伊犁馬GHR基因多態(tài)性及其與泌乳性能的關(guān)聯(lián)分析

孟 吉吉,于農(nóng)淇，高 源，鄔明麗，樊英智，雷初朝，劉武軍，黨瑞華*

（1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100；2.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830052）

伊犁馬GHR基因多態(tài)性及其與泌乳性能的關(guān)聯(lián)分析

孟 吉吉1,于農(nóng)淇1，高 源1，鄔明麗1，樊英智1，雷初朝1，劉武軍2，黨瑞華1*

（1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100；2.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830052）

馬奶具有較高的營養(yǎng)價值，但目前關(guān)于馬泌乳性能方面的研究很少。本實驗對伊犁馬生長激素受體（GHR）基因外顯子和啟動子設計13對引物，以DNA混合池為模板，采用PCR-RFLP法檢測188匹伊犁馬GHR基因多態(tài)基因型，并分析有產(chǎn)奶量記錄的73匹伊犁馬GHR基因多態(tài)性與泌乳性狀之間的關(guān)系。結(jié)果表明：在伊犁馬中檢測到GHR基因啟動子T-562C突變，CC、TC、TT 3種基因型，其基因型頻率分別0.309、0.676、0.016；C為優(yōu)勢等位基因，頻率為0.646，T基因頻率為0.354；雖然各基因型間產(chǎn)奶量并沒有顯著差異（P>0.05），但各基因型的產(chǎn)奶量依次為TT>CC>TC，基因C突變?yōu)門可使產(chǎn)奶量有上升趨勢，研究結(jié)果可為我國乳用馬的選育提供一定的參考。

伊犁馬；生長激素受體基因；泌乳性能；多態(tài)性

生長激素（GH）是一種由腦垂體前葉嗜酸性細胞分泌的單一肽鏈蛋白質(zhì)類激素[1]，本身不能直接穿過細胞膜，必須通過與靶細胞膜表面上的生長激素受體結(jié)合，通過介導將信息傳遞到細胞內(nèi)才能發(fā)揮生理學功能[2]。生長激素受體（GHR）基因結(jié)構(gòu)復雜，其遺傳變異意義重大，很容易造成下游基因表達水平的變化，進而引起生理功能的變化[3]。垂體-GH-GHR軸是泌乳性狀調(diào)控的主要機制之一，此過程相關(guān)基因也很可能參與泌乳等性狀的調(diào)控。

GHR基因在馬21號染色體上，有10個外顯子。Rahmatalla等[4]研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦牛GHR基因在第836位發(fā)生T/A突變，產(chǎn)奶量顯著增加；Blott等[5]的研究也證明了這一觀點。王凱等[6]研究結(jié)果表明，南方荷斯坦奶?；蚨鄳B(tài)性對乳蛋白率有顯著影響，但對產(chǎn)奶量影響不顯著，邱崢艷等[7]的研究也證明了這一點。還有許多研究表明，GHR可能是影響泌乳性狀的候選基因。

馬奶具有很高的營養(yǎng)價值，與人乳相近，并且易消化吸收[8]。我國地方品種馬產(chǎn)奶量較低，且不能穩(wěn)定遺傳。目前，畜禽育種已進入分子選育時代，但關(guān)于馬泌乳性能的分子標記研究少有報道。本研究采用DNA混合池、PCR-RFLP等技術(shù)對伊犁馬GHR基因進行多態(tài)檢測并揭示其是否與產(chǎn)奶量相關(guān)。這也是首次對伊犁馬GHR基因進行相關(guān)研究，對我國馬奶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 在新疆伊犁昭蘇馬場選擇188匹母馬為研究對象。選取年齡約為5～6歲、胎次3～4胎，放牧、飼養(yǎng)和管理條件相同的73匹伊犁馬，記錄其日產(chǎn)奶量。

1.2 引物設計與合成 根據(jù)馬GHR基因的相關(guān)序列（GenBank號：NC_009164），利用NCBI Primer Designing Tool 設計13對引物，擴增伊犁馬GHR基因目的序列，引物送上海生工生物工程有限公司合成（表1）。

1.3 血樣采集 對188匹伊犁馬成年母馬采用枸櫞酸鈉抗凝管對其進行頸靜脈采血，裝于真空采血管中，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因組DNA的提取 采用酚-氯仿法提取血液中的基因組DNA，并用1%瓊脂糖電泳和紫外分光光度計檢測DNA的純度，-20℃冷凍保存。

1.5 DNA池PCR擴增 利用構(gòu)建的DNA池進行PCR 反應。PCR 反應體系為 12.5 μL：Mix 6.25 μL，上游和下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 4.25 μL。

PCR反應條件：95℃預變性4 min，95℃變性30 s；退火45 s（退火溫度見表1）。72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃再延伸10 min；4℃保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行檢測。

1.6 直接測序及BLAST檢測 選取條帶分明、無雜帶、產(chǎn)量高的PCR產(chǎn)物送西安擎科有限公司測序。測序完成后利用SeqMan程序校正測序結(jié)果并分析有無 SNPs。

1.7 PCR-RFLP分析 根據(jù)基因序列，選用限制酶HinfI來進行酶切分型，酶切反應體系為15 μL，包括 PCR 產(chǎn)物 5 μL，ddH2O 8.7 μL，限制酶 0.3 μL，限制酶緩沖液1 μL，在37℃恒溫條件下酶切10 h。

1.8 統(tǒng)計分析 整理匯總酶切分型結(jié)果，進行基因頻率計算，根據(jù)結(jié)果進行Hardy—Weinberg平衡適合性檢驗并計算多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度和有效等位基因數(shù)（Ne），并用SPSS20.0軟件進行產(chǎn)奶量與基因型的關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果 使用1%瓊脂糖凝膠電泳擴增出的PCR產(chǎn)物特異性強、產(chǎn)量高、無拖尾現(xiàn)象（如圖1），可以送樣測序并用于RFLP檢測。

表1 伊犁馬GHR基因引物序列及擴增區(qū)域

圖1 GHR基因引物擴增結(jié)果

2.2 PCR產(chǎn)物序列分析 選取特異性強、產(chǎn)量高的PCR產(chǎn)物送西安擎科公司進行測序，并對測序結(jié)果用DNAStar軟件的SeqMan程序進行分析。分析發(fā)現(xiàn)，在GHR基因外顯子上沒有發(fā)現(xiàn)突變，而在啟動子區(qū)上檢測到了1個SNP位點（T-562C）（圖2）。

圖2 GHR基因SNP測序檢測結(jié)果

2.3 PCR-RFLP分型 分析結(jié)果表明（圖3），在伊犁馬GHR基因啟動子第-562 bp處檢測到2種等位基因C和T，3種基因型，分別命名為CC、CT和TT。

對不同基因型個體的PCR產(chǎn)物測序后結(jié)果表明，CC型基因序列與GenBank（GenBank號：NC_009164）上一致，將其定義為野生型，而TT型定義為突變型。

圖3 GHR基因擴增產(chǎn)物酶切分型

2.4GHR基因啟動子的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 進行遺傳參數(shù)的SNPs位點統(tǒng)計（表2），3種基因型的分布表現(xiàn)為TC>CC>TT，其頻率分別為0.676、0.309、0.016，C為優(yōu)勢等位基因頻率為0.646，T基因頻率為0.354。對其進行卡方適合性檢驗后發(fā)現(xiàn)該基因不處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，可能由于樣本量太少所致。另外，其多態(tài)信息含量（PIC）為0.352 7，屬于中度多態(tài)。雜合度為0.457，純合度為0.543，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.842 3。

2.5GHR基因啟動子多態(tài)性與產(chǎn)奶量關(guān)聯(lián)分析 對73只伊犁馬的產(chǎn)奶量按不同基因型兩兩比較進行t檢驗，結(jié)果表明T-562C位點各種基因型之間差異不顯著（P>0.05），但等位基因C突變?yōu)門后產(chǎn)奶量有上升的趨勢（表3）。

表3 伊犁馬GHR不同基因型與日平均產(chǎn)奶量的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

本研究以 188頭伊犁馬為實驗樣本，對GHR基因進行了多態(tài)調(diào)查，在啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)多態(tài)，群體遺傳學分析顯示此位點處于哈代-溫伯格平衡、中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）。此突變位點存在3種基因型，且堿基T對C的替換對產(chǎn)奶量有一定的提升作用，這可能是由于該突變影響了GHR基因的轉(zhuǎn)錄。群體不處于哈代-溫伯格平衡可能是由于實驗樣本數(shù)量偏少，或者本伊犁馬群由于人工選擇使帶有T等位基因的個體被保留下來。另外本實驗發(fā)現(xiàn)該位點處于中度多態(tài)，遺傳變異較大，這表明GHR基因此多態(tài)位點有可能用于伊犁馬的選育。目前，GHR基因在許多報道上都被證明為泌乳性狀的候選基因，如馬彥男等[9]驗證GHR基因F279Y位點突變對中國荷斯坦牛泌乳性狀的影響的結(jié)果顯示，該位點突變AA型305 d產(chǎn)奶量顯著高于AT型。馬妍等[10]對 1 145頭中國荷斯坦牛GHR基因F279Y位點進行多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn)，對于產(chǎn)奶量和乳脂率，TT與AT基因型之間差異顯著。孫瑞萍等[11]采用PCR-SSCP技術(shù)檢測西農(nóng)莎能奶山羊發(fā)現(xiàn)，在exon9上檢測到了NN型和NT型2種基因型，在241 bp處發(fā)生了G→T的突變，并且在某些胎次的產(chǎn)奶量NN和NT基因型產(chǎn)奶量差異顯著。而郭曉飛等[12]采用PIRA-PCR和RFLP法的研究也驗證了上述研究的結(jié)論。不過也有許多研究發(fā)現(xiàn)，GHR基因多態(tài)性與產(chǎn)奶量并沒有顯著相關(guān)，而只與乳脂率、乳蛋白率等泌乳性狀有顯著相關(guān)；王麗娟等[13]的研究也印證了這一觀點。目前，國內(nèi)外對馬GHR基因的研究比較少，尤其對GHR基因與泌乳性狀的關(guān)聯(lián)研究更是空白。

表2 伊犁馬GHR基因型頻率、有效等位基因數(shù)、雜合度、多態(tài)信息含量

泌乳性狀作為一個數(shù)量性狀，它的表現(xiàn)不僅受基因的影響，還有環(huán)境作用。而產(chǎn)奶量是一個遺傳力極低的性狀，常規(guī)的選育并不能使其大幅度提高，現(xiàn)如今分子遺傳學的發(fā)展使得開展標記輔助選擇更加便捷，而目前最重要的工作就是找到影響產(chǎn)奶量性狀的候選基因。目前，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)了大量存在于外顯子和內(nèi)含子中的變異，而這些突變也為標記輔助選擇（MAS）提供了參考，但關(guān)于馬泌乳性能的有效標記還沒有發(fā)現(xiàn)，這也需要進行大量研究來尋找。

4 結(jié) 果

本實驗首次對伊犁馬GHR基因的啟動子區(qū)和外顯子區(qū)進行了SNPs檢測，檢測結(jié)果表明啟動子區(qū)（T-562C）存在多態(tài)并且可以分為CC、CT、TT 3種基因型，雖然各基因型間產(chǎn)奶量差異不顯著，但各基因型產(chǎn)奶量依次為TT>CC>TC，表明該突變與產(chǎn)奶量有一定的相關(guān)，可為我國乳用馬的選育提供一定參考，但由于實驗樣本數(shù)量較少，還需要大量實驗來證明。

[1]袁媛, 李蘇宜. 生長激素相關(guān)腫瘤生物學效應的研究進展[J]. 腸外與腸內(nèi)營養(yǎng), 2010, (5):313-315.

[2] 陳寶定, 李琦華, 李麗紅, 等. 生長激素與生長激素受體基因的表達[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2007, (11):52-54.

[3] 吳天成, 蘭海楠, 馬思慧, 等. 生長激素受體介導的信號轉(zhuǎn)導機制研究進展[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2014, (12):186-189.

[4]Rahmatalla S A, Müller U, Strucken E M,et al. The F279Y polymorphism of theGHRgene and its relation to milk production and somatic cell score in German Holstein dairy cattle[J]. J Appl Genet, 2011, 52(4):459-465.

[5]Blott S, Kim J J, Moisio S,et al.Molecular dissection of a quantitative trait locus: a phenylalanine-to-tyrosine substitution in the transmembrane domain of the bovine growth hormone receptor is associated with a major effect on milk yield and composition[J]. Genetics, 2003,163(1):253.

[6]王凱, 柳廣斌, 黃特民, 等. 中國南方荷斯坦奶牛TRAPPC9、DGAT1、GHR、ATP1A1基因多態(tài)性與產(chǎn)奶性狀相關(guān)性分析[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報, 2016, (4):7-12.

[7] 邱崢艷, 孟紀倫, 蘆春艷, 等. 草原紅牛與中國荷斯坦牛GHR基因多態(tài)性及與產(chǎn)奶性狀相關(guān)性分析[J]. 中國畜牧雜志, 2011, (13):18-20.

[8] 于茜, 臧長江, 劉玲玲, 等. 伊犁馬催乳素受體基因的遺傳多態(tài)性及其與產(chǎn)奶量的關(guān)聯(lián)分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī),2015, (9):2453-2458.

[9]馬彥男, 賀鵬迦, 朱靜, 等.GHR基因F279Y位點突變對中國荷斯坦牛泌乳性狀的影響[J]. 中國應用生理學雜志, 2013, (5):400-404.

[10]馬妍, 賈晉, 張毅, 等. 荷斯坦牛GHR基因多態(tài)與產(chǎn)奶性狀關(guān)聯(lián)分析[J].畜牧獸醫(yī)學報, 2009, (8):1186-1190.

[11]孫瑞萍, 王利心, 朱廣琴, 等.GHR基因exon9和exon 10多態(tài)性與西農(nóng)薩能奶山羊產(chǎn)奶性能的相關(guān)分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學學報, 2008, (5):70-74.

[12]郭曉飛, 徐小兵, 李秋玲, 等. 荷斯坦母牛生長激素受體基因F279Y突變與產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報, 2015, (4):515-519.

[13]王麗娟, 李秋玲, 王長法, 等. 奶牛GHR基因CRS-PCR多態(tài)性及其與產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報, 2008, (6):936-940.

Polymorphism of GHR Gene and Its Correlation with Lactation Performance in Yili Horse

MENG Zhe1, YU Nong-qi1, GAO Yuan1, WU Ming-li1, FAN Ying-zhi1, LEI Chu-zhao1, LIU Wu-jun2, DANG Rui-hua1*

(1.College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Shaanxi Yangling 712100, China;2. College of Animal Science, Xinjiang Agricultural University, Xinjiang Urumqi 830052, China)

Mare's milk has a high nutritional value, but there are few research reports on lactation performance of horse until now. This trial was conducted to study the polymorphism of growth hormone receptor (GHR) gene in Yili horse and its relationship with lactation performance. 13 pairs of primers were designed for the exons and promoter ofGHRgene of Yili horse. DNA pooling was used as the template, and PCR product was directly sequenced. PCR-RFLP method was used to genotype the polymorphic sites in 188 Yili horses, and then the relationship between genotypes and lactation traits based on 73 of them was analyzed. The result showed that a T-562C mutation inGHRgene promoter was detected in Yili horse. The frequencies of genotype CC, TC and TT were respectively 0.309, 0.66 and 0.016, and C allele was dominant and its frequency was 0.646. The frequency of T gene was 0.354. The results showed that although the milk yield of each genotype was not signi fi cantly different (P>0.05), it was found that there seems to be a trend in the milk production of each genotype (TT> CC>CT). The mutation (C>T) could increase the milk yield. The results can provide an identi fi able ground for the Chinese dairy horse breeding ef fi ciently.

Yili horse;GHRgene; Lactation performance; Polymorphism

S821.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-12-029

2017-05-27；

2017-07-13

國家自然科學基金項目（81270439）；引進人才科研啟動費（Z111021202）

孟吉吉（1996-），男，山東濟寧人，本科生，研究方向為動物遺傳育種，E-mail：nwsuaf_mengzhe@126.com

*通訊作者：黨瑞華（1976-），男，陜西漢中人，博士，副教授，碩士生導師，研究方向為動物遺傳育種，E-mail：dangruihua@nwsuaf.edu.cn