屎腸球菌WEI-10對斷奶仔豬的安全性評價

馮媛媛 喬 琳 姚宏明 介琳霞 高長斌 劉 蕊

(北京大偉嘉生物技術(shù)股份有限公司，微生態(tài)制劑關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)北京市工程實驗室，北京市飼用微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心，北京 100085)

屎腸球菌WEI-10對斷奶仔豬的安全性評價

馮媛媛 喬 琳*姚宏明 介琳霞 高長斌 劉 蕊

(北京大偉嘉生物技術(shù)股份有限公司，微生態(tài)制劑關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)北京市工程實驗室，北京市飼用微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心，北京 100085)

本試驗在飼糧中添加屎腸球菌(Enterococcusfaecium)WEI-10，通過對斷奶仔豬活躍狀態(tài)、腹瀉分?jǐn)?shù)、生長性能、菌血癥以及組織病理學(xué)的檢測，評價菌株WEI-10對斷奶仔豬的安全性。設(shè)計2批試驗，每批選取26日齡的斷奶仔豬253頭，平均體重分別為(7.44±1.02)和(8.11±1.51) kg，每批試驗分為2組：對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧(不添加抗生素和益生菌)，試驗組飼喂在添加基礎(chǔ)飼糧中添加菌株WEI-10的試驗飼糧(2批試驗的試驗組每克基礎(chǔ)飼糧中添加量分別為1×108和1×107CFU)。每批試驗38 d。結(jié)果表明：1)2批試驗的試驗組與對照組，在活躍分?jǐn)?shù)、平均日增重和料重比上均無顯著性差異(P>0.05)。2)試驗組在第5、10和38天腹瀉分?jǐn)?shù)均顯著性低于對照組(P<0.05)；第38天，試驗組的腹瀉分?jǐn)?shù)降為0，對照組腹瀉分?jǐn)?shù)在0.6左右。3)2批試驗的試驗組和對照組均未出現(xiàn)菌血癥以及心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、十二指腸和空腸的病理學(xué)改變。由此可見，菌株WEI-10對斷奶仔豬不存在安全問題，并且可以減少腹瀉。

屎腸球菌；斷奶仔豬；安全性；生長性能；菌血癥；組織病理學(xué)

腸球菌是人類和動物腸道正常菌群的一部分，既往認(rèn)為腸球菌是對人類和動物無公害的共棲菌，但近年來研究證實腸球菌屬的部分種屬的菌株對人和動物有致病力，并且這些菌株引發(fā)的感染病例數(shù)量也在不斷上升，已成為醫(yī)院感染的常見條件致病菌，此外，越來越多的研究證實屎腸球菌(Enterococcusfaecium)與臨床上的一些病理學(xué)有關(guān)系，如菌血癥、不定期心內(nèi)膜炎和膿腫。盡管，過去幾十年益生菌的安全性評價是重要的研究熱點，目前對屎腸球菌的安全性評價研究主要通過體外試驗，如溶血性、毒力基因、抗生素抗性和產(chǎn)有毒代謝產(chǎn)物等；但是，很多情況下體外安全性評價的結(jié)果往往不能真實反映其體內(nèi)的效果，而目前對體內(nèi)的安全性評價的研究很少且不系統(tǒng)，并且至今仍沒有益生菌體內(nèi)安全性評價的標(biāo)準(zhǔn)和指南。目前食品用益生菌的臨床前體內(nèi)安全性評價包括急性毒性和亞慢性毒性試驗，其中亞慢性毒性試驗的檢測指標(biāo)主要有動物活躍狀態(tài)、腹瀉分?jǐn)?shù)(毒性臨床癥狀)和生長性能等[2-3]，并且很多研究者也將這些指標(biāo)用于安全性評價研究[4-5]。細(xì)菌易位是益生菌安全性評價又一被推薦使用的指標(biāo)[6-7]，因為它是很多內(nèi)源性條件致病菌發(fā)病的第1步。肝臟、脾臟腫大和其他臟器的實質(zhì)性病變是反映感染性和致病性的間接指標(biāo)，腸道黏膜的完整性在阻止?jié)撛谥虏【蛴卸疚镔|(zhì)侵襲全身組織上發(fā)揮重要的屏障作用，因而也作為安全性評價指標(biāo)使用。目前無論文獻(xiàn)報道結(jié)果還是市場實踐，均顯示益生菌針對畜禽發(fā)揮益生功效的日常添加量為每克基礎(chǔ)飼糧添加1×106CFU的活性菌[9-10]，本研究選擇添加量為日常添加量10倍和100倍的劑量在斷奶仔豬基礎(chǔ)飼糧中添加本實驗室分離的1株屎腸球菌WEI-10，通過仔豬活躍狀態(tài)、腹瀉分?jǐn)?shù)、生長性能、菌血癥以及組織病理學(xué)研究，對菌株WEI-10進行系統(tǒng)的針對斷奶仔豬的體內(nèi)安全性評價研究，旨在評價飼用屎腸球菌的體內(nèi)安全性。

1 材料與方法

1.1 菌株

本試驗使用的菌株為屎腸球菌WEI-10(中國普通微生物菌種保藏管理中心編號7746)，該菌株分離于60日齡健康仔豬腸道黏膜，已進行體外安全性和有效性評價研究[11]和針對小白鼠的急性毒性及亞急性毒性評價試驗。體外安全性試驗表明，菌株WEI-10具有γ-溶血性、無膽汁鹽水解酶活性、不產(chǎn)生物胺(組胺、酪胺和腐胺)、不含歐洲食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)在2012年制訂的針對屎腸球菌毒力因素評價的規(guī)程[12]中要求檢測的3個毒力基因(即IS16、esp和hylEFM)、不含可轉(zhuǎn)移的抗生素抗性基因；小白鼠的急性毒性和亞急性毒性評價試驗表明，無論采用原始發(fā)酵液(活菌數(shù)為3×109CFU/mL)還是原菌粉(活菌數(shù)為3×1010CFU/g)對小白鼠進行急性毒性和亞急性毒性試驗，整個試驗過程小白鼠均無死亡，與對照組相比沒有出現(xiàn)體重降低，并在皮毛色澤，活躍狀態(tài)，采食量及肝臟、脾臟、肺臟和腎臟器官指數(shù)上與對照組相比沒有顯著性差異(P>0.05)，組織病理結(jié)果表明肝臟、脾臟、肺臟和腎臟也均無實質(zhì)性病變。本研究使用的樣品為本實驗室生產(chǎn)的制粒菌粉，活菌數(shù)≥2×1010CFU/g。

1.2 試驗動物和試驗設(shè)計

試驗場地位于黑龍江省哈爾濱市某養(yǎng)殖公司的規(guī)模豬場。試驗采用單因素完全隨機試驗設(shè)計，共設(shè)計了2批試驗，第1批試驗選擇體況相近、健康、平均體重為(7.44±1.02) kg的26日齡斷奶仔豬(長白×大白×杜洛克三元雜交)253頭，根據(jù)體重相近，公母比例基本一致的原則，隨機分為2組：對照組Ⅰ飼喂基礎(chǔ)飼糧(不添加抗生素和益生菌)，試驗組Ⅰ飼喂基礎(chǔ)飼糧中添加菌株WEI-10(每克基礎(chǔ)飼糧中菌株WEI-10的添加量為1×108CFU)的試驗飼糧，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)(22±4)頭仔豬，每個重復(fù)1欄。第2批試驗選擇體況相近、健康、平均體重為(8.11±1.51) kg的26日齡斷奶仔豬(長白×大白×杜洛克三元雜交)253頭，根據(jù)體重相近，公母比例基本一致的原則，隨機分為2組：對照組Ⅱ飼喂基礎(chǔ)飼糧(不添加抗生素和益生菌)，試驗組Ⅱ飼喂基礎(chǔ)飼糧中添加菌株WEI-10(每克基礎(chǔ)飼糧中菌株WEI-10的添加量為1×107CFU)的試驗飼糧，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)(22±4)頭仔豬，每個重復(fù)1欄。2批試驗均為38 d?；A(chǔ)飼糧配方營養(yǎng)要求不低于NRC(2012)推薦的最低標(biāo)準(zhǔn)[13]，其組成及營養(yǎng)水平見表1。根據(jù)豬場條件，為了保證試驗結(jié)果的可靠性，設(shè)計2個獨立批次試驗，分別評價2個劑量的安全性。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗組和對照組在相同環(huán)境和管理條件下飼養(yǎng)，自由采食，自由飲水，試驗期間按照豬場正常程序注射疫苗和驅(qū)蟲。每天以重復(fù)為單位詳細(xì)記錄每頭豬的活躍分?jǐn)?shù)(activity score,AS)，采用三標(biāo)度法(1：懶，移動緩慢；2：中間狀態(tài)；3：活躍移動并覓食)。并以重復(fù)為單位計算每天的活躍分?jǐn)?shù)平均值，試驗結(jié)束統(tǒng)計分析全期試驗組和對照組的活躍分?jǐn)?shù)。每天記錄每頭豬的死淘和發(fā)病情況。在試驗的第3、5、10、17、24和38天，以重復(fù)為單位記錄每頭豬的腹瀉分?jǐn)?shù)(0：球團；1：半球團；2：軟便；3：水便)[14-15]，并以重復(fù)為單位計算腹瀉分?jǐn)?shù)平均值。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長性能

以重復(fù)為單位，計錄全程采食量，在試驗的第1天和第38天進行空腹稱重，并計算平均日增重、平均日采食量和料重比。同時，試驗結(jié)束計算全期活躍分?jǐn)?shù)和死淘率。

1.4.2 菌血癥

菌血癥分析采用文獻(xiàn)[4-5]中的方法。試驗第1、10、24和38天時，每個重復(fù)隨機選擇1頭豬，通過前腔靜脈無菌采血2 mL于加有檸檬酸鈉抗凝劑的采血管中，取100 μL血液涂布于MRS瓊脂平板，于37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察MRS瓊脂平板有無菌落長出，每份血液樣品做3個重復(fù)。若試驗組和對照組檢測平板均未長菌落，則認(rèn)為是菌血癥陰性；若有疑似屎腸球菌的菌落長出，則先與對照組平板比較，若對照組平板也有相同菌落，并且通過16S rRNA基因序列分析，鑒定屬于同一種屬，則認(rèn)為是野生菌株感染，同樣判定結(jié)果為陰性；若對照組檢測平板未長菌落，試驗組檢測平板有屎腸球菌菌落，則認(rèn)為是菌株WEI-10感染，結(jié)果判定為陽性。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)每千克預(yù)混料含 One kg premix contained the following：VA 2 000 000 IU，VD3400 000 IU，VB20.8 g，VE 0.3 g，VB122.4 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 0.1 mg，煙酸 niacin 4 g，氯化膽堿 choline chloride 60 g，Ca (as calcium bicarbonate and light calcium carbonate) 0.28 g，Mn (as manganese sulfate) 11 g，I (as potassium iodide) 0.4 g，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 3 g，Zn (as zinc sulfate) 6 g，Cu (as copper sulfate) 0.8 g，Co 0.18 g，P 80 g。

2)代謝能為計算值，其余為實測值。ME was a calculated value,while others were measured values.

1.4.3 臟器指數(shù)

從各重復(fù)選取1頭接近平均體重的仔豬，采取直接刺殺心臟放血致死后，立即剖開腹腔，取其心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟，剔除脂肪后稱取濕重，計算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)(g/kg)=器官濕重(g)/豬活體重(kg)。

1.4.4 組織病理檢查

結(jié)扎胃腸段后，于十二指腸和空腸的近端分別截取2 cm長腸段，剪取的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟樣品各2塊，浸于10%甲醛固定，用梯度乙醇逐級脫水，二甲苯洗滌，石蠟包埋，分別在十二指腸和空腸腸段的3～6個位點，連續(xù)切取3～6個腸環(huán)橫斷面，分別在剪取的每塊心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟樣品的3個位點，連續(xù)切取3個橫斷面或縱斷面，制備6 μm厚石蠟切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腸組織和各臟器的基本形態(tài)和病理學(xué)改變，并用圖像采集系統(tǒng)采集相應(yīng)組織圖像。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件中的one-way ANOVA進行單因素方差分析，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 屎腸球菌WEI-10對斷奶仔豬活躍狀態(tài)的影響

活躍狀態(tài)用活躍分?jǐn)?shù)表示，試驗全期，2個批次試驗的活躍分?jǐn)?shù)如圖1所示，第1批試驗，對照組Ⅰ和試驗組Ⅰ的活躍分?jǐn)?shù)分別是2.22和2.15；第2批試驗，對照組Ⅱ和試驗組Ⅱ的活躍分?jǐn)?shù)分別是2.30和2.35，活躍分?jǐn)?shù)均處于中間狀態(tài)和活躍移動并覓食之間。2批試驗的試驗組和對照組在活躍狀態(tài)上無顯著性差異(P>0.05)，且對照組和試驗組均未發(fā)生死亡或疾病。

圖1 2批試驗斷奶仔豬的活躍分?jǐn)?shù)

2.2 屎腸球菌WEI-10對斷奶仔豬腹瀉分?jǐn)?shù)的影響

2個批次試驗的腹瀉分?jǐn)?shù)如圖2所示，試驗組和對照組均在試驗第5、10和38天腹瀉分?jǐn)?shù)有顯著性差異(P<0.05)；飼喂全期，2批試驗均是試驗組的腹瀉分?jǐn)?shù)低于對照組，并且在試驗第38天時，2批試驗的試驗組的腹瀉分?jǐn)?shù)降為0，對照組腹瀉分?jǐn)?shù)在0.6左右，因此，即使選擇日常添加量10倍和100倍的劑量飼喂屎腸球菌WEI-10也沒有引起斷奶仔豬腹瀉，同時還降低了斷奶仔豬的腹瀉分?jǐn)?shù)。

2.3 屎腸球菌WEI-10對斷奶仔豬生長性能的影響

飼糧中添加菌株WEI-10對斷奶仔豬生長性能的影響見表2，第1批試驗，試驗組Ⅰ的平均日采食量比對照組Ⅰ降低1.60%，平均日增重降低3.13%，料重比增加1.58%，2組間均無顯著性差異(P>0.05)。第2批試驗，試驗組Ⅱ的平均日采食量比對照組Ⅱ降低4.44%，平均日增重降低2.31%，料重比降低1.78%，2組間均無顯著性差異(P>0.05)。

同一批試驗、同一時間點，試驗組和對照組的數(shù)據(jù)無字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)，標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

In the same batch test and at the same time point, values of test group and control group with no letter mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05).

圖2屎腸球菌WEI-10對斷奶仔豬腹瀉分?jǐn)?shù)的影響

Fig.2 Effects ofEnterococcusfaeciumWEI-10 on diarrhea score of weaned piglets

2.4 斷奶仔豬的菌血癥檢測結(jié)果

平板培養(yǎng)結(jié)果顯示，第1、10、24和38天的血液樣品培養(yǎng)后均沒有菌落長出，結(jié)果均為陰性，表明菌株WEI-10沒有發(fā)生易位。

2.5 屎腸球菌WEI-10對斷奶仔豬臟器指數(shù)和重要組織病理變化的影響

解剖時通過臨床觀察，2批試驗的試驗組和對照組仔豬均沒有出現(xiàn)肝臟腫大、脾臟腫大和盲腸擴大。內(nèi)臟器官的臟器指數(shù)見表3，2批試驗的試驗組和對照組均沒有顯著性差異(P>0.05)。

通過組織病理切片分析，2批試驗的試驗組和對照組都沒有出現(xiàn)臟器實質(zhì)性病變、炎性細(xì)胞和相應(yīng)淋巴細(xì)胞的增多以及結(jié)構(gòu)疏松和水腫等。飼喂菌株WEI-10對仔豬的十二指腸和空腸的腸道黏膜的完整性沒有受到影響，也沒有造成黏膜上皮細(xì)胞脫落、固有層裸露，固有層疏松，以及淋巴細(xì)胞浸潤造成炎性反應(yīng)等。以肝臟、脾臟和十二指腸為例，具體分析2批試驗的試驗組和對照組的切片病理結(jié)果。2批試驗的肝臟、脾臟和十二指腸的切片病理變化如圖3、4和5所示。由圖3可以看出，對照組和試驗組仔豬肝臟組織正常，肝小葉結(jié)構(gòu)可辨，肝索排列整齊，沒有出現(xiàn)肝細(xì)胞空泡化、肝竇擴張以及淋巴細(xì)胞或炎性細(xì)胞浸潤等病理特征。由圖4可以看出，對照組和試驗組仔豬脾臟組織正常，白髓和紅髓見的邊緣帶明顯，白髓部未發(fā)生出血，紅髓部脾索清晰，脾血竇未出現(xiàn)擴張等病理特征。由圖5可以看出，對照組和試驗組仔豬十二指腸未出現(xiàn)黏膜上皮細(xì)胞脫落、固有層裸露、水腫、固有層和黏膜肌層與黏膜下層間疏松，也未出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤等病理特征。

表2 屎腸球菌WEI-10對斷奶仔豬生長性能的影響

同一批試驗、同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same batch test, values in the same column with no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表3 屎腸球菌WEI-10對斷奶仔豬臟器指數(shù)的影響

3 討 論

目前研究者對屎腸球菌在斷奶仔豬上的評價研究多集中在有效性評價，測定的指標(biāo)主要是生長性能[16-19]、腹瀉率[17]、飼糧養(yǎng)分表觀消化率[17]、各腸段及糞樣pH與微生物菌群[17,20-21]、血液生化指標(biāo)[16-18]、免疫能力[18,21]、小腸絨毛發(fā)育及養(yǎng)分吸收和抗病原菌感染[19,21]等，并且飼喂的劑量大多數(shù)是每克基礎(chǔ)飼糧添加106CFU的活性屎腸球菌，而對屎腸球菌的安全性評價研究主要通過體外試驗，如溶血性、毒力基因、抗生素抗性和產(chǎn)有毒代謝產(chǎn)物等。但是，很多情況下體外安全性評價的結(jié)果往往不能真實反映其體內(nèi)的效果，而目前對體內(nèi)的安全性評價的研究很少且不系統(tǒng)，因此，本研究選擇的飼喂劑量是日常添加量(每克基礎(chǔ)飼糧添加106CFU益生菌)的10倍和100倍，即每克基礎(chǔ)飼糧添加1×107和1×108CFU菌株WEI-10，研究屎腸球菌對斷奶仔豬的安全性。

3.1 屎腸球菌WEI-10對斷奶仔豬整體活躍狀態(tài)、腹瀉分?jǐn)?shù)和生長性能的影響

食欲、活躍狀態(tài)、腹瀉狀況和生長性能是反映動物健康狀態(tài)的敏感性指標(biāo)，本研究以動物的平均日采食量、平均日增重、料重比、活躍分?jǐn)?shù)和腹瀉分?jǐn)?shù)為指標(biāo)研究屎腸球菌WEI-10針對斷奶仔豬的體內(nèi)安全性評價。本研究選擇的飼喂劑量是每克基礎(chǔ)飼糧添加1×107和1×108CFU菌株WEI-10(飼喂劑量為日常添加量的10倍和100倍)，盡管2批試驗的試驗組的平均日采食量和平局日增重均略低于對照組，且第1批試驗的試驗組的料重比也比其相應(yīng)的對照組略高，但2批試驗的試驗組和對照組均無顯著性差異，因此，初步判斷，菌株WEI-10并沒有威脅斷奶仔豬的健康。Hanczakowska等[19]在研究屎腸球菌NCIMB 10415對26～56日齡仔豬生長性能的影響時，也得出相似的結(jié)果，即飼喂屎腸球菌NCIMB 10415的試驗組的平均日采食量和平均日增重均低于對照組，料重比也高于對照組，但組間無顯著性差異。Zhou等在對鼠李糖乳桿菌HN001、嗜酸乳桿菌HN017和雙歧桿菌HN019進行毒性評價時，結(jié)果表明鼠李糖乳桿菌HN001、嗜酸乳桿菌HN017和雙歧桿菌HN019與對照組及商業(yè)化的菌株鼠李糖乳桿菌GG和嗜酸乳桿菌LA-1相比，活躍分?jǐn)?shù)均沒有顯著性差異。本研究2批試驗的試驗組與對照組相比，均降低了腹瀉分?jǐn)?shù)。這與很多前人的研究結(jié)果相似，如Chen等[22]報道在飼糧中添加益生菌可降低豬排泄物中氨的濃度，從而降低腹瀉分?jǐn)?shù)；同樣，Thu等[23]報道在斷奶仔豬的飼糧中按照3%的量添加植物乳桿菌的液體代謝物，可以顯著降低斷奶仔豬的腹瀉分?jǐn)?shù)。華均超等[17]報道在斷奶仔豬飼糧中按照6%的量添加屎腸球菌T013復(fù)合制劑能顯著降低腹瀉率。

C1：對照組Ⅰ；T1：試驗組Ⅰ；C2：對照組Ⅱ；T2：試驗組Ⅱ。下圖同。

C1: control groupⅠ; T1: test groupⅠ; C2: control group Ⅱ; T2: test group Ⅱ. The same as below.

圖3屎腸球菌WEI-10對斷奶仔豬肝臟組織病理變化的影響

Fig.3 Effects ofEnterococcusfaeciumWEI-10 on liver histopathological changes of weaned piglets (400×)

圖4 屎腸球菌WEI-10對斷奶仔豬脾臟組織病理變化的影響

圖5 屎腸球菌WEI-10對斷奶仔豬十二指腸組織病理變化的影響

3.2 斷奶仔豬的菌血癥檢測結(jié)果

細(xì)菌易位或菌血癥是大部分的腸道條件致病菌發(fā)病的先決條件，也是反映細(xì)菌的感染能力和致病性的重要指標(biāo)[24]。本研究未在血液中檢測到菌株WEI-10，因此，菌株WEI-10沒有從腸道易位至全身的血液組織，不存在易位的風(fēng)險。Zhou等在研究鼠李糖乳桿菌HN001、嗜酸乳桿菌HN017和雙歧桿菌HN019的毒性評價時也得出同樣結(jié)論。因此，認(rèn)為菌株WEI-10沒有侵入性，對仔豬是安全的。

3.3 屎腸球菌WEI-10對斷奶仔豬臟器指數(shù)和重要組織病理變化的影響

感染性和致病性也是益生菌安全性評價的重要指標(biāo)。肝臟腫大和脾臟腫大是反映感染性的間接指標(biāo)，通過解剖臨床觀察2批試驗的試驗組和對照組的肝臟、脾臟和其他臟器均沒有出現(xiàn)實質(zhì)性病變和明顯差異，并且進一步測定的臟器指數(shù)也說明試驗組和對照組之間無顯著性差異。外周血嗜中性粒細(xì)胞或嗜酸性粒細(xì)胞是反映細(xì)菌感染的有效指標(biāo)，通過組織切片病理分析，沒有觀察到試驗組的臟器實質(zhì)性病變、炎性細(xì)胞和相應(yīng)淋巴細(xì)胞的增多以及結(jié)構(gòu)疏松和水腫等，并且和對照組之間無明顯病理差異，說明菌株WEI-10沒有引起仔豬感染和致病。腸道黏膜在阻止?jié)撛谥虏【蛴卸疚镔|(zhì)侵襲全身組織上發(fā)揮重要的屏障作用。本研究的菌株WEI-10對試驗組仔豬的十二指腸和空腸的腸道黏膜的完整性沒有不良影響，不會造成黏膜上皮細(xì)胞脫落、固有層裸露，固有層疏松，以及淋巴細(xì)胞浸潤造成炎性反應(yīng)等，因此說明菌株WEI-10沒有感染性和致病性。Giannenas等[21]在研究屎腸球菌對育肥豬的腸道黏膜影響的毒性評價時也得出相似的結(jié)論。

4 結(jié) 論

① 即使選擇飼喂劑量為日常添加量的10倍和100倍，屎腸球菌WEI-10飼喂斷奶仔豬后各項指標(biāo)(活躍分?jǐn)?shù)、腹瀉分?jǐn)?shù)、平均日采食量、平均日增重和料重比)盡管略有變差，但均無顯著性變化。

② 屎腸球菌WEI-10沒造成在斷奶仔豬腸道外組織的易位，也未造成內(nèi)臟和腸道黏膜的組織性病變。

③ 屎腸球菌WEI-10不存在安全性問題。

[2] DONOHUE D C,SALMINEN S,MARTEAU P.Safety of probiotic bacteria//SALMINEN S,VON WRIGHT A.Lactic acid bacteria.New York:Marcel Dekker,1998:369.

[3] ENDRES J R,CLEWELL A,JADE K A,et al.Safety assessment of a proprietary preparation of a novel Probiotic,Bacilluscoagulans,as a food ingredient.Food and Chemical Toxicology,2009,47(6):1231-1238.

[4] ZHOU J S,SHU Q,RUTHERFURD K J,et al.Safety assessment of potential probiotic lactic acid bacterial strainsLactobacillusrhamnosusHN001,Lb.acidophilusHN017,andBifidobacteriumlactisHN019 in BALB/c mice.International Journal of Food Microbiology,2000,56(1):87-96.

[5] ZHOU J S,SHU Q,RUTHERFURD K J,et al.Acute oral toxicity and bacterial translocation studies on potentially probiotic strains of lactic acid bacteria.Food and Chemical Toxicology,2000,38(2/3):153-161.

[6] MATTILA-SANDHOLM T.The PROBDEMO project:demonstration of the nutritional functionality of probiotic foods.Trends in Food Science & Technology,1999,10(12):385-386.

[7] FRIZZO L S,BERTOZZI E,SOTO L P,et al.Studies on translocation,acute oral toxicity and intestinal colonization of potentially probiotic lactic acid bacteria administered during calf rearing.Livestock Science,2010,128(1/2/3):28-35.

[8] MA L,DEITCH E,SPECIAN R,et al.Translocation ofLactobacillusmurinusfrom the gastrointestinal tract.Current Microbiology,1990,20(3):177-184.

[9] LIU X T,WANG Y,WANG H L,et al.Effect of a liquid culture ofEnterococcusfaecalisCGMCC1.101 cultivated by a high density process on the performance of weaned piglets.Livestock Science,2014,170:100-107.

[10] 王杰,艾萍萍,刁其玉,等.復(fù)合益生菌和纖維寡糖對斷奶仔豬生長性能、糞便微生物及血清指標(biāo)的影響.動物營養(yǎng)學(xué)報,2016,28(3):881-890.

[11] FENG Y Y,QIAO L,LIU R,et al.Potential probiotic properties of lactic acid bacteria isolated from the intestinal mucosa of healthy piglets.Annals of Microbiology,2017,67(3):239-253.

[12] FEEDAP.Guidance on the safety assessment ofEnterococcusfaeciumin animal nutrition.EFSA Journal,2012,10(5):2682.

[13] NRC.Nutrient requirements of swine.11th ed.Washington,D.C.:National Academy Press,2012.

[14] LOH T C,CHOO P Y,CHEONG Y H.Effects of organic acids and natural herbs on performance and incidence of diarrhoea in post-weaning pigs.Malaysian Journal of Animal Science,2002,7(2):25-30.

[15] DOWARAH R,VERMA A K,AGARWAL N,et al.Effect of swine based probiotic on performance,diarrhoea scores,intestinal microbiota and gut health of grower-finisher crossbred pigs.Livestock Science,2016,195:74-79.

[16] 文靜,孫建安,周緒霞,等.屎腸球菌對仔豬生長性能、免疫和抗氧化功能的影響.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報,2011,23(1):70-73.

[17] 華均超,張邦輝,周明,等.屎腸球菌T013復(fù)合制劑在斷奶仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用研究.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(11):6519-6523.

[18] 王永,楊維仁,張桂國.飼糧中添加屎腸球菌對斷奶仔豬生長性能、腸道菌群和免疫功能的影響.動物營養(yǎng)學(xué)報,2013,25(5):1069-1076.

[20] PAJARILLO E A B,CHAE J P,BALOLONG M P,et al.Effects of probioticEnterococcusfaeciumNCIMB 11181 administration on swine fecal microbiota diversity and composition using barcoded pyrosequencing.Animal Feed Science and Technology,2015,201:80-88.

[21] GIANNENAS I,DOUKAS D,KARAMOUTSIOS A,et al.Effects ofEnterococcusfaecium,mannan oligosaccharide,benzoic acid and their mixture on growth performance,intestinal microbiota,intestinal morphology and blood lymphocyte subpopulations of fattening pigs.Animal Feed Science and Technology,2016,220:159-167.

[22] CHEN Y J,SON K S,MIN B J,et al.Effects of dietary probiotic on growth performance,nutrients digestibility,blood characteristics and fecal noxious gas content in growing pigs.Asian-Australasian Journal of Animal Sciences,2006,18(10):1464-1468.

[23] THU T V,LOH T C,FOO H L,et al.Effects of liquid metabolite combinations produced byLactobacillusplantarumon growth performance,faeces characteristics,intestinal morphology and diarrhoea incidence in postweaning piglets.Tropical Animal Health and Production,2011,43(1):69-75.

SafetyEvaluationofEnterococcusfaeciumWEI-10onWeanedPiglets

FENG Yuanyuan QIAO Lin*YAO Hongming JIE Linxia GAO Changbin LIU Rui

(BeijingDaweijiaBiotechnologyCo.,Ltd.,BeijingEngineeringLaboratoryofProbioticsKeyTechnologyDevelopment,BeijingEngineeringandTechnologyResearchCenterofFeedingProbiotics,Beijing100085,China)

In order to evaluate the safety of studyEnterococcusfaeciumWEI-10 on weaned piglets，EnterococcusfaeciumWEI-10 was added in diet to determine the effects on activity condition, diarrhea score, growth performance, histopathology changes and bacteremia in weaned piglets. Two batch tests were designed. In each batch test, two hundred and fifty-three crossbred (Large White×Landrace×Duroc) weaned piglets at 26 days of age with average body weight of (7.44±1.02) kg and (8.11±1.51) kg, respectively, were randomly assigned to two groups. Control group was fed only with a basal diet without antibiotics and probiotics, and test group was fed the basal diet supplemented withEnterococcusfaeciumWEI-10 (1×108and 1×107CFUEnterococcusfaeciumWEI-10 per gram of basal diet in two batch tests, respectively). The trial lasted for 38 days. The results showed as follows: 1) there were no significant differences between test group and control group in activity score, average daily gain and feed to gain ratio in two batch tests (P>0.05). 2) Compared with control groups, diarrhea score of test groups on day 5, 10 and 38 was significantly decreased (P<0.05); on day 38, diarrhea score of test groups reduced to 0, while that of control groups was about 0.6. 3)Bacteremia and pathology changes in heart, liver, spleen, lung, kidney, duodenum and jejunum did not occur in test groups and control groups of two batch tests. The study indicates thatEnterococcusfaeciumWEI-10 has no safety problems and can reduce diarrhea of weaned piglets.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(12)：4588-4596]

Enterococcusfaeciums; weaned piglets; safety; growth performance; bacteremia; histopathology

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.12.041

S816.7;S828

A

1006-267X(2017)12-4588-09

2017-05-26

飼用微生物與酶制劑共性技術(shù)研發(fā)與服務(wù)平臺建設(shè)(D161100006116001)

馮媛媛(1989—)，女，山東菏澤人，碩士研究生，從事飼用益生菌安全性和有效性評價技術(shù)研究。E-mail: fengyuanyuan11@mails.ucas.ac.cn

*通信作者：喬 琳，E-mail: linandqiao@aliyun.com

*Corresponding author, E-mail: linandqiao@aliyun.com

(責(zé)任編輯 王智航)