玉屏風(fēng)散合四物湯對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道7種細(xì)菌的影響

彭靜+羊忠山++李玉卿++袁嘉麗

[摘要] 目的 觀察玉屏風(fēng)散合四物湯對(duì)慢性阻塞性肺?。–OPD）大鼠氣道肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、腸桿菌、鏈球菌、奈瑟菌、乳酸桿菌的影響作用，為玉屏風(fēng)散合四物湯治療COPD提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 按隨機(jī)數(shù)字表將50只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠分為正常組，模型組，玉屏風(fēng)散合四物湯高、中、低劑量組，每組各10只。通過(guò)氣管滴注脂多糖加煙熏的方法建立COPD大鼠模型。造模結(jié)束后，給藥組分別給予不同濃度玉屏風(fēng)散合四物湯灌胃，正常組和模型組以無(wú)菌蒸餾水灌胃，每日1次，連續(xù)30 d。收集所有大鼠肺組織勻漿進(jìn)行各種細(xì)菌的高通量測(cè)序檢測(cè)，取左肺組織制作病理切片。 結(jié)果 ①與正常組相比，模型組乳酸桿菌含量顯著降低，其余6種細(xì)菌含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；②與模型組相比，玉屏風(fēng)散合四物湯高、中、低劑量組的肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌含量顯著降低，高劑量組的流感嗜血桿菌、腸桿菌、鏈球菌、奈瑟菌含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而中、低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；③與模型組相比，玉屏風(fēng)散合四物湯低、中劑量組的乳酸桿菌含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而高劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 玉屏風(fēng)散合四物湯可使COPD大鼠肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、腸桿菌、鏈球菌、奈瑟菌含量明顯減少，乳酸桿菌含量增多，這可能是其治療COPD的重要機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 玉屏風(fēng)散；四物湯；慢性阻塞性肺疾??；細(xì)菌

[中圖分類號(hào)] R563 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）11（c）-0013-04

Effects of Yupingfeng San and Siwu Decoction on seven kinds of bacteria in rats with chronic obstructive pulmonary disease

PENG Jing YANG Zhongshan LI Yuqing YUAN Jiali

Basic Medical College， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Yunnan Province， Kunming 650500， China

[Abstract] Objective To observe the effect of Yupingfeng San and Siwu Decoction on Klebsiella pneumoniae， Pseudomonas aeruginosa， Haemophilus influenzae， Enterobacter， Streptococcus， Neisseria and Lactobacillus in rats with chronic obstructive pulmonary disease （COPD）， in order to provide experimental basis for Yupingfeng San and Siwu Decoction in the treatment of COPD. Methods Fifty SPF male wistar rats were divided into 5 groups， incliding normal group， model group， Yupingfeng San and Siwu Decoction high dose， middle dose and low dose groups， with 10 cases in each group. The COPD rat model was established by intratracheal instillation of lipopolysaccharide plus smoked methods. After molding， the rats in the dose groups were given to different concentrations of Yupingfeng San and Siwu Decoction by gavage， while the rats in the normal group and model group were fed with sterile distilled water， once time a day for 30 days. All the lung tissues of rats were collected， to for high-throughput sequencing of various bacteria， and the left lung tissue was used to make pathological sections. Results ①Compared with the normal group， the content of Lactobacillus in the model group was significantly decreased， and the contents of the other six bacteria were significantly increased， with statistically significant difference （P < 0.05）.②Compared with model group， the contents of Klebsiella pneumoniae， Pseudomonas aeruginosa in the Yupingfeng San and Siwu Decoction high， middle and low dose groups were significantly reduced， the contents of Haemophilus influenzae， Enterobacter， Streptococcus， Neisseria in the high dose group were significantly reduced， with statistically significant difference （P < 0.05）， but there was no significant difference between the middle and low dose groups （P > 0.05）.③The contents of Lactobacillus in the Yupingfeng San and Siwu Decoction low and middle dose groups was significantly increased， compared with model group， with statistically significant difference （P < 0.05）， there was no significant difference between high dose group and model group （P < 0.05）. Conclusion The contents of Klebsiella pneumoniae， Pseudomonas aeruginosa， Haemophilus influenzae， Enterobacter， Streptococcus and Neisseria can be significantly reduced in rats with COPD by Yupingfeng San and Siwu Decoction， the content of Lactobacillus increasing， which may be one of the important mechanisms for the treatment of COPD .endprint

[Key words] Yupingfeng San； Siwu Decoction； Chronic obstructive pulmonary disease； Bacterial

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重危害患者的身心健康，其氣流受限不完全可逆、呈進(jìn)行性發(fā)展，與肺對(duì)吸入煙草煙霧等有害氣體或顆粒的異常炎性反應(yīng)有關(guān)[1]。很多研究表明，細(xì)菌定植與COPD的發(fā)病及加重密切相關(guān)，有效控制細(xì)菌感染是治療COPD的重要手段之一[2-4]。

玉屏風(fēng)散為中藥免疫調(diào)節(jié)劑，具有益氣固表止汗之效[5-8]，四物湯是活血養(yǎng)血法的經(jīng)典方劑，功效養(yǎng)血調(diào)血，主治營(yíng)血虛滯證[9-11]。兩方合用則有“益氣活血養(yǎng)血”之效，經(jīng)臨床治療300余例COPD，顯效率為80%以上。因此本實(shí)驗(yàn)選定玉屏風(fēng)散合四物湯干預(yù)COPD大鼠氣道7種常見(jiàn)細(xì)菌，觀察其影響效果，分析其治療COPD的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與藥材

50只雄性SPF級(jí)Wistar大鼠，6～8周，平均體重（200±20）g，購(gòu)于成都達(dá)碩生物科技有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（川）2015-030]，飼養(yǎng)于云南中醫(yī)學(xué)院（以下簡(jiǎn)稱“我?！保?shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。玉屏風(fēng)散合四物湯（黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、熟地、當(dāng)歸、白芍、川芎7味中藥組成），均購(gòu)自云南鴻翔中藥科技有限公司（生產(chǎn)批號(hào)：20160803），由我校中藥鑒定教研室鑒定其品種和質(zhì)量。全方生藥總量122 g，以成人每日治療劑量根據(jù)大鼠體表面積換算為其等效劑量[10.98 g/（kg·d）]，此劑量作為中劑量組，低、中、高劑量的比例為0.5∶1∶3。

1.2 試劑及儀器

紅塔山牌香煙（煙堿量1.1 mg/支，焦油量11 mg/支，一氧化碳量11 mg/支，云南玉溪卷煙廠生產(chǎn)），脂多糖（LPS，10 mg/支，Sigma公司），石蠟切片機(jī)（Leica RM2235，德國(guó)徠卡），攤片機(jī)（Leica HI1210，德國(guó)徠卡），顯微鏡（CI-L型，日本尼康）。

1.3 動(dòng)物分組及模型制備

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠普通飲食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表分為5組，每組各10只，分別為正常組，模型組和玉屏風(fēng)散合四物湯高、中、低劑量組。除正常組外，其余4組分別于第1、14日向各實(shí)驗(yàn)組大鼠（10%水合氯醛腹腔注射麻醉）氣管內(nèi)注入脂多糖200 μL，第2～28天（注射LPS當(dāng)天除外）上午將大鼠置入自制密閉的有機(jī)玻璃箱內(nèi)，注入5%（V/V） 紅塔山牌香煙煙霧，30 min /d，共28 d（4周）。正常組不予煙熏，但采用相同的方法氣管內(nèi)滴入等量的生理鹽水。

1.4 給藥方法

造模結(jié)束后，每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥30 d。正常組和模型組以無(wú)菌蒸餾水灌胃。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

給藥結(jié)束后的第2天殺鼠取材，無(wú)菌條件下取出右肺放入液氮凍存?zhèn)溆?，所有?biāo)本均用肺組織勻漿進(jìn)行各種細(xì)菌的高通量測(cè)序檢測(cè)，取其左肺組織制作病理切片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織病理切片比較

正常組大鼠肺組織氣道結(jié)構(gòu)清晰，支氣管管腔規(guī)則，氣道內(nèi)未見(jiàn)黏液分布及黏液栓形成，氣道纖毛上皮排列整齊，黏膜皺襞無(wú)水腫，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞及滲出液。模型組大鼠肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)及細(xì)支氣管壁可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道結(jié)構(gòu)紊亂，支氣管黏膜皺襞減少，甚至脫落，管腔狹窄，氣道壁可見(jiàn)大量纖維組織增生，管壁增厚，氣道纖維化，肺泡腔明顯擴(kuò)張，部分肺泡腔融合。玉屏風(fēng)散合四物湯高、中、低劑量組表現(xiàn)比模型組減輕，中劑量組改善尤為明顯（圖1）。

2.2 各組大鼠7種細(xì)菌含量比較

由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作不當(dāng)導(dǎo)致部分大鼠死亡，正常組、模型組、玉屏風(fēng)散合四物湯高劑量組、玉屏風(fēng)散合四物湯中劑量組分別死亡1、2、1、2只，玉屏風(fēng)散合四物湯低劑量組大鼠無(wú)死亡。與正常組相比，模型組乳酸桿菌含量顯著降低，其余6種細(xì)菌含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與模型組相比，玉屏風(fēng)散合四物湯高、中、低劑量組的肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌含量顯著降低，高劑量組的流感嗜血桿菌、腸桿菌、鏈球菌、奈瑟菌含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而中、低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；與模型組相比，玉屏風(fēng)散合四物湯低、中劑量組的乳酸桿菌含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而高劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

細(xì)菌負(fù)荷增高可以導(dǎo)致COPD慢性氣道炎癥加重，因此，降低細(xì)菌的定植量能有效緩解COPD的炎癥程度。本實(shí)驗(yàn)選取的肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌屬于COPD檢出率較高的病原菌。趙淑敏等[12]收取了278例COPD合并肺部感染患者的痰液，觀察細(xì)菌培養(yǎng)及藥物敏感性，結(jié)果顯示COPD合并肺部感染主要為銅綠假單胞菌（22.13%）、腸桿菌屬（14.50%）、流感嗜血桿菌（13.74%）、肺炎克雷伯桿菌（12.21%）等革蘭陰性桿菌。

腸桿菌屬是革蘭陰性菌，廣泛分布于自然界，普遍存在于人和動(dòng)物中。最常見(jiàn)的兩種是產(chǎn)氣腸桿菌和陰溝腸桿菌，能引起多種腸道外的條件致病性感染，如泌尿道、呼吸道和傷口感染，亦可引起菌血癥和腦膜炎[13]。

醫(yī)學(xué)上重要的鏈球菌主要有化膿性鏈球菌、草綠色鏈球菌、肺炎鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌等，其中，與COPD密切相關(guān)的主要是肺炎鏈球菌，許多文獻(xiàn)報(bào)道COPD患者肺炎鏈球菌檢出率明顯增高[14-15]。endprint

奈瑟菌屬包括腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、干燥奈瑟菌、微黃奈瑟菌、淺黃奈瑟菌、黏液奈瑟菌等。易旭等[16]的研究表明，奈瑟菌在抗菌藥物治療過(guò)程中被篩選，從而成為患者呼吸道感染的主要致病菌。

乳酸桿菌是一群生活在機(jī)體內(nèi)益于宿主健康的微生物，它維護(hù)人體健康和調(diào)節(jié)免疫功能的作用已被廣泛認(rèn)可。該類細(xì)菌絕大多數(shù)對(duì)動(dòng)物和人無(wú)毒、無(wú)害，負(fù)擔(dān)著動(dòng)物體內(nèi)重要的生理功能。

玉屏風(fēng)散由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)組成。黃芪多糖是黃芪的主要生物活性成分，其對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)菌和綠膿桿制有抑菌作用[17]。白術(shù)、防風(fēng)具有抑制星形奴卡菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌等的作用[18-19]。四物湯包括熟地、當(dāng)歸、川芎、白芍，全方及組方對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌均有較強(qiáng)的抑制作用[20]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、腸桿菌、鏈球菌、奈瑟菌的含量均顯著升高，而乳酸桿菌含量顯著降低，說(shuō)明在COPD狀態(tài)下發(fā)生了一定程度的菌群紊亂，應(yīng)用玉屏風(fēng)散合四物湯干預(yù)后能有效降低6種細(xì)菌的含量，對(duì)乳酸桿菌則有升高作用，說(shuō)明此方減輕了這6種病原菌的定植程度，并提升了益生菌的含量，使之能發(fā)揮拮抗病原微生物、調(diào)節(jié)免疫等益生性能，這可能是其治療COPD的作用機(jī)制之一。

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（收稿日期：2017-09-15 本文編輯：李岳澤）endprint