二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽免疫相關(guān)酶活力的影響

程雨卉，蔣經(jīng)偉，董 穎，高 杉，陳 仲，周遵春

( 1. 大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023； 2. 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 大連 116023 )

二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽免疫相關(guān)酶活力的影響

程雨卉1，蔣經(jīng)偉2，董 穎2，高 杉2，陳 仲2，周遵春2

( 1. 大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023； 2. 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 大連 116023 )

二價(jià)金屬離子在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物免疫相關(guān)酶的活力調(diào)控中發(fā)揮重要作用。為了解二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽免疫相關(guān)酶活力的影響，采用生化方法研究了8種二價(jià)金屬離子在體外不同濃度下對(duì)光棘球海膽體腔液中酸/堿性磷酸酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶、酚氧化酶和髓過(guò)氧化物酶活力的影響。結(jié)果顯示，Cu2+可明顯增強(qiáng)堿性磷酸酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶的活力；Mn2+對(duì)酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶和髓過(guò)氧化物酶有強(qiáng)烈的激活作用；Zn2+對(duì)超氧化物歧化酶和酚氧化酶有強(qiáng)烈的抑制作用；Fe2+抑制過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活力；Ca2+對(duì)酸性磷酸酶和髓過(guò)氧化物酶有抑制作用；Mg2+對(duì)堿性磷酸酶有抑制作用；Cd2+對(duì)超氧化物歧化酶和酚氧化酶有抑制作用；Pb2+對(duì)過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶有抑制作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，適宜濃度的Mn2+和Cu2+對(duì)光棘球海膽的非特異性免疫系統(tǒng)可能有促進(jìn)作用，而Fe2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Pb2+和Cd2+可能會(huì)削弱光棘球海膽的免疫應(yīng)答能力。

光棘球海膽；體腔液；二價(jià)金屬離子；免疫相關(guān)酶

棘皮動(dòng)物體腔液中含有多種與免疫相關(guān)的酶，這些酶通過(guò)酶促反應(yīng)參與機(jī)體的多種免疫應(yīng)答過(guò)程[1-3]。迄今為止，在棘皮動(dòng)物體腔液中已發(fā)現(xiàn)的免疫相關(guān)酶包括酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶、酚氧化酶和髓過(guò)氧化物酶等[4-5]。這些酶在無(wú)脊椎動(dòng)物的非特異性免疫系統(tǒng)中承擔(dān)不同的免疫功能。例如，酸性磷酸酶/堿性磷酸酶對(duì)病原磷酸基團(tuán)的水解作用可以修飾或更改病原表面的分子結(jié)構(gòu)，從而加速免疫細(xì)胞對(duì)病原的吞噬作用甚至直接殺傷病原[6]。過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶能夠清除機(jī)體免疫應(yīng)答和抗應(yīng)激等生理過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量活性氧(如O2-等)，減少活性氧對(duì)機(jī)體自身的傷害[7-8]。酚氧化酶可催化酚類底物生成對(duì)應(yīng)的醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)再通過(guò)系列的非酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為黑色素，黑色素對(duì)病原有凝集作用，而非酶促反應(yīng)中的一些中間代謝產(chǎn)物對(duì)部分病原有顯著的殺傷抑制作用和促進(jìn)吞噬作用[9]。髓過(guò)氧化物酶通過(guò)催化氯化物生成強(qiáng)效的殺菌物質(zhì)―次氯酸從而廣泛參與病原菌的氧化殺傷過(guò)程[7]。免疫相關(guān)酶在對(duì)底物的催化反應(yīng)中通常需要金屬離子的輔助參與，因此免疫相關(guān)酶的活力對(duì)二價(jià)金屬離子非常敏感。例如，在棘皮動(dòng)物中，Mg2+的濃度為1～30 mmol/L時(shí)，可增強(qiáng)仿刺參(Apostichopusjaponicus)堿性磷酸酶的活力[10-11]，Cu2+(CuSO4·5H2O)質(zhì)量濃度為0.05 mg/L時(shí)抑制中間球海膽(Strongylocentrotusintermdius)超氧化物歧化酶的活力[12]。在甲殼動(dòng)物中，Hg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Mg2+、Cd2+和Ni2+在濃度為0.1～0.5 mmol/L時(shí)，對(duì)長(zhǎng)毛明對(duì)蝦(Fenneropenaeuspencinillatus)酸性磷酸酶活力有顯著抑制作用，并且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性[13]，Cu2+、Zn2+和Ca2+濃度為10 mmol/L時(shí)，強(qiáng)烈抑制日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)超氧化物歧化酶的活力[14]。Mg2+、Ca2+和Zn2+濃度為5 mmol/L時(shí)對(duì)菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)中的酚氧化酶有抑制作用，但對(duì)海灣扇貝(Argopectenirradians)中的酚氧化酶有激活作用，并且金屬離子對(duì)這兩個(gè)物種中酚氧化酶活力的影響呈現(xiàn)非劑量依賴性[15-16]。上述研究也表明，二價(jià)金屬離子對(duì)免疫相關(guān)酶活力的影響具有物種特異性。

光棘球海膽(S.nudus)又稱大連紫海膽，屬于棘皮動(dòng)物門、海膽綱，是中國(guó)北方近海重要的增養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種[17]，其免疫系統(tǒng)易受海洋環(huán)境中各類金屬離子的影響。但迄今為止，二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽體內(nèi)不同免疫因子的影響尚不明確。因此，本研究通過(guò)生化和酶學(xué)手段分析了8種二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽體腔液中6種免疫相關(guān)酶活力的影響，旨在為了解光棘球海膽的免疫機(jī)制和特點(diǎn)積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

體質(zhì)量(23.6±4.4) g的光棘球海膽10只，取自遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院引育種中心，于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7 d后使用。暫養(yǎng)時(shí)水溫17～18 ℃、鹽度29、pH 8.6～8.8。

1.1.2 二價(jià)金屬離子

使用CuSO4、MnCl2、ZnSO4、FeCl2、CaCl2、MgSO4、CdCl2和 Pb(CH3COO)2(上海生工)作為二價(jià)金屬離子Cu2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Mg2+、Cd2+、Pb2+的來(lái)源，用100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 分別配制濃度為5、10、20、30、40、50、60 mmol/L的二價(jià)金屬離子溶液。

1.2 方法

1.2.1 體腔上清液的制備

用滅菌注射器從光棘球海膽(10只)的圍口膜處刺入體腔，抽取體腔液，每只海膽取體腔液2 mL。將10只海膽的體腔液混勻后，離心(4 ℃，3500 r/min，10 min)，取上清液作為體腔上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 二價(jià)金屬離子與體腔上清液的預(yù)孵育

將等體積的體腔上清液分別與等體積的二價(jià)金屬離子溶液混勻，4 ℃，孵育20 min。對(duì)照組中，將二價(jià)金屬離子溶液替換為等體積的100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液。

1.2.3 酸性磷酸酶/堿性磷酸酶活力測(cè)定

酸性磷酸酶/堿性磷酸酶活力測(cè)定采用對(duì)硝基苯磷酸酯法[18]。在2.0 mL 2 mmol/LpNPP溶液(測(cè)定酸性磷酸酶活力時(shí)溶于100 mmol/L NaAc-HAc，pH 4.5；測(cè)定堿性磷酸酶時(shí)溶于50 mmol/L NaCO3-NaHCO3緩沖液，pH 9.5)中加入100 μL待測(cè)樣品，37 ℃孵育30 min，然后加入2.9 mL 100 mmol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，并在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。酶活力定義：反應(yīng)體系中樣品在37 ℃與底物作用30 min產(chǎn)生1 mg對(duì)硝基苯酚為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.4 過(guò)氧化氫酶活力測(cè)定

過(guò)氧化氫酶活力測(cè)定采用過(guò)氧化氫底物法[19]。首先，用磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 7.5)將過(guò)氧化氫溶液(75 mmol/L)調(diào)至A240在0.04～0.06范圍內(nèi)，用作底物溶液。然后取100 μL待測(cè)樣品與2.9 mL底物溶液混勻，立刻在240 nm波長(zhǎng)下連續(xù)測(cè)定吸光值。過(guò)氧化氫酶活力定義：反應(yīng)體系中每秒鐘轉(zhuǎn)化1 μmol 過(guò)氧化氫定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.5 超氧化物歧化酶活力測(cè)定

超氧化物歧化酶活力測(cè)定采用氯化硝基四氮唑藍(lán)法[20]。3 mL反應(yīng)混合液(0.75 mmol/L NBT；13 μmol/L甲硫氨酸；20 μmol/L核黃素；0.1 mmol/L乙二胺四乙酸；50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.8)中加入100 μL待測(cè)樣品，在30 ℃下用4000 lx熒光照射5 min，然后在560 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。超氧化物歧化酶活力定義：每毫升反應(yīng)體系中抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的超氧化物歧化酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.6 酚氧化酶活力測(cè)定

酚氧化酶活力測(cè)定采用多巴絡(luò)合物生成法[21]。100 μL待測(cè)樣品與 2.0 mL左旋多巴溶液(20 mmol/L)混合后，在490 nm波長(zhǎng)下連續(xù)測(cè)定吸光值。酚氧化酶活力定義：A490值每分鐘增加0.001為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.7 髓過(guò)氧化物酶活力測(cè)定

髓過(guò)氧化物酶活力測(cè)定采用四甲基聯(lián)苯胺法[22]。2.9 mL反應(yīng)混合液(1.6 mmol/L四甲基聯(lián)苯胺；0.1 mmol/L 過(guò)氧化氫)中加入100 μL待測(cè)樣品，混勻后立即在650 nm波長(zhǎng)下連續(xù)測(cè)定吸光值。髓過(guò)氧化物酶活力定義：反應(yīng)體系中每分鐘降解1 μmol 過(guò)氧化氫所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

酶活檢測(cè)試驗(yàn)均做4次重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 二價(jià)金屬離子對(duì)酸性磷酸酶活力的影響

Cu2+在濃度為2.5 mmol/L時(shí)抑制酸性磷酸酶活力，在其他測(cè)試濃度下增強(qiáng)酸性磷酸酶活力；Mg2+同樣在濃度為2.5 mmol/L時(shí)抑制酸性磷酸酶活力，但在其他測(cè)試濃度下對(duì)酸性磷酸酶活力無(wú)明顯影響；Mn2+、Zn2+、Fe2+、Cd2+、Pb2+在所選濃度下均對(duì)酸性磷酸酶有明顯激活作用；Ca2+在所選濃度下抑制酸性磷酸酶活力(圖1)。

圖1 二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽體腔液中酸性磷酸酶活力的影響

2.2 二價(jià)金屬離子對(duì)堿性磷酸酶活力的影響

Cu2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+和Cd2+在所選濃度下均對(duì)堿性磷酸酶活力有明顯的激活作用；Mg2+在所有測(cè)試濃度下對(duì)堿性磷酸酶有抑制作用；Pb2+在濃度為2.5 mmol/L、5 mmol/L和10 mmol/L時(shí)抑制堿性磷酸酶活力，而在其他測(cè)試濃度下增強(qiáng)堿性磷酸酶活力(圖2)。

圖2 二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽體腔液中堿性磷酸酶活力的影響

2.3 二價(jià)金屬離子對(duì)過(guò)氧化氫酶活力的影響

Cu2+在所選濃度下對(duì)過(guò)氧化氫酶有強(qiáng)烈的激活作用；Mn2+、Zn2+和Ca2+在所選濃度下對(duì)過(guò)氧化氫酶活力無(wú)明顯影響；Fe2+和Pb2+在測(cè)試濃度下抑制過(guò)氧化氫酶活力；Mg2+在2.5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L時(shí)抑制過(guò)氧化氫酶活力，在5 mmol/L和25 mmol/L時(shí)增強(qiáng)過(guò)氧化氫酶活力，而在20 mmol/L和30 mmol/L時(shí)對(duì)過(guò)氧化氫酶活力無(wú)明顯影響；Cd2+在2.5 mmol/L時(shí)抑制過(guò)氧化氫酶活力，在5 mmol/L和20 mmol/L時(shí)增強(qiáng)過(guò)氧化氫酶活力，在其他測(cè)試濃度下對(duì)過(guò)氧化氫酶活力無(wú)明顯影響(圖3)。

圖3 二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽體腔液中過(guò)氧化氫酶活力的影響

2.4 二價(jià)金屬離子對(duì)超氧化物歧化酶活力的影響

Cu2+、Mn2+和Ca2+在所選濃度下對(duì)超氧化物歧化酶有明顯激活作用；Zn2+、Fe2+、Cd2+和Pb2+對(duì)超氧化物歧化酶活力有強(qiáng)烈抑制作用；Mg2+在2.5 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L時(shí)抑制超氧化物歧化酶活力，在15 mmol/L時(shí)增強(qiáng)超氧化物歧化酶活力，在20 mmol/L、25 mmol/L和30 mmol/L時(shí)對(duì)超氧化物歧化酶活力無(wú)明顯影響(圖4)。

圖4 二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽體腔液中超氧化物歧化酶活力的影響

2.5 二價(jià)金屬離子對(duì)酚氧化酶活力的影響

Cu2+和Fe2+測(cè)試濃度下明顯增強(qiáng)酚氧化酶活力；Zn2+、Cd2+和Pb2+在測(cè)試濃度下抑制酚氧化酶活力；Mn2+和Ca2+在測(cè)試濃度下對(duì)酚氧化酶活力無(wú)明顯影響；Mg2+在20 mmol/L時(shí)對(duì)酚氧化酶活力有抑制作用，在其他測(cè)試濃度下對(duì)酚氧化酶活力無(wú)明顯影響(圖5)。

圖5 二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽體腔液中酚氧化酶活力的影響

2.6 二價(jià)金屬離子對(duì)髓過(guò)氧化物酶活力的影響

Cu2+在2.5 mmol/L時(shí)強(qiáng)烈抑制髓過(guò)氧化物酶活力，在其他測(cè)試濃度下增強(qiáng)髓過(guò)氧化物酶活力；Mn2+、Zn2+、Fe2+、Cd2+和Pb2+在測(cè)試濃度下均對(duì)髓過(guò)氧化物酶有強(qiáng)烈的激活作用；Ca2+在測(cè)試濃度下明顯抑制髓過(guò)氧化物酶活力；Mg2+在2.5 mmol/L時(shí)抑制髓過(guò)氧化物酶活力，在10 mmol/L時(shí)增強(qiáng)髓過(guò)氧化物酶活力，在其他測(cè)試濃度下對(duì)髓過(guò)氧化物酶活力無(wú)明顯影響(圖6)。

圖6 二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽體腔液中髓過(guò)氧化物酶活力的影響

3 討 論

3.1 了解二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽免疫相關(guān)酶活力影響的意義

光棘球海膽缺乏特異性免疫系統(tǒng)，主要依賴體腔液中的各種免疫相關(guān)酶和其他一些活性蛋白來(lái)識(shí)別、抑制、殺傷和清除病原[1-2,4]。已有研究表明，海洋生物體內(nèi)的免疫相關(guān)酶活力受二價(jià)金屬離子影響顯著[13-15]。在光棘球海膽的育苗、養(yǎng)殖過(guò)程中，投喂的餌料、藥物等常含有各種二價(jià)金屬離子，此外，排放到近海的工業(yè)、農(nóng)業(yè)和生活污水中也含有大量的二價(jià)金屬離子[23-24]，因此，了解二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽體腔液中免疫相關(guān)酶活力的影響對(duì)海膽的健康養(yǎng)殖具有重要意義。

3.2 二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽免疫相關(guān)酶活力的非劑量依賴性影響

在仿刺參[10]、海灣扇貝[15]、亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)[25]等無(wú)脊椎動(dòng)物中的研究表明，二價(jià)金屬離子濃度為0～30 mmol/L時(shí)，可相對(duì)完整的反映二價(jià)金屬離子在不同濃度條件下對(duì)免疫相關(guān)酶活力的影響。因此，本研究中二價(jià)金屬離子的濃度為0～30 mmol/L。在本研究中，二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽免疫相關(guān)酶活力的影響與金屬離子濃度相關(guān)，但這種影響在多數(shù)情況下并不是隨著金屬離子的濃度增大而增強(qiáng)，而是呈現(xiàn)出非劑量依賴性，與仿刺參[10]、海灣扇貝[15]、菲律賓蛤仔[16]中的報(bào)道相似。二價(jià)金屬離子影響免疫酶活力的機(jī)制目前尚不明確，有報(bào)道推測(cè)二價(jià)金屬離子是通過(guò)結(jié)合于酶的活性部位來(lái)影響酶的活力[13]，也有研究發(fā)現(xiàn)二價(jià)金屬離子是通過(guò)改變酶的部分肽段的二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)影響酶的活力[25]，然而，這些推論和發(fā)現(xiàn)不能合理解釋本研究和其他研究中報(bào)道的二價(jià)金屬離子對(duì)酶活力的非劑量依賴性影響，金屬離子影響酶活力的機(jī)制仍有待深入研究。

3.3 二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力的影響

在光棘球海膽酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力檢測(cè)試驗(yàn)中，Mn2+、Zn2+、Fe2+、Cd2+對(duì)酸性磷酸酶和堿性磷酸酶均有明顯的激活作用，表明這幾種金屬離子可能會(huì)增強(qiáng)光棘球海膽體內(nèi)基于磷酸酶的抑菌和吞噬等免疫應(yīng)答活動(dòng)。Cu2+除了在2.5 mmol/L時(shí)抑制酸性磷酸酶活力，在其他測(cè)試濃度下可增強(qiáng)光棘球海膽磷酸酶活力，表明適當(dāng)濃度的Cu2+也可能會(huì)增強(qiáng)光棘球海膽磷酸酶系統(tǒng)的應(yīng)答能力。二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽磷酸酶的影響與對(duì)雜色鮑(Haliotisdiversicolor)和長(zhǎng)毛明對(duì)蝦中的結(jié)果差異巨大，而與仿刺參中的結(jié)果差異較小。在長(zhǎng)毛明對(duì)蝦中[13]，Cu2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+均明顯抑制酸性磷酸酶活力，在雜色鮑中[26]，Cu2+、Zn2+、Cd2+強(qiáng)烈抑制堿性磷酸酶活力，而在仿刺參中[10]，Cu2+、Zn2+、Fe2+、Cd2+對(duì)酸性磷酸酶和堿性磷酸酶均有明顯的激活作用，表明不同物種間二價(jià)金屬離子對(duì)磷酸酶活力的影響特性可能與物種親緣關(guān)系相關(guān)。

3.4 二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活力的影響

在過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活力檢測(cè)中，Cu2+可同時(shí)增強(qiáng)光棘球海膽體腔液中過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活力， Mn2+和Ca2+可增強(qiáng)超氧化物歧化酶活力而對(duì)過(guò)氧化氫酶活力無(wú)明顯影響，表明Cu2+、Mn2+和Ca2+對(duì)光棘球海膽的抗氧化保護(hù)系統(tǒng)可能有促進(jìn)作用。Cu2+對(duì)抗氧化系統(tǒng)的促進(jìn)作用在翡翠貽貝(Pernaviridis)[27]和克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[28]中也有報(bào)道，但在日本沼蝦中[14]，Cu2+對(duì)抗氧化系統(tǒng)起抑制作用。Fe2+和Pb2+對(duì)光棘球海膽體腔液中過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活力均有抑制作用，Mg2+和Cd2+在多個(gè)濃度下抑制過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活力，Zn2+對(duì)超氧化物歧化酶活力有抑制作用，表明上述幾種金屬離子可能會(huì)削弱光棘球海膽免疫系統(tǒng)的抗氧化能力。

3.5 二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽酚氧化酶活力的影響

在酚氧化酶活力測(cè)定中，Cu2+和Fe2+對(duì)光棘球海膽體腔液中酚氧化酶有明顯激活作用，Zn2+、Cd2+、Mg2+和Pb2+對(duì)體腔液中酚氧化酶有抑制作用，表明Cu2+和Fe2+可能會(huì)增強(qiáng)光棘球海膽體內(nèi)酚氧化酶誘導(dǎo)的黑化凝集作用、促吞噬包埋作用和氧化殺傷作用，而Zn2+、Cd2+、Mg2+和Pb2+可能是光棘球海膽酚氧化酶應(yīng)答系統(tǒng)的限制因子。無(wú)脊椎動(dòng)物中的酚氧化酶通常為含銅的金屬酶，其對(duì)底物的催化活動(dòng)需要Cu2+的參與[29]。然而，Cu2+對(duì)酚氧化酶活力的影響在不同海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中并不一致。例如，在光棘球海膽，Cu2+對(duì)酚氧化酶有激活作用；在菲律賓蛤仔[16]、日本蟳(Charybdisjaponica)[29]和鋸緣青蟹(Scyllaserrata)[30]中，Cu2+對(duì)酚氧化酶有抑制作用；在海灣扇貝中[15]，Cu2+在低濃度時(shí)增強(qiáng)酚氧化酶活力，而在高濃度時(shí)抑制酚氧化酶活力。因此，無(wú)脊椎動(dòng)物酚氧化酶的催化機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

3.6 二價(jià)金屬離子對(duì)光棘球海膽髓過(guò)氧化物酶活力的影響

在髓過(guò)氧化物酶活力測(cè)定中，Mn2+、Zn2+、Fe2+、Cd2+和Pb2+對(duì)光棘球海膽體腔液中的髓過(guò)氧化物酶有激活作用，而Ca2+明顯抑制髓過(guò)氧化物酶活力，表明Mn2+、Zn2+、Fe2+、Cd2+和Pb2+可能會(huì)增強(qiáng)光棘球海膽髓過(guò)氧化物酶系統(tǒng)的殺菌、抑菌能力，而Ca2+可能會(huì)削弱光棘球海膽髓過(guò)氧化物酶系統(tǒng)的應(yīng)答能力。此外，與酸性磷酸酶測(cè)試中的結(jié)果相似，Cu2+除了在2.5 mmol/L時(shí)抑制髓過(guò)氧化物酶活力，在其他測(cè)試濃度下可增強(qiáng)光棘球海膽磷酸酶活力。本研究結(jié)果表明適當(dāng)濃度的Cu2+對(duì)光棘球海膽髓過(guò)氧化物酶系統(tǒng)可能會(huì)起促進(jìn)作用。

3.7 小 結(jié)

綜上所述可以得知，不同二價(jià)金屬離子對(duì)不同免疫酶活力的影響不同。Mn2+可增強(qiáng)酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶和髓過(guò)氧化物酶的活力，對(duì)過(guò)氧化氫酶和酚氧化酶活力無(wú)明顯影響，表明Mn2+對(duì)提高光棘球海膽的免疫力可能是有益的；Cu2+可增強(qiáng)堿性磷酸酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶的活力，并且在2.5 mmol/L以外的其他測(cè)試濃度下增強(qiáng)酸性磷酸酶和髓過(guò)氧化物酶活力，表明適當(dāng)濃度的Cu2+對(duì)光棘球海膽的免疫力可能也有促進(jìn)作用；Zn2+抑制超氧化物歧化酶和酚氧化酶活力，F(xiàn)e2+抑制過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活力，Ca2+抑制M酚氧化酶活力，Mg2+抑制堿性磷酸酶活力，Cd2+抑制超氧化物歧化酶和酚氧化酶活力，Pb2+抑制過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶活力，表明上述幾種金屬離子可能會(huì)削弱光棘球海膽的免疫應(yīng)答能力。

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EffectsofDivalentMetalIonsonActivitiesofImmune-relatedEnzymesinSeaUrchinStrongylocentrotusnudus

CHENG Yuhui1, JIANG Jingwei2, DONG Ying2, GAO Shan2, CHEN Zhong2, ZHOU Zunchun2

( 1. Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2. Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116023, China )

In order to understand the effects of divalent metal ions on the activities of immune-related enzymes in sea urchinStrongylocentrotusnudus, the coelomic fluid of the sea urchin was incubated with Cu2+, Mn2+, Zn2+, Fe2+, Ca2+, Mg2+, Cd2+and Pb2+at different concentrations, respectively, and then the activities of acid phosphatase (ACP) and alkaline phosphatase (AKP), catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), phenoloxidase (PO) and myeloperoxidase (MPO) in the incubation mixture were determined with biochemical methods. The results showed that Cu2+led to increase the activities of AKP, CAT, SOD and PO; Mn2+enhanced the activities of ACP, AKP, CAT and MPO; Zn2+showed inhibitions on SOD and PO activities; Fe2+inhibited the activities of CAT and SOD; Ca2+inhibited the activities of ACP and MPO; Mg2+showed inhibition on AKP activities; Cd2+inhibited the activities of SOD and PO; Pb2+showed inhibitions on CAT, SOD and PO activities. The results implied that Mn2+and Cu2+promoted the immune-response capacity of the sea urchin at certain concentrations, while Fe2+, Zn2+, Ca2+, Mg2+, Pb2+and Cd2+might be harmful to the innate immune system in the sea urchin.

Strongylocentrotusnudus; coelomic fluid; divalent metal ion; immune-related enzyme

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.01.004

S968.9

A

1003-1111(2017)01-0022-07

2015-12-02；

2016-05-06.

遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015103044)；遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2015018)；遼寧省海洋與漁業(yè)廳項(xiàng)目(201502).

程雨卉(1991-)，女，碩士研究生；研究方向：棘皮動(dòng)物免疫學(xué). E-mail: 1132689854@qq.com. 通訊作者： 周遵春(1967-)，男，研究員；研究方向：海洋生物技術(shù).E-mail：zunchunz@hotmail.com.