探討AQP1、AQP3及IL-1β在膝關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達(dá)及意義*

唐 進(jìn)，吉 明，徐立新

重慶三峽中心醫(yī)院骨科(重慶 404000)

探討AQP1、AQP3及IL-1β在膝關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達(dá)及意義*

唐 進(jìn)，吉 明，徐立新

重慶三峽中心醫(yī)院骨科(重慶 404000)

目的：探討水通道蛋白l(AQP1)、水通道蛋白3(AQP3)和白介素-1β(IL-1β)在膝關(guān)節(jié)炎滑膜組織中的表達(dá)意義及與膝關(guān)節(jié)滑膜炎癥的關(guān)系。方法：選取收治的80例膝關(guān)節(jié)炎患者作為研究對(duì)象，采用免疫組織化學(xué)法檢測患者關(guān)節(jié)滑膜阻滯中AQP1、AQP3以及IL-1β的表達(dá)水平，并采用雙盲法測定累積光密度，分析各因子表達(dá)水平之間的相關(guān)性以及臨床意義。結(jié)果：不同病情程度的滑膜炎患者AQP1、AQP3及IL-1β指標(biāo)比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且隨著病情的加重，AQP1、AQP3及IL-1β指標(biāo)均呈上升趨勢；相關(guān)性分析結(jié)果顯示AQP1、AQP3及IL-1β與滑膜炎癥程度分度呈正相關(guān)性(P<0.05)，AQP1表達(dá)與IL-1β表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)，AQP3表達(dá)與IL-1β表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：AQP1、AQP3及IL-1β在滑膜炎的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的應(yīng)用，但其具體的臨床病理機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

膝關(guān)節(jié)炎是一種中老年人群常見的骨關(guān)節(jié)疾病，其滑膜病理表現(xiàn)為炎癥改變，如滑膜血管擴(kuò)張，血漿和細(xì)胞外滲，產(chǎn)生大量滲出液，同時(shí)滑膜細(xì)胞活躍，產(chǎn)生大量粘液素，臨床上呈現(xiàn)出關(guān)節(jié)腫脹及活動(dòng)受限，明顯影響著人們的生活質(zhì)量[1]。近年來針對(duì)水通道蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞膜上的水通道蛋白1(AQP1)、AQP3可能與滑膜炎癥的發(fā)生與發(fā)展具有密切聯(lián)系，白介素-1β(IL-1β)作為常見的炎癥因子，在滑膜炎的發(fā)生與發(fā)展中同樣具有重要作用[2]。本研究通過對(duì)80例膝關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行觀察分析，探討AQP1、AQP3及IL-1β在膝關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達(dá)及意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

1 一般資料 收集重慶三峽中心醫(yī)院病骨關(guān)節(jié)科2015年8月至2016年8月期間膝關(guān)節(jié)滑膜切除標(biāo)本，包括人工膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)及膝關(guān)節(jié)鏡手術(shù)，共80例，男37例，年齡18～73歲，中位年齡53歲。女43例，年齡17～72歲，中位年齡43歲?；そM織標(biāo)本采集需要在術(shù)中應(yīng)用活檢鉗進(jìn)入患者關(guān)節(jié)腔，鉗夾3～5塊髕上囊處的滑膜組織，并將其放入4%多聚甲醛保存液中保存?zhèn)溆?，固定處理后進(jìn)行脫鈣、沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋等操作并進(jìn)行切片處理，將獲取的標(biāo)本應(yīng)用HE染色進(jìn)行處理。

2 方 法

2.1 滑膜炎組織病理學(xué)評(píng)估：首先根據(jù)標(biāo)本滑膜中的定居細(xì)胞群(包括纖維細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)、遷移細(xì)胞群(淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞)和內(nèi)膜細(xì)胞群進(jìn)行病情病理評(píng)估，并建立間質(zhì)細(xì)胞激活、炎癥細(xì)胞浸潤以及內(nèi)膜細(xì)胞增生3種炎癥特征，依次分為0分(正常)、1分(輕度)、2分(中度)和3分(重度)，匯總3種病情程度的參數(shù)，其中0～1分表示正常組織，且炎癥級(jí)別為0級(jí)；總分2～3分可診斷為輕度滑膜炎，炎癥級(jí)別為1級(jí)；總分4～6分診斷為中度滑膜炎，炎癥級(jí)別為2級(jí)；7～9分診斷為重度滑膜炎，炎癥級(jí)別為3級(jí)。

2.2 免疫組織化學(xué)染色：采用免疫組織化學(xué)染色法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行處理，相關(guān)指標(biāo)的檢測采用SABC法處理，組織切片厚度為4μm，將切片后的組織標(biāo)本平鋪于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，考片過夜并脫蠟至水。3%過氧化氫沖洗10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗3次×5 min，復(fù)合酶37 ℃修復(fù)10 min。分別滴加一抗AQP1、AQP3和IL-1β抗體，37 ℃孵育l h，PBS沖洗3次，滴加增強(qiáng)劑，37 ℃孵育20 min．PBS沖洗3次，滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色，沖洗，復(fù)染，脫水．透明，封片。用已知AQP1、AQP3及IL-1β陽性的滑膜組織作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。AQP1、AQP3兔抗人多克隆抗體及IL-1β兔抗人多克隆抗體為北京博奧森生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

2.3 結(jié)果判定：采用雙盲法對(duì)胞質(zhì)及胞膜上出現(xiàn)的棕色、棕黃色染色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(視為陽性細(xì)胞)，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野并利用IPP軟件進(jìn)行圖像分析，測定每一個(gè)視野下累積光密度(D)，D=平均光密度(average density)*面積(area)。然后取5個(gè)高倍視野的D平均值，通過D的大小來反映組織各種抗原表達(dá)的高低。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 組織病理學(xué)觀察 可見膝關(guān)節(jié)滑膜呈不同程度增生：包括滑膜臟層細(xì)胞增生，滑膜組織內(nèi)新生毛細(xì)血管，并且有淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤，部分有中性粒細(xì)胞浸潤和纖維索性壞死。

2 AQP1、AQP3及IL-1β的表達(dá)效果分析 不同病情程度的滑膜炎患者AQP1、AQP3及IL-1β指標(biāo)比較顯著差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且隨著病情的加重，AQP1、AQP3及IL-1β指標(biāo)均呈上升趨勢，見表1。

3 AQP1、AQP3及IL-1β與滑膜炎癥程度的關(guān)系 AQP1、AQP3及IL-1β與滑膜炎癥程度分度呈正相關(guān)性(r=0.991、0.998、0.997，P<0.05)；AQP1陽性表達(dá)與IL-1β呈正相關(guān)(r0級(jí)=0.962，r1級(jí)=0.8389，r2級(jí)=0.972，r3級(jí)=0.9474，P<0.05)，AQP3與IL-1β陽性表達(dá)呈正相關(guān)(r0級(jí)=0.876，r1級(jí)=0.8469，r2級(jí)=0.920，r3級(jí)=0.9413，P<0.05)。

表1 不同炎癥程度滑膜組織中AQP1、AQP3及IL-1β指標(biāo)表達(dá)情況

討 論

由于關(guān)節(jié)腔內(nèi)的大部分細(xì)胞生化反應(yīng)均在液體環(huán)境下進(jìn)行，而細(xì)胞外的雙磷脂細(xì)胞膜成分導(dǎo)致水、離子等極性分子不能順利透過這層細(xì)胞膜[3]，而極性分子的跨膜運(yùn)動(dòng)則主要依賴細(xì)胞膜上AQPs實(shí)現(xiàn)[4]。當(dāng)發(fā)生關(guān)節(jié)病變時(shí)，關(guān)節(jié)內(nèi)的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)遭到破壞，軟骨細(xì)胞內(nèi)外滲透壓環(huán)境改變，誘導(dǎo)AQPs重新分布、活性增強(qiáng)，表達(dá)上調(diào)，增加細(xì)胞膜水通透性促進(jìn)病變發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞吸水腫脹，最終破裂、死亡。軟骨磨損顆粒和降解物質(zhì)進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，刺激A型滑膜細(xì)胞分泌炎性因子，加重滑膜增生腫脹，負(fù)責(zé)分泌滑液的B型細(xì)胞異常增殖，導(dǎo)致滑膜 AQPs 過度表達(dá)，滑液分泌能力增強(qiáng)，關(guān)節(jié)積液增多，引起關(guān)節(jié)水腫[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，AQP1、AQP3在膝關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達(dá)隨著滑膜炎癥程度加重而增強(qiáng)，表明關(guān)節(jié)滑膜 AQP1、AQP3異常表達(dá)在關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，提示其在滑膜中的表達(dá)隨著滑膜炎癥病情發(fā)展而逐漸增高[6]。本組研究也發(fā)現(xiàn)AQP1、AQP3的陽性表達(dá)與IL-lβ陽性表達(dá)呈正相關(guān)，提示AQP1、AQP3和IL-lβ在促滑膜炎癥的過程中可能有某種協(xié)同作用。

綜上所述，關(guān)節(jié)炎中AQP1、AQP3以及IL-lβ因子的表達(dá)較正常健康關(guān)節(jié)組織中明顯升高，而在進(jìn)一步的研究中可將關(guān)節(jié)炎的診斷和治療靶點(diǎn)轉(zhuǎn)移到AQPs及炎癥介質(zhì)上，可通過構(gòu)想導(dǎo)入更多的抑制滑膜炎癥的細(xì)胞因子或藥物達(dá)到更高效的協(xié)同作用，如白介素-1β受體拮抗劑、AQP1拮抗劑、AQP3拮抗劑等，能夠促進(jìn)病變關(guān)節(jié)過度表達(dá)AQPs，并促使其重新恢復(fù)到正常水平，則該部位水代謝也會(huì)逐漸趨近于動(dòng)態(tài)平衡，從而有效地抑制關(guān)節(jié)炎進(jìn)一步發(fā)展。

[1] 劉振杰, 張丹丹, 李 濤,等. RNAi下調(diào)MMP-14表達(dá)對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞炎癥因子分泌的影響[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2015, 36(15):2342-2345.

[2] 侯亞平. 膝骨關(guān)節(jié)炎患者滑液中炎癥因子的表達(dá)及其與中醫(yī)證型的相關(guān)性分析[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 34(4):29-31.

[3] 黃淑婷, 徐建華, 丁長海. 炎癥細(xì)胞因子及力學(xué)因素在膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變中的作用[J]. 安徽醫(yī)學(xué), 2013, 34(9):1417-1419.

[4] 呂 嘉, 向 川, 衛(wèi)小春,等. 血管內(nèi)皮生長因子及水通道蛋白1與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜血管生成的相關(guān)性分析[J]. 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志, 2012, 16(3):200-202.

[5] 唐 進(jìn), 黃良庫, 彭李華, 等. 低頻脈沖超聲干預(yù)膝骨關(guān)節(jié)炎模型兔關(guān)節(jié)軟骨及滑膜水通道蛋白 3 的表達(dá)[J]. 中國組織工程研究, 2011, 15(11): 1941-1944.

[6] 尤笑迎. 降鈣素對(duì)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡及NO含量的影響[J]. 陜西醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 41(3):289-291.

InvestigatetheexpressionandsignificanceofAQP1,AQP3andIL-1betainsynovialarthritisoftheknee

Tang Jin，Ji Ming，Xu Lixin.

Department of Orthopedics, Chongqing Three Gorges Central Hospital (Chongqing 404000)

Objective: To investigate the water channel protein L (AQP1), aquaporin 3 (AQP3) and interleukin -1 (IL-1) expression in synovium of knee osteoarthritis in the knee joint synovitis and relationship with disease. Methods: 80 cases of knee osteoarthritis were selected as the research object, using immunohistochemical method to detect AQP1 in patients with synovial block. Results:Synovitis in patients with AQP1, AQP3 and IL-1 beta index is a significant difference (P<0.05), and with the aggravation of the disease, AQP1, AQP3 and IL-1 increased beta index; correlation analysis showed that AQP1, AQP3 and IL-1 beta and the degree of synovitis of indexing was positively correlated (r=0.991,0.998,0.997P<0.05). Conclusion: AQP1, AQP3 and IL-1 play an important role in the occurrence and development of synovitis, but the specific clinical and pathological mechanisms still need further study.

Osteoarthritis, knee Synovitis Interleukin-1beta Aquaporin 1 Aquaporin 3

*重慶市萬州區(qū)科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目(201503021 )

骨關(guān)節(jié)炎, 膝 滑膜炎 白細(xì)胞介素-1β 水通道蛋白 1 水通道蛋白3

R684.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.12.057

(收稿：2017-11-05)