白斑綜合征病毒膠體金免疫層析試劑板的研制

劉長軍 ，王振國 ，陳青舟 ，夏武強 ，繆翁晟途 ，平夏婷

（1.象山縣海洋與漁業(yè)質(zhì)量技術(shù)檢測中心，浙江 寧波 315700；2.杭州南開日新生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 311215）

白斑綜合征病毒膠體金免疫層析試劑板的研制

劉長軍1，王振國2，陳青舟2，夏武強1，繆翁晟途2，平夏婷2

（1.象山縣海洋與漁業(yè)質(zhì)量技術(shù)檢測中心，浙江 寧波 315700；2.杭州南開日新生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 311215）

將膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)用于對蝦白斑綜合征的診斷，研制了一種檢測對蝦中白斑綜合征病毒的膠體金免疫層析試劑板。將膠體金標記的抗白斑綜合征病毒單克隆抗體包被在金標墊上，將抗白斑綜合征病毒多克隆抗體和羊抗鼠IgG分別包被在硝酸纖維素膜的檢測線和質(zhì)控線上。通過雙抗體夾心法檢測樣品中白斑綜合征病毒含量。結(jié)果表明，該試劑板對白斑綜合征病毒的最低檢出限為1.0 mg/kg，特異性好，穩(wěn)定性高，整個檢測所需時間為8～10 min，適合現(xiàn)場快速檢測。

白斑綜合征病毒；雙抗體夾心法；免疫層析；膠體金

白斑綜合征（White Spot Syndrome，簡稱 WSS）是由白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virum，簡稱WSSV）引起的一種對蝦嚴重傳染性疾病，典型癥狀為病蝦頭胸甲內(nèi)側(cè)出現(xiàn)不同大小的白色斑點。該病發(fā)病快、病死率高、傳播速度快、宿主范圍廣，對對蝦養(yǎng)殖造成了嚴重的經(jīng)濟損失[1]。WSS還被列入了世界動物衛(wèi)生組織（OIE）水生動物疫病名錄[2]。在2008年我國農(nóng)業(yè)部第1125號公告《一、二、三類動物疫病病種名錄》中，WSS被劃為一類動物疫病[3]。

目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療WSS的方法，因此發(fā)展快速、靈敏、穩(wěn)定的WSSV檢測技術(shù)成為科研人員研究的重點。通過有效的檢測技術(shù)，對蝦養(yǎng)殖戶可盡早采取預(yù)防措施，切斷傳播途徑，最大限度地減少生產(chǎn)上的損失。近年來，WSSV檢測的方法發(fā)展迅速，主要有：肉眼觀察法，電鏡觀察法，生化檢測、免疫學(xué)方法，細胞培養(yǎng)法，分子生物學(xué)法等。Numan等[4]采用巢式PCR進行WSSV的引物設(shè)計，實驗結(jié)果與實時熒光定量PCR相比靈敏度得到較大的提高，檢出限為1拷貝的WSSV。鄭曉聰?shù)萚5]選用抗WSSV單克隆抗體包被ELISA板，用兔多抗作為捕獲抗體，建立了具有良好特異性和敏感性的雙抗體夾心法用于WSSV的檢測。張玲[6]研發(fā)的白斑綜合征病毒膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙條將不同類型的WSSV單克隆抗體混合后包被于試紙條檢測線，用來檢測樣本中的WSSV，實驗結(jié)果表明該試紙條在WSSV濃度為783 ng/mL～6.26μg/mL范圍內(nèi)可實現(xiàn)半定量檢測。研究采用WSSV制備單克隆抗體與多克隆抗體，成功建立了檢測WSSV的雙抗體夾心法膠體金免疫層析試劑板。相比于現(xiàn)有的檢測方法，即簡化了操作流程，又縮短了檢測時間，適用于快速現(xiàn)場檢測。對實現(xiàn)病原的快速篩查，病情的防治有很大的促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料

對蝦白斑綜合征病毒（WSSV），傳染性肌肉壞死病毒（Infection Myonecrosis Virus，IMNV）、桃拉綜合征病毒（Taura Syndrome Virus，TSV）、鯉春血癥病毒（Spring Viraemia of Cup Virus，SVCV）、病毒性出血性敗血癥病毒（Viral Haemorrhagic Septicaemia Virus，VHSV）均由本實驗室分離、鑒定、保存。家兔、BALB/c小鼠、ICR小鼠購自浙江大學(xué)動物實驗中心。小鼠骨髓瘤細胞SP2/0由本實驗室保存。健康對蝦，10～20 g/尾，購于農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.1 試劑

氯金酸 （HAuCl4·4H2O）、聚乙二醇 20000（PEG20000）、聚乙二醇 40000（PEG40000）和羊抗鼠IgG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購于Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、HAT和HT選擇性培養(yǎng)基購于HyClone公司；硝酸纖維素膜（NC）、膠體金結(jié)合墊、樣品墊、吸水墊購于Millipore公司。白斑綜合征病毒ELISA試劑盒購于北京綠源伯德生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器

BioJet XYZ3000型點膜儀購于美國BioDot公司、Avanti J－26 XP高速冷凍離心機購于美國Beckman公司、恒溫鼓風(fēng)干燥箱購于上海精宏實業(yè)設(shè)備有限公司、切割機購于杭州市恒通設(shè)備有限公司、78HW－1恒溫磁力攪拌器購于杭州儀表電機有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗WSSV單克隆抗體制備

1.2.1.1 動物免疫 取適量WSSV與弗氏完全佐劑等量混合乳化，皮下注射BALB/c小鼠（抗原蛋白量為100μg/只）。初次免疫兩周后，WSSV與弗氏不完全佐劑混合乳化免疫BALB/c小鼠，免疫方法同上。之后免疫不再加佐劑，分別在第6周及融合前3 d腹腔再加強免疫一次。

1.2.1.2 細胞融合 先將免疫小鼠的脾細胞與SP2/0混合于融合管內(nèi)，1 000 r/min下離心10 min，除去上清液，底層細胞輕振松散后再置于37℃水浴中預(yù)熱。再向細胞邊緩慢滴加已預(yù)熱的PEG4000溶液1 mL邊進行攪拌，然后緩慢加入不完全DMEM培養(yǎng)基，終止融合。靜置10 min后1 000 r/min下離心10 min，除去上清液，然后加入HAT培養(yǎng)基，使細胞懸浮并混勻。加入預(yù)先制備的ICR小鼠的腹腔巨噬細胞，充分混勻后分裝至96孔細胞培養(yǎng)板。于6%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至第4～5天每孔各補加1滴HAT培養(yǎng)基，至第9～10天用HT培養(yǎng)基取代HAT培養(yǎng)基，上清液變黃后開始檢測篩選。

1.2.1.3 陽性克隆的篩選及建株 用ELISA試劑盒檢測細胞上清液中的抗WSSV抗體。按常規(guī)方法進行，將實驗結(jié)果為陽性的細胞擴大培養(yǎng)并及時凍存，同時按有限稀釋法進行亞克隆2～3次，直至每孔的陽性率為100%時才可定株[8]。

1.2.1.4 腹水的制備及純化 抗WSSV單克隆抗體細胞株復(fù)蘇并將其轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至2×107注入小鼠腹腔內(nèi)（提前一周每只BALB/c健康小鼠腹腔內(nèi)注射0.5 mL無菌液體石蠟），10～12 d小鼠出現(xiàn)腹部明顯膨大，處死小鼠收集腹水。用60 mM pH 4.2的醋酸鹽緩沖液4倍稀釋，加腹水體積1/10的辛酸，攪拌30 min。12 000 r/min離心20 min取上清液。用1N NaOH調(diào)節(jié)上清液pH值至7.2，加硫酸銨至33%飽和度，12 000 r/min離心20 min，沉淀溶解于0.01 M pH值為7.2的PBS緩沖液中。最后透析除鹽得到抗WSSV單克隆抗體，置－80℃?zhèn)溆肹9]。

1.2.2 WSSV多克隆抗體的制備 采用常量免疫法。調(diào)整WSSV的蛋白濃度，免疫量為1 mg/只，采用相應(yīng)程序共免疫6次。初次免疫后每隔2周加強免疫一次。最后一次免疫后2周，耳靜脈采血，分離血清，用ELISA試劑盒檢測抗體效價。效價達1∶5 000以上時，通過頸動脈放血，收集全血，分離血清。用辛酸－飽和硫酸銨法提取IgG，得到抗WSSV多克隆抗體，置－80℃?zhèn)溆肹5]。

1.2.3 金標抗體的制備

1.2.3.1 膠體金的制備 將實驗需要的所有玻璃器皿清洗干凈。先用自來水清洗干凈，然后在重鉻酸鉀洗液中浸泡過夜，最后依次使用自來水、蒸餾水、超純水沖洗5次。在56℃烘箱中烘干備用。取0.01%氯金酸溶液100 mL加熱2 min至沸騰，邊攪拌邊加入1%檸檬酸三鈉水溶液1 mL，繼續(xù)煮沸10 min至酒紅色后冷卻，加蒸餾水恢復(fù)到原體積，冷卻后用0.22μm濾膜過濾雜質(zhì)，4℃保存?zhèn)溆肹10]。

1.2.3.2 膠體金標記單克隆抗體 取已制備好的膠體金溶液100 mL，用0.1 mol/L的K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0。邊攪拌邊添加抗WSSV單克隆抗體直至膠體金溶液恢復(fù)酒紅色，并在10 min內(nèi)不褪色。共加入抗WSSV單克隆抗體1.5 mg。磁力攪拌器上攪拌20 min，再逐滴加入2 mL 25 g/L PEG20000，攪拌15 min。20 000 r/min離心15 min，除去上清液，用10 mL pH值7.4的PBS緩沖液（含0.4 g/L PEG20000）清洗2次。將沉淀物用5 mL含質(zhì)量濃度為20 g/L BSA的PBS緩沖液（pH值7.4）溶解，過0.22μm無菌過濾器，4℃保存?zhèn)溆肹12]。

1.2.4 試劑板的組裝

將樣品墊（玻璃纖維）用含2%BSA、2.5%蔗糖、1%吐溫－20、0.3%PVP－k30 以及 0.02%NaN3的0.002 mol/L的硼酸溶液緩沖液（pH值7.4）封閉，于37℃溫箱中干燥[11]。用點膜儀將制備好的金標抗體噴涂到玻璃纖維上，噴膜量為1μL/cm。立即放入冷凍真空干燥機中抽干?？筗SSV多克隆抗體和羊抗鼠IgG用 0.01 mol/L PBS（pH 值 7.2）稀釋至 2 mg/mL，用點膜儀分別噴涂在NC膜上作為檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線），噴膜量為1μL/cm。樣品墊、金標結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊按順序黏貼于PVC背襯上。用切割機將貼好的板切割成4 mm寬的細條，裝入塑料模板中制成檢測試劑板，然后放入帶干燥劑的鋁箔袋中密封。試劑板組成如圖1所示。

圖1 膠體金免疫層析試紙條組成

1.2.5 樣品檢測操作

取出檢測試劑板，用滴管吸取待檢樣品溶液，滴加2滴于加樣孔中，加樣后開始計時：結(jié)果應(yīng)在3～5 min讀取，其他時間判讀無效；讀取結(jié)果。若試劑板上T線與C線均顯色，結(jié)果為陽性；若試劑板僅C線出現(xiàn)紫紅色而T線未顯色，結(jié)果為陰性；若試劑板上C線與T線均為顯色，結(jié)果無效，需要重新檢測。檢測結(jié)果如圖2所示。

圖2 檢測結(jié)果示意圖

1.2.6 檢出限檢測

稱取健康對蝦（PCR檢測無WSSV感染）的蝦鰓 2 g，加入 WSSV 溶液至終濃度為 0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、4.0 mg/kg，再加入 0.01 M PBS 按 1 ∶10（W/V）的比例混合，加少量石英砂用研缽研磨、勻漿1 min，再沉淀5～10 min，取上清液作為加標檢測樣品，用1.2.4制備的試劑板分別對其進行檢測，陰性對照為0.01 mol/L PBS溶液。每組設(shè)6個平行樣。

1.2.7 特異性檢測

按照上述方法將 IMNV、TSV、SVCV、VHSV 四種病毒加入健康對蝦的蝦鰓中配置成加標檢測樣品，陽性對照為WSSV加標檢測樣品，濃度均與1.2.6測定的檢出限相同。陰性對照為0.01 mol/L PBS溶液。用1.2.4制備的試劑板分別對其進行檢測，每組設(shè)6個平行樣。

1.2.8 試劑板檢測與ELISA的符合率

取健康對蝦蝦鰓樣本20份，其中10份加入WSSV制成陽性樣本，另外10份加入0.01 mol/L PBS溶液制成陰性樣本。分別使用ELISA試劑盒及試劑板檢測WSSV的含量比較兩者的符合率。

1.2.9 穩(wěn)定性檢測

取3個不同批次的試紙條在20～25℃條件下連續(xù)放置 12 個月，期間于生產(chǎn)當天、1、2、3、6、9、12個月分別從3個批次產(chǎn)品中抽取檢測試劑卡檢測陽性和陰性樣品各50份，測定檢出限、假陽性率和假陰性率。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢出限

將陰性對照以及WSSV終濃度為0.25、0.50、0.75、1.0、2.0、4.0 mg/kg 的加標檢測樣品，用試劑板進行測定。每個試樣做6個重復(fù)，3～5 min后觀察結(jié)果，檢測線顏色呈梯度遞增，實驗結(jié)果如圖3所示。在陰性對照及WSSV終濃度為0.25、0.50 mg/mL范圍內(nèi)，C線顯色而T線不顯色；0.75 mg/mL濃度下C線顯色，T線條帶模糊；1.0～4.0 mg/kg范圍內(nèi)T線與C線顯紫紅色，條帶清晰。實驗結(jié)果表明，該試劑板的WSSV檢測限為1.0 mg/kg。

圖3 膠體金試劑板的檢出限實驗結(jié)果

2.2 特異性

將 IMNV、TSV、SVCV、VHSV 四種病毒加入健康對蝦的蝦鰓中配置成1.0 mg/kg加標檢測樣品，用試劑板進行測定，判斷其檢測的特異性情況。其中陽性對照為終濃度為1.0 mg/kg的WSSV加標檢測樣品，陰性對照為0.01 mol/L PBS溶液。實驗結(jié)果如表1所示。試劑板對IMNV、TSV、SVCV、VHSV四種病毒反應(yīng)呈陰性，實驗結(jié)果表明試劑板對WSSV具有較高的特異性。

表1 膠體金試劑板特異性實驗結(jié)果

2.3 符合率

用試劑板對含不同質(zhì)量濃度的WSSV蝦鰓處理樣品進行檢測并與ELISA的檢測結(jié)果相比較。共檢測20份樣品，其中陰性樣品10份，陽性樣品10份，部分樣品檢測結(jié)果如表2所示：在WSSV濃度高于1.0 mg/kg時，試劑板的實驗結(jié)果為陽性；在WSSV濃度低于1.0 mg/kg時，試劑板實驗結(jié)果為陰性，均與ELISA實驗結(jié)果相符。所以該試劑板的定量檢測限為1.0 mg/kg。

2.4 試紙條穩(wěn)定性

用同一批次不同檢測試劑檢測同一樣品，用不同批次檢測試劑檢測同一樣品，其質(zhì)控線、檢測線的顯色時間及顏色深淺和最終結(jié)果判斷基本相同。將3個不同批次的試劑板在20～25℃條件下連續(xù)放置 12 個月，期間于生產(chǎn)當天、1、2、3、6、9、12 個月分別從3個批次產(chǎn)品中抽取檢測試劑卡檢測陽性和陰性樣品各50份，測定檢出限、假陽性率和假陰性率。實驗結(jié)果如表3所示。在12個月之內(nèi)，試劑板的檢出限未發(fā)生變化，假陽性率和假陰性率在4%以下，為可接受范圍。因此試劑板能在室溫條件下（20～25℃）保存12個月。

3 結(jié)論與展望

試劑板用于對蝦蝦鰓中WSSV的檢測，靈敏度為1.0 mg/kg。具有特異性高、穩(wěn)定性好、檢測時間短、操作簡便等特點?？捎糜趯ξr中WSSV的現(xiàn)場快速檢測，為WSSV的預(yù)防和診斷提供依據(jù)。

表2 膠體金免疫層析試劑板與ELISA檢測結(jié)果比較

表3 膠體金免疫層析試劑板的穩(wěn)定性試驗結(jié)果

試劑板的制備基于雙抗體夾心原理。金標結(jié)合墊上包被的抗WSSV單克隆抗體與T線上包被的抗WSSV多克隆抗體將樣本中的WSSV分別進行固定和截留，最終以T線與C線均顯色作為WSSV存在的判別標準?？筗SSV單克隆抗體與抗WSSV多克隆抗體的分離純化直接影響到最終產(chǎn)品的靈敏度，過柱是提高抗體純度的方法之一。谷萬港[13]在硫酸銨沉淀法的基礎(chǔ)上增加親和層析能親和柱進行抗VP28單克隆抗體（抗WSSV單克隆抗體的一種類型）的純化，但該方法會存在抗體消耗量大的問題，因此大批量制備時要考慮到其中的損益。在膠體金標記單克隆抗體的過程中，膠體金的顆粒大小和標記過程的pH值等均會對金標抗體的質(zhì)量造成影響。本實驗中采用的膠體金制備方法使膠體金顆粒直徑在40μm，對于其抗體吸附能力和穩(wěn)定性均能適應(yīng)檢測的需要。為使膠體金pH值等于單克隆抗體等電點pH值，使膠體金與單克隆抗體結(jié)合最緊密，形成的金標抗體最穩(wěn)定，本實驗用0.1 mol/L的K2CO3溶液精確地找到膠體金標記單克隆抗體的最佳pH值。但本實驗的適用對象固定在經(jīng)濟作物對蝦，這就意味著對于其他宿主如蟹類、橈足生物等無法做到WSSV的準確檢測。因此在檢出限的設(shè)置方面可以再進行其他樣本的實驗，從而推廣其應(yīng)用范圍。

目前，膠體金免疫層析技術(shù)在毒素檢測、抗生素檢測、重金屬檢測、微生物檢測、病毒檢測等領(lǐng)域都有應(yīng)用。定性檢測向定量檢測的轉(zhuǎn)化，檢測儀器的跟進加快了膠體金快速檢測試劑的發(fā)展。操作方便、靈敏、快速等現(xiàn)場檢測方面的優(yōu)點和低成本的特定優(yōu)勢使其具有商業(yè)化的發(fā)展前景。

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廣東湛江出口中國2017年首批輸澳生蝦

廣東湛江檢驗檢疫局2017年9月11日向媒體通報，中國2017年首批出口澳大利亞生蝦經(jīng)湛江檢驗檢疫局檢驗合格后，目前正由湛江港裝船運往澳大利亞。

據(jù)了解，該批生蝦產(chǎn)品共6個貨柜，由廣東國美水產(chǎn)食品有限公司生產(chǎn)，重量97.64 t，貨值190.25萬美元。

湛江是中國水產(chǎn)品養(yǎng)殖、加工和出口大市，水產(chǎn)業(yè)形成了完整的產(chǎn)業(yè)鏈，并代表中國先后通過了美國、歐盟、韓國、日本、俄羅斯等國家和地區(qū)的水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控體系的考察評估，當?shù)仞B(yǎng)殖的生蝦、活魚也實現(xiàn)了中國內(nèi)地首次直供香港。

據(jù)介紹，2017年1月初，澳大利亞因國內(nèi)發(fā)生白斑病綜合征病毒（WSSV）暫停各國生蝦進口，給包括湛江在內(nèi)的中國水產(chǎn)品出口企業(yè)帶來嚴重損失，產(chǎn)業(yè)發(fā)展面臨困境。

為扭轉(zhuǎn)不利局面，湛江檢驗檢疫局主動應(yīng)對，加強轄區(qū)養(yǎng)殖場疫病監(jiān)測，提升產(chǎn)品質(zhì)量，增強湛江水產(chǎn)品國際競爭力，并協(xié)助做好與澳方的溝通交涉，推動禁令解除。

（www.bbwfish.com）

Development of coloidal gold immunochromatographic plate for white spot syndrome virum

Liu Changjun1,Wang Zhenguo2,Chen Qingzhou2,Xia Wuqiang1,Miaoweng Shengtu2,Ping Xiating2
（1.Xiangshan Ocean and Fishery Quality and Technical Testing Center，Ningbo 315700，China；2.Hangzhou Nankai Biotech Co.，Ltd.，Hangzhou 311215，China）

A coloidal gold immunochromatographic plate for white spot syndrome virum in shrimp was developed.The colloidal gold conjugate pad combined anti－white spot syndrome virus monoclonal antibody.The anti－white spot syndrome virus polyclonal antibody and goat anti－mouse IgG were coated on test line and control line，respectively.White spot syndrome virum could be detected by this plate through double antibody sandwich method.The results of this paper showed that detection limit of the plate was 1.0 mg/kg，the specificity and the stability of the plate were high，and the results could be known just in 8～10 min.This plate was suitable for rapid detection in outdoors.

white spot syndrome virum；double antibody sandwich method；immunochromatographic；coloidal gold

S917

A

1004－2091（2017）10－0001－06

10.3969/j.issn.1004－2091.2017.10.001

杭州市科技發(fā)展計劃（20150432B34）

劉長軍（1978－），男，高級工程師，研究方向為生物檢測技術(shù).E－mai:xs65763110@126.com

2017－01－09）