腎康注射液對大鼠體內(nèi)厄貝沙坦藥動學的影響

金貞姬，常澤娜，朱震菡，楊長青#（1.延邊大學附屬醫(yī)院藥學部，吉林延吉133000；.中國藥科大學基礎醫(yī)學與臨床藥學學院，南京11198）

腎康注射液對大鼠體內(nèi)厄貝沙坦藥動學的影響

金貞姬1＊，常澤娜2，朱震菡2，楊長青2#（1.延邊大學附屬醫(yī)院藥學部，吉林延吉133000；2.中國藥科大學基礎醫(yī)學與臨床藥學學院，南京211198）

目的：研究腎康注射液對大鼠體內(nèi)厄貝沙坦藥動學的影響。方法：取18只SD大鼠隨機分為對照組（生理鹽水）和腎康注射液組（以生藥量計為4 g/kg），每組9只，每天ip給藥2次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥1 h后，兩組大鼠均ig厄貝沙坦25 mg/kg，分別于厄貝沙坦給藥前及給藥后0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、32、48、56、72、96 h經(jīng)眼底靜脈叢采血0.3 mL。以聯(lián)苯雙酯為內(nèi)標，采用高效液相色譜法測定大鼠血漿中厄貝沙坦的血藥濃度，利用Phoenix WinNolin?6.1藥動學軟件中非房室模型擬合并計算藥動學參數(shù)。結(jié)果：對照組和腎康注射液組大鼠ig厄貝沙坦后，AUC0-96h分別為（28.82±10.49）、（35.64±9.99）mg·h/L，cmax分別為（0.64±0.15）、（0.76±0.33）mg/L，tmax分別為（13.07±16.70）、（10.23±3.97）h，CLZ/F分別為（0.85±0.35）、（0.63±0.21）L/（h·kg），VZ/F分別為（38.24±24.87）、（30.99±9.75）mL/kg，組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論：腎康注射液在正常給藥劑量下不影響厄貝沙坦在大鼠體內(nèi)的藥動學過程。

腎康注射液；厄貝沙坦；藥動學；大鼠

厄貝沙坦是血管緊張素Ⅱ受體抑制藥，臨床上常用于原發(fā)性高血壓以及2型糖尿病腎病合并高血壓的治療[1-2]。厄貝沙坦在人體內(nèi)主要經(jīng)肝細胞色素P4502C9酶（CYP2C9）代謝[3]，原型藥及代謝物經(jīng)膽汁和腎排泄。腎康注射液是由大黃、丹參、黃芪、紅花等4味中藥組成的中藥注射劑，適用于慢性腎衰竭各個階段的治療，呈現(xiàn)出良好的安全性和有效性[4]，臨床上常與厄貝沙坦聯(lián)合用于治療早期糖尿病腎病[5]。但是，目前尚無腎康注射液對厄貝沙坦體內(nèi)藥動學有無影響的研究報道。鑒于此，本研究主要考察腎康注射液對大鼠體內(nèi)厄貝沙坦藥動學的影響，為厄貝沙坦和腎康注射液的臨床合理聯(lián)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010AHT高效液相色譜（HPLC）儀，配備LC-20AT四元高壓泵、在線脫氣機、SPRING（228-46460-02自動進樣器、SPD-20A紫外檢測器和Shimadzu Lab Solutions LC Solution工作站，購自日本Shimadzu公司；TGL-18M臺式高速冷凍離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

厄貝沙坦對照品（批號：100607-201202，純度：99%）、聯(lián)苯雙酯對照品（內(nèi)標，批號：100192-200503，純度：99%）購自中國食品藥品檢定研究院；腎康注射液（西安世紀盛康藥業(yè)有限公司，批號：20150521，規(guī)格：20 mL/支）；厄貝沙坦片（揚子江藥業(yè)集團北京海燕藥業(yè)有限公司，批號：15083011，規(guī)格：75 mg/片）；乙腈和甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

18只清潔級SD大鼠，♂，體質(zhì)量200～220 g，購于上海杰思捷實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2008-0016。購入后大鼠分籠飼養(yǎng)[動物房溫度為（25±2）℃]，飼養(yǎng)期間喂以標準鼠糧，自由攝食和飲水，并在進行藥動學實驗前12 h禁食。本研究獲得中國藥科大學動物倫理委員會批準，并嚴格按照動物護理和處理規(guī)范操作。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液取厄貝沙坦對照品適量，用甲醇溶液制備成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的貯備液，置于4℃冰箱中，備用。臨用時精密吸取上述貯備液適量，稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、1.6、3.2、8、16 μg/mL的系列對照品溶液。

2.1.2 內(nèi)標溶液取內(nèi)標聯(lián)苯雙酯對照品適量，用甲醇溶液制備成質(zhì)量濃度為8 μg/mL的內(nèi)標溶液。

2.2 血漿樣品的處理

取50 μL血漿至1.5 mL離心管中，加入內(nèi)標溶液50 μL（8 μg/mL），再加入100 μL甲醇，渦旋混合2 min，在4℃下以10 000×g離心10 min，取上清液進樣分析。

2.3 色譜條件

色譜條件是在文獻[6]的基礎上進行優(yōu)化后得出。色譜柱：Galaksil EF-C18H（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（含0.1%三氟乙酸）（55∶45，V/V）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：245 nm；柱溫：35℃；進樣量：10 μL。

2.4 專屬性與系統(tǒng)適用性試驗

取大鼠空白血漿樣品、空白血漿+內(nèi)標樣品、ig厄貝沙坦之前血漿樣品以及ig厄貝沙坦12 h后血漿樣品+內(nèi)標，分別按“2.2”項下方法處理后，按“2.3”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物均不干擾厄貝沙坦和內(nèi)標的測定，厄貝沙坦與內(nèi)標的色譜峰分離良好，分離度均大于1.5，保留時間分別為9.35、13.91 min，以各自的色譜峰計理論板數(shù)均大于3 000，表明該分析方法具有良好的專屬性。色譜圖見圖1。

2.5 標椎曲線的繪制

取厄貝沙坦的0.4、0.8、1.6、3.2、8、16 μg/mL系列對照品溶液，用空白血漿制備終質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、2.0、4.0 μg/mL的系列血漿標準溶液，按“2.2”項下方法處理后，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以厄貝沙坦的質(zhì)量濃度為橫坐標（x，μg/mL）、厄貝沙坦與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程為y＝0.390 16x－2.49×10－3（r＝0.999 0）。結(jié)果表明，厄貝沙坦在0.1～4.0 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，定量下限為0.1 μg/mL。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1HPLC chromatograms

2.6 穩(wěn)定性試驗

制備低、中、高質(zhì)量濃度（0.1、2.0、4.0 μg/mL）的厄貝沙坦血漿標準樣品，按“2.2”項下方法處理，分別放置0、6、12 h后按“2.3”項下色譜條件進樣測定，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果，低、中、高質(zhì)量濃度樣品的RSD分別為2.05%、1.98%、2.92%（n＝3），說明處理后樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定，適合自動化進樣檢測。

2.7 檢測限

取標準曲線的最小質(zhì)量濃度（0.1 μg/mL）的血漿樣品，進一步稀釋成0.05、0.025 μg/mL的樣品溶液，按“2.2”項下方法處理后，按“2.3”項下色譜條件進樣測定。每個質(zhì)量濃度樣品溶液連續(xù)測定5次，計算平均值和標準差（SD）。當平均值接近3倍SD時，該質(zhì)量濃度即為最低檢測限。結(jié)果顯示，本分析方法的最低檢測限為0.05 μg/mL（RSD＝4.53%、RE＝7%，n＝5）。

2.8 精密度與準確度試驗

使用空白血漿制備低、中、高質(zhì)量濃度（0.1、2.0、4.0 μg/mL）的厄貝沙坦血漿標準樣品，每個質(zhì)量濃度平行制備3份，按“2.2”項下方法處理后，按“2.3”項下色譜條件進樣測定。同日內(nèi)連續(xù)測定3次，連續(xù)測定3 d，考察日內(nèi)和日間精密度。制備含厄貝沙坦血漿樣品，每一質(zhì)量濃度進行3樣本分析，分別與相應質(zhì)量濃度的厄貝沙坦對照品溶液進行峰面積比較，計算相對回收率。結(jié)果，低、中、高質(zhì)量濃度厄貝沙坦標準樣品日內(nèi)精密度試驗的RSD分別為0.55%、2.38%、0.22%（n＝3），日間精密度試驗的RSD分別為2.41%、1.14%、1.19%（n＝3）；平均相對回收率分別為（98.36±2.92）%、（94.78±2.89）%、（94.21±1.76）%，RSD分別為2.97%、3.05%、1.87%（n＝3），說明該試驗的精密度及準確度均較好。

2.9 大鼠體內(nèi)藥動學研究

取18只SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后稱體質(zhì)量，然后隨機分為對照組（生理鹽水）和腎康注射液組（以生藥量計為4 g/kg，按臨床常用劑量換算所得），ip給予相應藥物，每日2次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥1 h后，兩組大鼠均ig厄貝沙坦混懸液（25 mg/kg，按臨床常用劑量換算所得），分別于厄貝沙坦給藥前（0 h）及給藥后0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、32、48、56、72、96 h經(jīng)眼底靜脈叢采血0.3 mL[6]，分離血漿，采用前述處理及測定方法測得各時間點厄貝沙坦血藥濃度。采用Phoenix WinNonlin?6.1藥動學軟件中的非房室模型擬合并計算藥動學參數(shù)（權(quán)重為1/C2），采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件中的t檢驗比較組間藥動學參數(shù)的差異，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果，大鼠體內(nèi)厄貝沙坦平均藥-時曲線見圖2，主要藥動學參數(shù)計算結(jié)果見表1。

圖2 厄貝沙坦在大鼠體內(nèi)的平均藥-時曲線（n＝9）Fig2Meanplasmaconcentration-timecurvesof irbesartan in rats in vivo（n＝9）

表1 兩組大鼠主要藥動學參數(shù)（±s，n＝9）Tab 2The main pharmacokinetic parameters of rats in 2 groups（±s，n＝9）

表1 兩組大鼠主要藥動學參數(shù)（±s，n＝9）Tab 2The main pharmacokinetic parameters of rats in 2 groups（±s，n＝9）

藥動學參數(shù)AUC0-96h，mg·h/L CLZ/F，L/（h·kg）VZ/F，mL/kg t1/2，h tmax，h cmax，mg/L對照組28.82±10.49 0.85±0.35 38.24±24.87 31.36±14.73 13.07±16.70 0.64±0.15腎康注射液組35.64±9.99 0.63±0.21 30.99±9.75 37.82±21.53 10.23±3.97 0.76±0.33

表1結(jié)果顯示，與對照組比較，腎康注射液組大鼠體內(nèi)厄貝沙坦的AUC0-∞、cmax、tmax、CLZ/F和VZ/F等藥動學參數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示腎康注射液不影響厄貝沙坦的體內(nèi)藥動學過程。

3 討論

體外研究結(jié)果表明，腎康注射液的單味中藥或有效成分對CYP2C9酶活性具有不同程度的抑制作用，即丹參水溶性總提取物、丹參的有效成分（丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮和二氫丹參酮）、大黃提取物及大黃素等對CYP2C9酶具有中等強度的抑制作用，黃芪甲苷也可顯著抑制CYP2C9酶活性[7-12]。體內(nèi)研究結(jié)果顯示，丹參水溶性總提取物在大鼠體內(nèi)抑制CYP2C9底物華法林的代謝[13]；黃芪注射液在正常大鼠和糖尿病大鼠體內(nèi)抑制CPY2C9的活性，降低CPY2C9底物格列美脲的清除率[14]。從這些單味中藥或中藥有效成分的體內(nèi)外研究結(jié)果推測，腎康注射液可抑制厄貝沙坦的體內(nèi)代謝。然而，本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，腎康注射液組大鼠體內(nèi)厄貝沙坦的AUC0-96h、tmax、cmax、VZ/F、t1/2和CLZ/F等藥動學參數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明在臨床治療劑量下腎康注射液不影響CYP2C9酶的活性，不影響厄貝沙坦的體內(nèi)過程。另外，本研究中對照組中tmax的標準差大于均值，是因為2只大鼠的tmax異常大（分別為48.00、30.02 h），其具體原因有待進一步探討。

[1]Croom KF，Curran MP，Goa KL，et al.Irbesartan：a review of its use in hypertension and in themanagementofdiabeticnephropathy[J].Drugs，2004，64（9）：999-1028.

[2]吳立華，梁輯.依那普利葉酸片聯(lián)合腎康注射液治療高血壓腎病的臨床觀察[J].中國藥房，2015，26（36）：5099-5101.

[3]Choi CI，Kim MJ，Chung EK，et al.CYP2C9 3 and 13 alleles significantly affect the pharmacokinetics of irbesartan in healthy Korean subjects[J].Eur J Clin Pharmacol，2012，68（2）：149-154.

[4]Wu X，Guan Y，Yan J，et al.Shenkang injection suppresseskidneyfibrosisandoxidative stress via transforming growth factor-β/Smad3 signalling pathway in vivo and in vitro[J].J Pharm Pharmacol，2015，67（8）：1054-1065.

[5]郝玉杰，徐雅鵬，王運紅，等.腎康注射液聯(lián)合厄貝沙坦對63例早期糖尿病腎病患者的療效分析[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2011，17（3）：337-338.

[6]Bae SK，Kim MJ，Shim EJ，et al.HPLC determination of irbesartan in human plasma：its applicationtopharmacokineticstudies[J].Biomed Chromatogr，2009，23（6）：568-572.

[7]葉娜，羅紅麗，李容，等.丹參注射液對大鼠肝微粒體CYP450亞型酶體外抑制作用[J].中成藥，2015，37（5）：948-953.

[8]Hasegawa A，Kawaguchi Y，Nakasa H，et al.Effects of Kampo extracts on drug metabolism in rat liver microsomes：Rhei Rhizoma extract and Glycyrrhizae Radix extract inhibit drug oxidation[J].Jpn J Pharmacol，2002，89（2）：164-170.

[9]單文雅，張玉峰，朱捷強，等.黃芪甲苷對大鼠肝微粒體酶活性影響[J].中國中藥雜志，2012，37（1）：85-88.

[10]Wang X，Cheung CM，Lee WY，et al.Major tanshinones of Danshen（Salvia miltiorrhiza）exhibit different modes of inhibition on human CYP1A2，CYP2C9，CYP2E1 and CYP3A4 activities in vitro[J].Phytomedicine，2010，17（11）：868-875.

[11]韋炳華，陳孝，宗連柱.復方丹參滴丸對大鼠肝微粒體細胞色素b5含量的影響[J].現(xiàn)代食品與藥品雜志，2006，16（3）：21-23.

[12]王來友，李鏡清，陳濤，等.大黃素的Ⅰ相代謝途徑及其對細胞色素P450酶的抑制作用[J].中國臨床藥理學與治療學，2014，19（3）：241-245.

[13]Lo AC，Chan K，Yeung JH，et al.The effects of Danshen（Salvia miltiorrhiza）on pharmacokinetics and pharmacodynamics of warfarin in rats[J].Eur J Drug Metab Pharmacokinet，1992，17（4）：257-262.

[14]劉曉峰，張帆，王惠成，等.正常大鼠和糖尿病大鼠格列美脲藥動學及黃芪注射液對其的影響[J].中國新藥與臨床雜志，2012，31（4）：227-230.

Effect of Shenkang Injection on the Irbesartan Pharmacokinetics in Rats in vivo

JIN Zhenji1，CHANG Zena2，ZHU Zhenhan2，YANG Changqing2（1.Dept.of Pharmacy，Affiliated Hospital of Yanbian University，Jilin Yanji 133000，China；2.School of Basic Medicine and Clinical Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China）

OBJECTIVE：To study the effect of Shenkang injection on the irbesartan pharmacokinetics in rats in vivo.METHODS：18 SD rats were randomly divided into control group（normal saline）and Shenkang injection（calculated by crude drug as 4 g/kg），9 in each group，which were intraperitoneally injected twice a day，for 7 d.After 1 h of last administration，25 mg/kg irbesartan was intragastrically administrated.0.3 mL sample blood was taken in fundus venous plexus before administration of irbesartan and after 0.25，0.5，1，2，4，8，12，24，32，48，56，72，96 h of administration.Using biphenyl diester as inner standard，HPLC was adopted to determine the plasma concentration of irbesartan in plasma of rats，and pharmacokinetic parameters were calculated by using non-compartmental model in Phoenix WinNolin?6.1 pharmacokinetic software.RESULTS：After intragastrically administrated irbesartan in rats in control group and Shenkang injection group，AUC0-96hwere（28.82±10.49），（35.64±9.99）mg·h/L；cmaxwere（0.64±0.15），（0.76±0.33）mg/L；tmaxwere（13.07±16.70），（10.23±3.97）h；CLZ/Fwere（0.85±0.35），（0.63±0.21）L/（h·kg）；VZ/Fwere（38.24±24.87），（30.99±9.75）mL/kg respectively，with no statistical significances（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Shenkang injection will not affect the in vivo pharmacokinetics process of irbesartan in normal dose on rats.

Shenkang injection；Irbesartan；Pharmacokinetics；Rats

R969.1

A

1001-0408（2017）34-4815-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.16

＊主任藥師。研究方向：臨床藥學。電話：0433-2670822。E-mail：15526770822@163.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：臨床藥學、藥動學。電話：025-86185447。E-mail：ycq0315@yahoo.com

2017-05-03

2017-09-21）

（編輯：林靜）