the leaves（RSD＝1.4%，n＝3）and 15.4 mg/g in the seeds（RSD＝3.4%，n＝3）.CONCLUSIONS：Optimized extraction technology is simple，stable，feasible，and can be used for extracting the flavonoids in leaves and seeds of H.rhamnoides.

Leaves of Hippophae rhamnoides；Seeds of Hippophae rhamnoides；Orthogonal test；Extraction technology；Flavonoid aglycone

R284.2

A

1001-0408（2017）34-4856-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.27

江蘇省自然科學基金青年基金項目（No.BK20140136）；江蘇高校品牌專業(yè)建設工程資助項目（No.PPZY2015B146）

＊副教授，博士。研究方向：藥物分析。E-mail：huirenjie@jiangnan.edu.cn

#通信作者：教授，博士生導師，博士。研究方向：藥物化學、藥物分析。E-mail：fengbainian@jiangnan.edu.cn

2017-06-21

2017-09-08）

（編輯：劉萍）